1、中国组织工程研究 第 17 卷 第 49 期 20131203 出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research December 3, 2013 Vol.17, No.49doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.49.007 http:/www.crter.org李斯翰，段建民，李洪涛，文军 . 改良富血小板血浆对骨髓间充质干细胞增殖与免疫原性的作用 J.中国组织工程研究， 2013， 17(49):8505-8511.ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 8505www
2、.CRTER.org李斯翰，女，1987 年生，广东省汕头市人，汉 族，南方医科大学在读硕士，主要从事牙体牙髓专业研究。通讯作者：段建民，博士，主任医师，硕士研究生 导师，解放军广州军区广州总医院口腔科，广东 省广州市 中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2013)49-08505-07修回日期：2013-09-25(201305023/DW)Li Si-han, Studying for masters degree, Graduate School, Southern Medical University, Guangzhou 510000, Guangd
3、ong Province, CCorresponding author: Duan Jian-min, M.D., Chief physician, Masters supervisor, Department of Stomatology, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Region, Guangzhou 510000, Guangdong Province, CAccepted: 2013-09-25改良富血小板血浆对骨髓间充质干细胞增殖与免疫原性的作用 *李斯翰 1，2 ，段建民 2，李洪涛 2，文 军 2(1南方医科大
4、学研究生学院，广 东省广州市 510000；2解放军广州军区广州总医院口腔科，广东省广州市 510000)文章亮点：1 实验特点在于采用液氮反复冻融的方法激活血浆中血小板颗粒裂解释放生长因子，相比较加入外源性物质( 氯化钙、人或牛凝血酶 )的激活方式，可以减少外源性物质所带来的潜在感染风险。2 从组织工程的安全性考虑，采用自体来源生长因子对间充质干细胞进行体外培养可以最大限度减少外源性血清的使用，为体外培养细胞提供了更为安全且接近机体的培养环境。关键词：干细胞；骨髓干细胞；骨髓间充质干细胞；富血小板血浆；骨髓血；增殖；免疫原性；生长因子；细胞移植；省级基金；干细胞图片文章主题词：间质干细胞；骨
5、髓；富血小板血浆；细胞移植基金资助：广东省科技计划项目(2011B031800201)*，课题名称：改良富血小板血浆对骨髓间充质干细胞与乳牙髓干细胞体外扩增及成骨分化作用的对比实验研究摘要背景：课题组前期实验发现改良富血小板血浆对人牙髓细胞增殖的促进作用具有浓度依赖性，以 10%浓度尤为明显。目的：观察不同浓度改良富血小板血浆对人骨髓间充质干细胞体外生长增殖的作用效果，以及最佳浓度改良富血小板血浆对骨髓间充质干细胞免疫原性的影响。方法：使用健康志愿者捐献骨髓血培养的第三四代人骨髓间充质干细胞，行流式细胞术及成脂、矿化诱导分化鉴定。将由同一志愿者采集的静脉血制备的改良富血小板血浆作用于人骨髓间充
6、质干细胞，以 CCK-8 法测定细胞增殖变化，绘制生长曲线。选取最适合人骨髓间充质干细胞增殖的改良富血小板血浆浓度，以体积分数 10%FBS 培养基为对照，通过流式细胞术测定连续培养 3 代的人骨髓间充质干细胞表面 Stro-1 的表达率。结果与结论：5%-10%的改良富血小板血浆在培养第 6，8 天均显著促进了骨髓间充质干细胞的增殖，其中以 10%浓度组尤为显著在培养第 10 天仍显著促进了骨髓间充质干细胞的增殖且细胞表面 Stro-1 的表达率连续 3 代均高于对照组。说明改良富血小板血浆对人骨髓间充质干细胞增殖的促进作用具有浓度依赖性，10%改良富血小板血浆可以较好地保持人骨髓间充质干细
7、胞的免疫原性。Improved platelet-rich plasma effects on the proliferation and immunogenicity of human bone marrow mesenchymal stem cells Li Si-han1, 2, Duan Jian-min2, Li Hong-tao2, Wen Jun2 (1Graduate School, Southern Medical University, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China; 2Department of Stomatolo
8、gy, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Region, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China)AbstractBACKGROUND: Previous experiments have shown that improved platelet-rich plasma can promote the proliferation of human dental pulp cells in a concentration-dependent manner, particularly w
9、hen the concentration is 10%.OBJECTIVE: To investigate the effect of platelet-rich plasma at different concentrations on the proliferation and immunogenicity of human bone marrow mesenchymal stem cells.METHODS: Human bone marrow mesenchymal stem cells from healthy donors were cultured and passaged f
10、or 3-4 passages, identified by flow cytometry and differentiation inductions. Platelet-rich plasma samples which were manufactured from the venous blood of the same donor were used for culturing human bone marrow mesenchymal stem cells. The proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells w
11、as measured by cell counting kit-8 method and the growth curves were drawn. The most suitable concentration of platelet-rich plasma was selected to culture human bone marrow mesenchymal stem cells for three generations and the Stro-1 expression rate on the 李斯翰，等 . 改良富血小板血浆对骨髓间充质干细胞增殖与免疫原性的作用P.O. Box
12、 1200, Shenyang 110004 www.CRTER.org8506www.CRTER.orgsurface of human bone marrow mesenchymal stem cells was determined through flow cytometry.RESULTS AND CONCLUSION: Platelet-rich plasma at the concentration of 5%-10% evidently promoted the proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells
13、on the 6th and 8th days. The most effective concentration to promote the proliferation was 10%. Platelet-rich plasma at the concentration of 10% still promoted the proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells on the 10th day, and maintained a better immunogenicity of human bone marrow m
14、esenchymal stem cells compared to the control group. These findings indicate that platelet-rich plasma can promote the proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells in a concentration-dependent manner, and 10% platelet-rich plasma is better to maintain the immunogenicity of human bone ma
15、rrow mesenchymal stem cells.Subject headings: mesenchymal stem cells; bone marrow; platelet-rich plasma; cell transplantationFunding: the Science and Technology Plan Project of Guangdong Province, No. 2011B031800201*Li SH, Duan JM, Li HT, Wen J. Improved platelet-rich plasma effects on the prolifera
16、tion and immunogenicity of human bone marrow mesenchymal stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2013;17(49):8505-8511.0 引言 Introduction因人体血小板中含有大量的生长因子，故富血小板血浆已被广泛应用于软、硬组织再生的基础研究领域，以及创伤修复、牙周组织再生和牙种植体骨愈合等临床治疗领域 1-2。前期实验研究观察了液氮反复冻融激活的富血小板血浆(简称改良富血小板血浆)对体外培养的人牙髓细胞具有促进增殖和矿化的作用，且其促进作用具有浓度依赖性 3。实 验
17、进 一 步 观 察 改 良 富 血 小 板 血 浆 对 人 骨 髓 间 充质 干 细 胞 生 长 增 殖 的 作 用 效 果 ， 明 确 改 良 富 血 小 板 血浆 对 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 的 作 用 是 否 仍 具 有 浓 度 依 赖 性以 及 细 胞 特 异 性 。 并 选 取 最 佳 的 富 血 小 板 血 浆 浓 度 连续 培 养 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 ， 通 过 检 测 细 胞 表 面 Stro-1表 达 ， 初 步 探 讨 改 良 富 血 小 板 血 浆 培 养 对 细 胞 免 疫 原性 的 影 响 。1 材料和方法 Materials and method
18、s设计：完全随机设计的细胞学实验。时间及地点：实验于2012年9月至2013年2月在解放军广州军区广州总医院医学实验科完成。材料：骨髓血来源：男性志愿者，27岁，平素身体健康，无全身系统性疾病，无家族遗传病史，血常规检查正常。志愿者对实验知情同意，实验符合医学伦理学标准。改良富血小板血浆对细胞免疫原性影响实验用主要试剂及仪器：实验方法：改 良 富 血 小 板 血 浆 的 制 备 ： 按 本 科 曾 报 道 的 方 法 从 提供 骨 髓 的 志 愿 者 肘 静 脉 采 集 静 脉 血 制 备 富 血 小 板 血 浆 4。全 血细胞分析仪进行血小板计数后，按终浓度 2 U/mL加入肝素钠抗凝。将富
19、血小板血浆分装入冻存管内，液氮反复冻融 3 次，将激活后的富血小板血浆 3 500g 离心 25 min，然后吸取上清液过滤用于实验。人 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 的 培 养 ： 无菌条件下抽取健康志愿者 骨 髓 血 5 mL(预 先 于 注 射 器 中 加 入 肝 素 并 调 整 终浓 度 至 3 000 U/mL)， 密 度 梯 度 离 心 法 分 离 骨 髓 间 充质 干 细 胞 ， 于 37 ， 体 积 分 数 5% CO2 孵 箱 孵 育 48 h 后 换 液 ， 待 细 胞 汇 合 至 瓶 底 80%时 传 代 ， 连 续 3 代传 代 纯 化 培 养 5。 将培养的第三、四
20、代细胞用于实验。人骨髓间充质干细胞的鉴定：以 1105/孔的密度将细胞接种于 6 孔板中，待细胞进入对数生长期后弃原培养液，PBS 洗 3 遍，分别换为成脂诱导液 (含体积分数10%胎牛血清，10 -8 mol/L 地塞米松，10 -4 mol/L 吲哚美辛，10 mg/L 胰岛素，50 mmol/L IBMX 的 -MEN)和成骨诱导液(含体积分数 10%胎牛血清，10 -8 mol/L地塞米松，10 mmol/L -甘油磷酸钠， 50 g/L L-抗坏血酸的 -MEN)6，无 矿 化 、 成 脂 诱 导 成 分 的 含 体 积 分数 为 10%胎 牛 血 清 的 -MEN 作 为 空 白
21、对 照 ， 每 3 d 换液 1 次 ， 于 诱 导 第 14， 21 天 分 别 进 行 油 红 O 染 色 和 茜素 红 染 色 7-8。将浓度为 109 L-1 的人骨髓间充质干细胞悬液 1 mL送至广州军区总医院血液科细胞中心行流式细胞术检测细胞表面抗原 CD44、CD105、CD34 9。CCK-8 法测定人骨髓间充质干细胞生长曲线：取生长良好的人骨髓间充质干细胞，消化、计数，稀释成浓度为 1107 L-1 的细胞悬液，按 100 L/孔接种至 96 孔板。细胞培养箱内培养 24 h 后吸弃培养液， PBS 洗 3试剂及仪器 来源-MEN培养液CCK-8Stro-1 抗体CO2 孵箱
22、、低温离心机全血细胞分析仪酶标仪倒置显微镜Gibco，美国同仁，日本R10(1):23.2 Chi NH, Yang MC, Chung TW, et al. Cardiac repair achieved by bone marrow mesenchymal stem cells/silk fibroin/hyaluronic acid patches in a rat of myocardial infarction model. Biomaterials. 2012;33(22):5541-5551.3 李洪涛,段建民,片山直. 富血小板血浆与洗涤血小板对人牙髓细胞矿化的作用J.中国组织
23、工程研究,2012,16(7):1206-1210.4 李洪涛,段建民,张宏斌,等.液氮冻融洗涤血小板对人牙髓细胞增殖的影响J.牙体牙髓牙周病学杂志,2010,20(6):314-316.5 Neurogenic potential of human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow, adipose tissue and endometrium: a comparative study. Tsitologiia, Tsitologiia. 2013;55(2): 101-110.6 Ng F, Boucher S, Koh S,
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