免疫比浊法测C反应蛋白.doc

1、免 疫 比 浊 法 是 抗 原 抗 体 结 合 动 态 测 定 方 法 。 其 基 本 原 理 是 ： 当 抗 原 与 抗 体 在特 殊 稀 释 系 统 中 反 应 而 且 比 例 合 适 (一 般 规 定 抗 体 过 量 )时 ， 形 成 的 可 溶 性 免疫 复 合 物 在 稀 释 系 统 中 的 促 聚 剂 （ 聚 乙 二 醇 等 ） 的 作 用 下 ， 自 液 相 析 出 ， 形成 微 粒 ， 使 反 应 液 出 现 浊 度 。 当 抗 体 浓 度 固 定 时 ， 形 成 的 免 疫 复 合 物 的 量 随着 检 样 中 抗 原 量 的 增 加 而 增 加 ， 反 应 液 的 浊 度

2、也 随 之 增 加 。 通 过 测 定 反 应 液的 浊 度 与 一 系 列 标 准 品 对 照 ， 即 可 计 算 出 检 样 中 抗 原 的 含 量 。抗 体 （ Ab） 与 可 溶 性 抗 原 （ Ag） 反 应 ， 形 成 一 定 结 构 的 免 疫 复 合 物 ， 成 为 悬浮 于 反 应 溶 液 中 的 微 粒 。 在 沉 淀 反 应 中 形 成 的 复 合 物 微 粒 具 有 特 殊 的 光 学 性质 ， 可 用 仪 器 检 测 ， 提 高 了 检 测 的 速 度 、 灵 敏 度 和 易 操 作 性 。 免 疫 比 浊 测 定 注 意 事 项 ： 1、 抗 原 或 抗 体 量 大

3、 大 过 剩 ， 可 出 现 可 溶 性 复 合 物 ， 造 成 误 差 。 2、 应 维 持 反 应 管 中 抗 体 蛋 白 始 终 过 剩 。 3、 易 受 到 脂 血 的 影 响 。分 类1.免 疫 透 射 比 浊 法 抗 原 抗 体 结 合 后 ， 形 成 免 疫 复 合 物 ， 在 一 定 时 间 内复 合 物 聚 合 出 现 浊 度 。 当 光 线 通 过 溶 液 时 ， 可 被 免 疫 复 合 物 吸 收 。 免 疫 复 合物 量 越 多 ， 光 线 吸 收 越 多 。 光 线 被 吸 收 的 量 在 一 定 范 围 内 与 免 疫 复 合 物 的 量成 正 比 。 利 用 比

4、浊 计 测 定 光 密 度 值 ， 复 合 物 的 含 量 与 光 密 度 值 成 正 比 ， 同 样当 抗 体 量 一 定 时 ， 光 密 度 值 也 与 抗 原 含 量 成 正 比 。 本 法 较 单 向 琼 脂 扩 散 试 验和 火 箭 电 泳 等 一 般 免 疫 化 学 定 量 方 法 敏 感 、 快 速 简 便 ， 但 要 求 免 疫 复 合 物 的数 量 和 分 子 量 达 到 一 定 高 度 ， 否 则 就 难 以 测 出 。 2.免 疫 散 射 比 浊 法 一 定 波 长 的 光 沿 水 平 轴 照 射 ， 通 过 溶 液 使 遇 到 抗 原抗 体 复 合 物 粒 子 ， 光

5、线 被 粒 子 颗 粒 折 射 ， 发 生 偏 转 ， 光 线 偏 转 的 角 度 与 发 射光 的 波 长 和 抗 原 抗 体 复 合 物 颗 粒 大 小 和 多 少 密 切 相 关 。 散 射 光 的 强 度 与 复 合物 的 含 量 成 正 比 ， 即 待 测 抗 原 越 多 ， 形 成 的 复 合 物 也 越 多 ， 散 射 光 也 越 强 。散 射 光 的 强 度 还 与 各 种 物 理 因 素 ， 如 加 入 抗 原 或 抗 体 的 时 间 、 光 源 的 强 弱 和波 长 、 测 量 角 度 等 密 切 相 关 。 散 射 比 浊 法 又 分 为 速 率 散 射 比 浊 法 和

6、终 点 散 射比 浊 法 。 3.免 疫 胶 乳 比 浊 法 胶 乳 比 浊 法 即 是 将 待 测 物 质 相 对 应 的 抗 体 包 被 在 直径 为 15 60nm 的 胶 乳 颗 粒 上 ， 使 抗 原 抗 体 结 合 物 的 体 积 增 大 ， 光 通 过 之 后 ，透 射 光 和 散 射 光 的 强 度 变 化 更 为 显 著 ， 从 而 提 高 试 验 的 敏 感 性 。实验八 免疫比浊法测定 C-反应蛋白【原理】血清 C 反应蛋白（CRP）与试剂中抗人 CRP 抗体结合，形成免疫复合物，一起吸光度增加，在波长 340nm 和 700nm 处测定免疫复合物浊度。根据吸光度增加量，

7、即可定量检测血清中 CRP 的含量。【试剂】10.1 mol/L 的 Tris 缓冲液。2羊抗人 CRP 抗血清。3CRP 定标液。【操作步骤】 见表 8-1。表 8-1 免疫比浊法测定 C 反应蛋白操作步骤加入物 空白管 标准管 测定管血清标本(l) 15CRP 定标液(l) 15 生理盐水(l) 15 缓冲液(l) 350 350 350混合，于 37保温 5 min，在波长 340nm 和 700nm 处读各管吸光度(A1 340、A1 700)抗人 CRP 抗血清 (l)50 50 50混合，于 37保温 5 min，在波长 340nm 和 700nm 处读各管吸光度(A2 340、A

8、2 700)【计算】 HDL-C 含量 (mmol/L) 标准液浓度A(A2 340A2 700)(A1 340A1 700)【参考范围】血清 C 反应蛋白4mg/L(各实验室应有自己的参考范围)【注意事项】1使用新鲜血清，并尽可能快地检测。2试剂不能冷冻保存。【临床意义】CRP 是一种急性相蛋白，肝脏是其主要的合成器官。最近研究表明，人体其他部位如冠状动脉平滑肌细胞、神经元细胞、血管内皮细胞、脂肪细胞、肾小管上皮细胞等在炎症刺激或病理状态下都能合成和分泌 CRP。正常情况下，CRP 以微量存在于健康人的血清中，但在机体有细菌感染、组织损伤、肿瘤形成等急性相刺激时，CRP 水平可升至正常的 1

9、00 倍甚至更高。测定 CRP 对于鉴别感染、监测疾病活动情况及严重程度、器质性疾病的筛检、监测器官移植受体排斥反应及疗效观察、冠心病等急性血管意外事件的预测与诊治等有很好的导向作用。【评价】CRP 的检测方法从灵敏度较低的免疫扩散法、火箭电泳法、胶乳凝集试验到高灵敏度、高精密度的放射免疫、酶免疫、免疫比浊等定量试验。多数情况下，半定量的胶乳凝集试验适合于筛查，但其影响因素多、灵敏度较差和不能精确定量。对于需作较精确的 CRP 定量测定，免疫浊度法较为合适。其他方法如 ELISA、免疫发光法和化学发光法虽然灵敏度和精确度都较高，但其成本也较高,故不是理想的临床实验室的常规方法。1 材料与方法1

10、.1 兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳的制备1.1.1 兔抗人白蛋白抗体的制备采用 25人血浆白蛋白注射液，按常规免疫新西兰纯种白兔，获得兔抗人白蛋白免疫血清（效价 1:32） ，经饱和硫酸铵沉淀后，过 DE52 层析柱，IgG 峰部洗脱液用 Follin 酚法于 540nm 处定量测定IgG 蛋白含量，并用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳鉴定，仅出现一条区带。1.1.2 兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳的制备取 10羧化聚苯乙烯胶乳悬液（军事医学科学院动物中心产品，=0.6m） ，用 pH8.2 甘氨酸缓冲液（GBS ）稀释成 1浓度，将其于兔抗人白蛋白 IgG 按适当比例混合，以常规物理吸附法致敏胶乳2。1.2 敏

11、感性试验取 25人血浆白蛋白 20l，加入生理盐水 180 l，再经系列稀释成 10 个浓度，其浓度范围在 25mg/ml3.125ng/ml 之间，用兔抗人免疫羧化胶乳做 3次重复检测。1.3 特异性试验将牛、马、羊、豚鼠血清分别稀释至 5、2.5和 1.25，用兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳检测。1.4 重复性试验用四批兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳，对 5 份粪微量白蛋白阳性粪便标本和2 份已知浓度白蛋白溶液平行检测，并在有效期内用同一批免疫羧化胶乳先后7 次重复检测，同时设阴性对照。3 讨论兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳试剂对粪微量白蛋白的检测，是针对粪便中由于病变部位出血后的血浆蛋白，或组织渗出液中的

12、白蛋白。而检测粪微量白蛋白作为大肠肿瘤的筛检手段之一，最早是在 1987 年，日本中山拓郎等曾用ELISA 法对粪潜白蛋白（Occultalbmin）进行定量检测，并认为其敏感性优于便潜血。1993 年，我们制备和建立了兔抗人白蛋白免疫羧化胶乳试剂和反向胶乳凝集试验，检测了 378 例已知患者和正常人粪便标本，其临床结果显示：56 例大肠癌诊断敏感性 55.4，特异性 82.6；132 例正常人阳性率 17.4。近来我们增加了已知患者数量，重新检测了 161 例正常人粪微量白蛋白，结果表明：在增加受检人数后，提高了大肠癌的诊断敏感性（76.8） ，而特异性则无显著差别（80.0） ；161 例

13、正常人阳性率为 19.2，比原来的 132 例正常人阳性率高 1.8。实验结果显示：在受检人数增多的情况下，用该试剂检测粪微量白蛋白可能会达到提高诊断敏感性，保持特异性的良好效果。C-反应蛋白检测试剂盒（全量程）试制工作总结 一、概 述C 反应蛋白（C-reactive protein）是一种能与肺炎链球菌 C 多糖体反应形成复合物的急性时相反应蛋白，半衰期 19 小时；血清 CRP 由肝脏合成，白细胞介素 1b、6 以及肿瘤坏死因子是其合成的最重要的调节因子； CRP 的分子量为 105 500，由含有五个相同的未糖基化的多肽亚单位组成，每个亚单位含有187 个氨基酸，这些亚单位间通过非共价

14、键连结成环状的五聚体，并有一个链间二硫键。1930 年，Tillett 和 Francis 首次在急性大叶性肺炎患者的血清中发现一种能 在 Ca2+存在时与肺炎球菌细胞壁中的 C多糖发生特异性沉淀反应的物质。1941 年， Avery 等测知它是一种蛋白质，故称为 C 反应蛋白(CRP)。1944 年，Jones 将其作为临床风湿热诊断标准的次要指标之一。后来，人们在非感染性疾病和感染性疾病患者的急性期血清中都测到了 CRP，于是人们认为，CRP是组织损伤的一种非特异性反应。进一步研究发现：病毒或细菌感染、梗塞、免疫复合物沉积等因素都可导致组织损伤。在组织损伤的急性期，肝脏合成的一些血浆蛋白显

15、著增加，这些蛋白质通称为急性时相蛋白，其中 CRP 是急性时相蛋白中变化最显著的一种。CRP 在正常人血清中其含量极微；在组织受到损伤、炎症、感染或肿瘤破坏时 CRP 可以在数小时内急剧上升，可增高数倍或数百倍， 2-3 天达峰值，待病情改善时逐渐下降，恢复正常。CRP 被广泛应用于临床疾病的早期诊断及鉴别诊断，其升高可见于：1、组织损伤、感染、肿瘤、心肌梗塞及一系列急慢性炎症性疾病，如风湿性关节炎、全身性血管炎、多肌痛风湿病； 2、术后感染及并发症的指标：手术后病人 CRP 升高，术后710 天 CRP 水平应下降，如 CRP 不降低或再次升高，提示可能并发感染或血栓栓塞；3、可作为细菌性感

16、染和病毒性感染的鉴别诊断：大多数细菌性感染会引起患者血清 CRP 升高，而病毒性感染则多数不升高。 超敏 C 反应蛋白（ High sensitivity C-reactive protein）与 CRP 并不是两种蛋白，只是从灵敏度上加以区分, 超敏 C 反应蛋白(Hs-CRP)最低检测限达 0.1 mg/l; 原先认为 CRP 是正常的血清却发现同未来发生心血管疾病密切相关, 大量研究资料表明,动脉粥样化的血栓去除了是脂肪堆积的过程外也是一个慢性炎症过程, ；Hs-CRP 轻度升高与冠状动脉事件、中风及周围血管病相关，是一项独立的危险因素； HS-CRP 已被证实是由慢性炎症引发心血有较高

17、的灵敏度但线性较低，这样就出现了一种试剂两种名称，用途也有所区别；近几年来，随着检验技术的发展，开始出现了一种全量程 CRP，这种 CRP 即能满足较高的灵敏度，又能满足较高的线性，如日本一化，申索佑福等，我公司通过与中科院上海生物研究所合作，近期已完成全量程 CRP 的试制，经公司自检与医院试用，结果表明与免疫散射比浊法一致性好；公司已计划于近期完成临床与注册，正式推向市场；二、国内外研究情况2.1 临床研究CRP 作为一种急性时相反应蛋白，被广泛应用于临床。2.1.1 用于细菌和病毒感染的鉴别诊断当细菌感染引发炎症，在炎症进程开始 47 小时就可开始升高，且升高的幅度与细菌感染的严重程度相

18、一致，病毒感染时 CRP 不增高，以此鉴别感染的性质，指导临床治疗，减少不管疾病的独立危险因素，检测其浓度对心血管疾病的干预及预后起重要作用而被临床重视。流行病学调查也显示,hs-CRP 水平升高者发生急性脑卒中的几率是正常健康人的 2 倍, 发生心肌梗死的几率是正常者的 3 倍 。2003 年欧洲高血压防治指南( ESH/ESC) 正式推荐, 高血压患者需检测 hs-CRP 水平。目前国内用于全自动生化仪的免疫透射比浊法试剂 CRP 出现了两种（普通 CRP 与超敏 CRP） ，普通 CRP 有较高的线性但灵敏度不好，超敏 CRP必要的抗生素治疗，有效防止抗生素的滥用。这些感染临床上常见于肺

19、炎、支气管炎、咽喉炎、细菌性脑膜炎、伤寒、化脓性关节炎、尿路感染、骨盆炎、阑尾炎等等。在鉴别细菌或病毒感染方面，比白细胞计数及分类计数更准确，特别是老年人，免疫系统反应顺应性下降，可能有感染发生但临床上并无发热、白细胞升高等情况，此时检测 CRP 有助于检出细菌感染。2.1.2 肿瘤监测CRP 的测定用于肿瘤的治疗和预后：CRP 术前上升,术后下降，不受放疗、化疗和皮质激素治疗的影响，有助于临床评估肿瘤的进程。2.1.3 监控病情变化及术后感染，并用于抗生素疗效观察CRP 在血中升高的幅度与感染的程度正相关。有研究表明，术后 6 小时左右，CRP 开始升高，如无并发症应在术后三天下降直至正常，

20、如术后出现感染，则 CRP 长时间不下降；术前 CRP 升高者，术后感染率也远高于术前 CRP 不高者。对于烧伤病人，可检测 CRP 以警示是否发生败血症，以便及时应对治疗。对疑有败血症的新生儿，在 2448 小时内作 CRP 的动态监测，可作为是否停止抗生素治疗的可靠依据，而血培养的时间则需更长，培养结果出来之前无法排除败血症。对细菌感染作抗生素治疗时，动态检测 CRP 是必要的，它比临床体征更早作出并发症警报和治疗效果的判定，在粒细胞缺乏症或机体免疫状态抑制时更有临床意义。2.1.4 用于评估急性胰腺炎的严重程度 入院时 CRP110mg/l，可能是出血性胰腺炎（临床灵敏度，特异性） ；当

21、 CRP250mg/l 时,可提示为广泛性坏死性胰腺炎。2.1.5 风湿病类风湿性关节炎患者 CRP 与疾病相关性较大，比临床症状出现要早 4-6 周。2.1.6 肺部感染肺炎在年老人群中较难诊断，通常不大有发热。在许多情况下100mg/l，提示细菌感染，如肺炎或化脓性支气管炎。典型的病毒性肺炎不会超过 50mg/l。2.1.7 儿科感染性疾病：在儿童急性淋巴细胞白血病常发性细菌败血症，CRP 超过 100mg/ L,则视为有细菌感染 ;儿童 CRP 细菌性脑膜炎时平均 195mg/L，而病毒性脑膜炎则低得多。2.1.8 肾脏移植排异移值后 8 天 CRP 下降至正常，如发生排斥反应则血清肌酐

22、、尿氮、CRP 皆升高。CRP 升高在排斥反应发生之前 4 天出现。但是，感染也可发生 CRP 升高，要注意两者鉴别。2.1.9 心血管疾病随着检验技术的发展,原先认为 CRP 是正常的血清却发现同未来发生心血管疾病密切相关,大量研究资料表明,动脉粥样化的血栓去除了是脂肪堆积的过程外也是一个慢性炎症过程,；CRP 轻度升高与冠状动脉事件、中风及周围血管病相关，是一项独立的危险因素； 未来发生心血管疾病发病率和死亡率的预测指标Hs-CRP 是健康人未来发生心血管事件一个有价值的预测指标，许多研究证实 Hs-CRP 能预测首次心肌梗死和疾病的发作，内科健康研究（PHS）显示，Hs-CRP 位于最高

23、四分位数的病人未来发生卒中危险增加 2 倍，未来发生心肌梗死危险增加 3 倍，未来发生周围血管疾病的危险增加 4 倍。这种预测作用长期稳定存在于吸烟和非吸烟者中，且独立于其他危险因素。Hs-CRP 是已知CHD 病人未来心血管病发病和死亡的预测指标，欧洲 ECTA 研究组的资料显示，稳定性心绞痛（SAP）和不稳定性心绞痛（UAP）病人 Hs-CRP 浓度每升高一个标准差，非致命性心肌梗死或心脏性猝死的相对危险增加 45%。 急性冠脉综合症（ ACS）的预后指标Hs-CRP 测定对 ACS 的预后价值，首先是在急性局部缺血和不稳定心绞痛的病人中提出的，重度不稳定型心绞痛（UAP）病人入院时若 H

24、s-CRP3mg/l 比 Hs-CRP3mg/l 者心绞痛复发、冠状动脉血管置换术、心肌梗死和心血管疾病致死等心血管事件发生率高；出院时测 Hs-CRP 比入院时测能更好的预测 90 天的不良后果；检测 Hs-CRP 有助于鉴别心肌钙蛋白（cTn）阴性而病死率增高的病人,应联合合使用 cTn 与 Hs-CRP 来评估 ACS 危险程度,ACS 病人入院时 Hs-CRP5mg/l 与半年内严重心脏病发病率升高相关, 而不管 cTn 值如何。 与 TC/HDL-C 联合预测冠心病危险在冠心病的危险性研究评估时, Hs-CRP 与血脂指标是独立的变量 ,将两者同时检测并联合分析,在诸多变量分析过程中

25、,记录诸多冠心病危险因素如肥胖 高血压糖尿病冠心病家族史等，各种生化指标中仅 Hs-CRP 与 TC/HDL-C 有单独的预测价值,两者联合意义更大。2.2 国内外试剂盒发展CRP 的测定方法较多，一般分为定性与定量两种。定性方法有：用纯化了的肺炎球菌 C-组分与病人血清反应的沉淀法、肺炎球菌荚膜肿胀试验、特异性抗血清与 CRP 反应的毛细管沉淀试验、补体结合试验、乳胶凝集试验、乳胶扩散沉淀试验等，但它们的灵敏度低，只用于定性检测。定量检测的有：放射免疫(RIA)、荧光免疫(FIA)、酶标免疫(ELISA) 、速率散射比浊法（INA） 、胶乳增强透射比浊法（ITA） ； 定性与定量相结合的方法

26、有：快速检测卡结合仪器法；其中放射法对人伤辐射伤害较大，已较少使用，荧光免疫(FIA)或化学发光需专用仪器且成本高，ELISA 法多数为半自动操作，出结果慢，不适合批量检测；速率散射比浊法（INA）需与比浊仪搭配使用，增加了仪器成本；快速检测卡结合仪器法只是半定量试剂，不能准确定量；胶乳增强透射比浊法（ITA）是目前医院较多使用的方法之一。目前国内有两种试剂，即普通 CRP 与超敏 CRP，一个项目，两种试剂，给用户带来了不便；随着检验技术的发展，近几年已出现了一种即有高线性又有高灵敏度的试剂，即全量程 CRP，目前国外已有 Orion 公司、日本一化，申索佑福等公司推出了此种试剂，我公司通过

27、与中科院上海生物研究所合作，近期已完成全量程 CRP 的试制，经公司自检与医院试用，结果表明与免疫散射比浊法一致性好；公司已计划于近期完成临床与注册，正式推向市场；全量程CRP 即有普通 CRP 的高线性，又有超敏 CRP 的高灵活敏度，因此，CRP 即可作炎症标志物，也可用作 Hs-CRP 用于心血管疾病的预测与预后。三、试制过程目前，测定 CRP 的方法有很多，定性或半定量方法由于不是准确定量，已较少使用；定量方法放射免疫(RIA)、荧光免疫(FIA)、酶标免疫(ELISA) 、速率散射比浊法（ INA） 、胶乳增强透射比浊法（ITA）等中以后两种使用较多；目前国外已有 Orion 公司、

28、日本一化，申索佑福等推出了胶乳增强透射比浊法试剂，国内大多为进口试剂，我公司通过与中科院上海生研所合作，已完成小样制备，并计划于近期报批上市。3.1 原理与试剂成份血浆中的 CRP 与试剂中胶乳包被的特异性抗体相结合，形成抗原抗体复合物产生混浊;在一定的抗体浓度范围内,其浊度高低与血清 CRP 含量成正比。通过测定特定波长的吸光度值，查标准曲线即可求出血清中 CRP 的含量。试剂成份： 磷酸盐 100mM 表面活性剂复合抗体当光线通过个浑浊介质溶液时,由于溶液中存在混浊颗粒,光线被吸收了一部分,吸收的多少与混浊颗粒的量成正比,这种测定光吸收量的方法称为透射比浊法。因有抗原抗体反应，固称为免疫透

29、射比浊法，为增强灵敏度，采用胶乳增强免疫比浊法。抗原与抗体在一定条件下才能形成复合物，一定条件包括： 抗体的要求抗体要求效价高（保持高线性） ，纯度高（如不纯，则有可能含其它抗体而有非特反应从而导致结果偏高） ，亲和力要强（亲和力强生成的抗原抗体复合物才稳定，不易解离） 抗原抗体比例要求免疫复合物形成有三个阶段，第一阶段是形成抗原抗体复体物，第二阶段是复合物交联形成大网格结构，第三阶段是复合物聚合而形成沉淀。只有在抗体过量时，其浊度才会随着 CRP 的增加面增加，若抗原过剩则会出现 HOOK效应而导致结果偏低而不准； 促进剂与稳定剂一般要求溶液中有非离子性亲水性多聚体促进免疫复合物的形成，如P

30、EG6000，含量 3-4%。PH 一般在 6.5-8.0 之间 ,过酸过碱均会破坏试剂中抗体与样本中的抗原。3.2 胶乳的选择与制备由于测定用的波长与粒径大小有关,因此粒径的均一性是影响测量精密度与均确度的一个重要因素。公司选用聚苯乙烯胶乳，聚苯乙烯胶乳用乳液聚合法制备小分子纳米（25-50nm） ，采用微孔过滤技术，保证颗粒大小的一致性，小分子纳米颗粒较一般颗粒（100-300nm）颗粒更小，不易发生自沉；过滤后的胶乳进行羧化，使羧基均匀分布于胶乳的表面。再把羧化的胶乳与 D-二聚体抗体结合，结合方式包含物理吸附与化学交联两种，以增强抗原捕获能力，缩短反应时间，整过反应过程在 3-5 分钟

31、内结束，且化学交联后形成的抗原抗体复合物更紧密，不易解离，结果更准确，精密度更好。表一、小分子纳米技术与化学交联技术应用后的 D-二聚体的精密度与准确度X SD Cv(%)1.5 0.06 4.00批内（n=20）123 2 2.441.4 0.05 3.57批间（n=20）123 1.6 1.30靶值 测量值 偏差 相对偏差质 控 1 2.0 2.15 0.15 7.5%质 控 2 10 9.62 0.38 3.8%质 控 3 136 138.5 2.5 1.84%胶乳粒子在 100-300nm 时，胶乳颗粒易自沉，造成瓶间差批间差过大，而且由于粒径过大，造成反应为非均相反应，CV 变异较大

32、，我公司采用创新的小分子纳米技术，大大的延长了定标有效期，缩小了瓶间差与批间差，为真正意义上的均相反应。表二、胶乳粒径与定标有效期、瓶间 CV、批间 CV 等关系胶乳粒径（nm）定标有效期（天）是否均相反应 是否自沉100-300 7-14 非均相 自沉25-50 28 均相 均相分布，不自沉批内 CV（%） ，N=20瓶间 CV（%） ，N=20批间 CV（%） ，N=20100-300 4.5 5.5 6.825-50 2.8 3.0 4.1普通胶乳只通过物理吸附抗体，形成共价交联，共价交联结合相对不牢靠，而且吸附的抗体较少，会造成试剂线性偏或灵敏度低；我公司采用物理吸附的共价交联与化学交

33、联相结合技术（化学交联通过缩合剂炭化二亚胺将胶乳上的羧基与交联物上的氨基缩合在一起） ，大大提高了试剂的稳定性与灵敏度；表三、不同交联胶乳试剂灵敏度与试剂稳定性共价交联 稳定 6 个月 灵敏度较低反应慢，复合物不太稳定化学交联 稳定 9 个月 灵敏度高 反应快，复合物稳定共价+化学交联 稳定 12 个月灵敏度高 反应快，复合物很稳定3.3 抗体的选择与纯化抗体的纯度对测定的特异性有直接影响。不纯的抗体将导致非特异反应，引起结果假性升高，测量值不准等情况。因此必须采用单克隆抗体与亲和层析技术纯化的抗体，并用 SDS-PAGE 鉴定纯度，如出现多条电泳带，则多明杂蛋白较多，需更进一步纯化；公司 C

34、RP 抗体采用羊抗人多克克隆抗体与鼠抗人单克隆抗体的复合抗体，采用山羊或鼠体内诱生法产生，产生的腹水用滤纸过滤，去除脂质与大颗粒，再用离心的方法去除细胞碎片和大的蛋白质，制成粗抗体；将粗抗原或纯化抗原交联到琼脂糖珠 SEPHAROSE 4B 制成亲和层析柱, 将粗抗体通过亲和层析柱, 洗去未结合的非特异性蛋白,再用硫氰酸钾洗脱 ,洗脱流出液即为纯的多克隆抗体。抗体的效价：要求效价至少大于 1：16 ，效价为抗体能引起浊度变化的最大稀释倍数，公司采用的复合抗体中羊抗人多克克隆抗体效价大于 1:16, 鼠抗人单克隆抗体效价大于 1:128;多抗保证线性与高值 ,单抗保证灵敏度与低值;抗体的保存：冻

35、干抗体具有稳定性好，保质期长等特点，适合于长期保存，配成试剂后可加适量甘油与 BSA 作稳定剂；多克隆抗体、单克隆抗体等复合抗体技术即保证了灵敏度与高线性，与普通 CRP 与超敏 CRP 两种试剂等效，方便了医院操作；亲和层析技术的应用，大大提高了抗体的纯度与效价，最大限度避免了非特异性反应，使结果准确性有了较大提高，精密度更好；表四、亲和层析与复合抗体技术应用后 D-二聚体的精密度与准确度X SD Cv(%)1.5 0.05 3.33批内（n=20）123 2.6 2.111.4 0.06 4.0批间（n=20）125 3.0 2.4靶值 测量值 偏差 相对偏差质 控 1 2 2.08 0.

36、08 4%质 控 2 10 10.3 0.3 3%质 控 3 136 134 -2 1.5%34 微孔滤膜孔径的选择试剂的稳定性因素主要有胶乳抗体的纯度,缓冲液的品质, 试剂中的悬浮小颗粒 ,此小颗粒肉眼看不到 ,漂浮于试剂中,影响光的吸收, 且用常规过滤无法去除, 其主要成份为杂质、短纤维和细菌，这是导致瓶间与批间差大的原因之一。由于普通胶乳颗粒采用 100-300nm，所以只能用常规过滤，无法去除杂质，我公司由于采用小分子纳米（20-50nm ）技术，可以采用特殊微膜过滤，通过过滤膜孔径的研究发现，小孔径过滤可以显著改善试剂的精密度，延长定标稳定期，缩小批间差；表五、滤膜孔径与变异系数，定

37、标有效期的关系（n=20）孔径（m） 0.25 0.45 0.6 0.8 1.0 1.2CV（%） 3.2 4.5 5.1 5.6 7.5 8.2定标有效期（天）28 14 10 8 7 5当孔径在 1m 时，基本可以除去一般的杂质微粒，当孔径在 0.45m 时，基本可以除去短小纤维,当孔径在 0.25m 时，基本可以除细菌等微生物 ;实验表明当孔径在 0.22m 时 延长定标稳定期，缩小批间差, 可能与去除细菌有关,试剂更稳定;35 稳定剂、保护剂的选择与优化胶乳溶液介于小分子离子溶液与粗分散体系之间，胶乳抗体颗粒作布朗运动，不易受重力影响而下沉。但胶乳抗体溶液不是稳定体系，当颗粒相互碰撞时

38、，有时会自动合并为较大、较重颗粒而引起自沉；影响自沉的原因如下：胶乳颗粒间的相互引力，可能引起合并变成大颗粒；胶粒带电情况，一种胶乳的粒子都带有相同电荷，同性相斥，胶粒带电量越大，排斥越大，越不易自沉；胶粒之间的溶剂膜，这种液膜有反抗二固体接近的排斥力，这种排斥力与缓冲液、合适的 PH，稳定剂等相关； 我公司选择 CC+PEG 作为促进剂与稳定剂，与明胶、PEG，葡聚糖相比稳定时间更长，提升了试剂的有效期表六、稳定剂与有效期(以测量结果与靶值偏差10%为依据)的关系稳定剂 CC+PEG 葡聚糖 PEG 明胶稳定时间(月)12 5 10 6偏差(%) 4.3 6.9 5.6 8.5四、创新点目前

39、我公司已完成全量程 CRP 的小试、中试阶段。已经小规模投入生产，产品性能符合产品标准要求（产品标准要求不低于国家标准要求） ，产品经自检与送检均符合产品标准要求，医院实验结果表明此试剂也符合临床使用要求，可以正式投入市场。目前国外已有此类胶乳比浊试剂，我公司与中科院上海生化研究所合作，作出了以下几点创新：1、采用鼠抗人单克隆抗体与羊抗人多克隆抗体相结合的复合抗体技术, 即保证了高线性,又保证了产品的灵活敏度；2、采用了亲和层析纯化技术，使得抗体更纯,亲和力更好，效价更高；3、采用共价交联与化学交联相结合的抗体包被技术，使得线性与灵敏度有了较大提高,复合物的稳定性有所增强；4、采用小分子纳米技

40、术与微孔过滤技术，使得试剂更稳定，不易发生自沉,有效的延长了定标有效期；有效的提高了试剂的均一性，成为真正意义上的均相反应；有效的去除了非反应杂质颗粒，提升了试剂的精密度与准确度；5、加入了 PEG+CC 作为促进剂与稳定剂，有效的延长的试剂的有效期；6、采用二级反渗水作为试剂配制用水,有效的避免了水中杂质颗粒带来的干扰;研究结果表明，2种检测方法在35、510和10 mgL范围内测定hs-CRP浓度的相关系数分别为0、996、0995、0982，表明2种检测方法的相关性较好。而在10 mgL，由于抗原过量，乳胶增强透射免疫比浊法测定时，hs-CRP浓度明显超出了检测限上限，会发生测定结果显著低于实际含量或无法测出的现象。而在速率散射免疫比浊法中，为保证准确性和精确性，仪器设计有抗原过量检测系统。提示应将待测标本进一步稀释，重新进行检测。以获取全部抗原的真实浓度，本研究通过5倍稀释标本，得到了较高浓度hs-CRP的精确值。由此看来，速率散射免疫比浊法在低值和高值测定中优于乳胶增强透射免疫比浊法。