1、本文由探生科技技术人员提供，如果您想了解更多关于抗体的信息，可以访问 Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家查找相关资料,希望对您有帮助！1构建免疫球蛋白与细胞因子融合基因做家族特异性抗淋巴瘤疫苗摘要 目的 构建免疫球蛋白重链可变区（IgHV）基因片段与细胞因子 GM-CSF 或 IL-2的融合基因表达载体作为家族特异性抗淋巴瘤核酸疫苗，接种动物了解该疫苗抗淋巴瘤免疫功能。方法 从脐带血免疫球蛋白基因文库 810 个 IgHV3/Bluescript 克隆获得一些片段长度差异较大的基因片段，测序后利用生物信息资源分析预测其重链可变区的 T 细胞表位，同时分析本室以前构建的 IgH
2、V1个片段。选择包含了绝大多数细胞表位的IgHV1、IgHV3 基因，分别将框架区(FR)为主的 IgHV(FR)基因片段及 IgHV(FR)与 GM-CSF 或IL-2 基因连接后形成的融合基因克隆到真核表达载体 pcDNA3.0 中。表达载体通过脂质体转染 COS 细胞， ELISA 法确定 GM-CSF 或 IL-2 的表达情况。将一些表达载体作为核酸疫苗免疫小鼠，通过间接免疫荧光法和细胞因子分泌法检测小鼠抗同一家族淋巴瘤和正常淋巴细胞的免疫反应。结果 分别将 6 个不同的 IgHV3 基因和个 IgHV1 克隆测序，翻译为免疫球蛋白序列，利用 Rammense 计算机评分系统预测这些
3、IgHV1、IgHV3 序列上分别受 HLA 位点限制的 T 细胞表位，每个 IgHV 序列中约存在 30 个左右 T 细胞表位，90以上的 T 细胞表位位于框架区，积分排位于前 10的 T 细胞表位都位于框架区。个代表性基因剪切去除 CDR3 区后构建以框架区(FR)为主的 IgHV(FR)和 IgHV(FR)pcDNA3 表达载体。另外将GM-CSF 或 IL-2 基因连接到个 IgHV 基因的 3端。最终获得 IgHV(FR)、IgHV1(FR)GM-CSF、IgHV1(FR)-IL-2、IgHV3(FR)、IgHV3(FR)GM-CSF IgHV3(FR)-IL-2 种表达载体。表达载
4、体体外转染 COS 细胞，检测 48 小时后培养上清中 GM-CSF 及 IL-2。IgHV1(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0 及 IgHV3(FR)-GM-CSF/ pcDNA3.0 中 GM-CSF 的表达量高于对照组空质粒pcDNA3.0 200 倍以上；IgHV1(FR)-IL-2 /pcDNA3.0 和 IgHV3(FR)-IL-2/pcDNA3.0 中 IL-2的表达量高于对照组空质粒 pcDNA3.0 60 倍以上。肌肉注射 IgHV1(FR)-IL-2 免疫动物组在首次免疫后第 2 周开始检测到抗属于 IgHV1 家族的淋巴瘤 Namalwa 细胞系的抗体，IgHV1(
5、FR)组在首次免疫后第 4 周开始检测到抗 Namalwa 细胞抗体，IgHV3(FR)组、IgHV3(FR)-IL-2 组和 pcDNA3.0 组小鼠始终对 Namalwa 细胞呈阴性反应。肌肉注射IgHV3(FR)-IL-2 组在首次免疫后第 2 周开始检测到抗属于 IgHV3 家族的传代淋巴细胞系的抗体，IgHV3(FR)组第 4 周开始检测到抗体，而 IgHV1(FR)组、IgHV1(FR)-IL-2 组和pcDNA3.0 组对 IgHV3 家族传代淋巴细胞系呈阴性反应；这些阳性血清不与 K562 和 Daudi细胞反应，表明注射 IgHV(FR)和 IgHV (FR)-IL-2 表达
6、载体诱导产生的抗体可以识别属于同一家族的淋巴瘤或者其他淋巴细胞。IgHV1(FR)-IL-2 组和 IgHV3(FR)-IL-2 组免疫小鼠血清 IFN- 含量显著高于 pcDNA3.0 组（P0.05)。结论 应用免疫球蛋白重链不同可变区中的框架区基因可以制备表达载体作为基因家族特异性抗淋巴瘤核酸疫苗，肌肉注射可以诱发小鼠的抗淋巴瘤免疫反应。同时融合了细胞因子的表达载体可以明显增强免疫反应。关键词 核酸疫苗；家族特异性；免疫球蛋白；框架区（FR） ；细胞因子；淋巴瘤_Construct immunoglobulin heavy chain variable region gene and c
7、ytokine gene co-expression vector as IgHV family specific nucleic acid vaccine to lymphoma 本文由探生科技技术人员提供，如果您想了解更多关于抗体的信息，可以访问 Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家查找相关资料,希望对您有帮助！2LIU Hui1，2 , ZHU Ping1, LIN Ning-Jing1, ZHANG Ying1, BU Ding-Fang1, WANG Yi-Jia1, WANG Yi-Qun1,YANG-Ying1(1Peking University First H
8、ospital, Beijing 100034 and 2Beijing Hospital, Beijing 100730, China)Abstract Objective To construct the immunoglobulin heavy chain variable region (IgHV) gene and GM-CSF or IL-2 gene co-expression vector as IgHV family specific nucleic acid vaccine to lymphoma, and study the immune response of the
9、immunized mice against lymphoma. Methods To obtain a set of clones whose gene fragments are difference in length from a gene bank (810 of IgHV3/Bluescript) that we construct from normal fetal umbilical cord blood before. These gene fragments in the clones were sequencing. The sequences were translat
10、ed into amino acid sequences. T cell epitopes in the IgHV were predicted by bioinformatics. Meanwhile 6 clones of IgHV1 constructed by our lab before were analyzed. The most typical clone of IgHV1 and IgHV3 that contain the most of T cell epitopes were selected. The IgHV gene fragments that cut out
11、complementary determining region 3 (CDR3) and composed mainly by framework region were cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.0. Meanwhile, the gene fragments of framework region of IgHV that linked with gene of GM-CSF or IL-2 were cloned into pcDNA3.0 to form fusion gene of IgHV (FR)-GM-CS
12、F/IL-2. Then they were transected into COS cells by Lipofectin and detected their transient expressing product by ELISA. Some of expression vectors were used as nucleic acid vaccine to immunize mice. Indirect immunofluorescence staining and ELISA were used to assess the immune response against lymph
13、oma and lymphocyte that belong same or different IgHV family. Results Six clones of IgHV3 and six clones of IgHV1 were sequencing and translated into peptides. The bioinformatics of Rammense were used to predict T cell epitopes of various HLA types in the IgHV peptide sequences. About 30 T cell epit
14、opes existed in each IgHV peptides. Among the bioinformatics prediction, about 90% of T cell epitopes were in the framework region (FR) of IgHV, and the first 10% of higher prediction score were in FR. The CDR3 of two typical IgHV sequences were cut down and remained sequences (mainly composed of FR
15、) were used to construct the IgHV1 (FR)/pcDNA3.0 and IgHV3 (FR) /pcDNA3.0 expression vectors. The 3 of IgHV1 (FR) and IgHV3 (FR) were linked GM-CSF or IL-2 gene. At last 6 of IgHV1 (FR)/pcDNA3.0, IgHV1 (FR) GM-CSF/pcDNA3.0, IgHV1 (FR)-IL-2/pcDNA3.0, IgHV3(FR)/pcDNA3.0, IgHV3(FR)GM-CSF/pcDNA3.0 and I
16、gHV3(FR)- IL-2/pcDNA3.0 were obtained. The IgHV1 (FR)-GM-CSF/pcDNA3.0 and IgHV3 (FR) -IL-2/pcDNA3.0 were transfected into COS cells. In the supernatant, the GM-CSF and IL-2 were detected after 48 hours culture. The expression of GM-CSF in the group transfected with IgHV(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0 are 200 t
17、imes higher than the group transfected with control pcDNA3.0. The expression of IL-2 in the group transfected with IgHV(FR)-IL-2/ pcDNA3.0 are 60 times higher than the group transfected with control pcDNA3.0. The antibody against IgHV1 family lymphoma cell line - Namalwa could be detected since the
18、second week in the mice immunized with IgHV1(FR)-IL-2. The antibody could be detected since the fourth week in the mice immunized with IgHV1(FR). The antibody couldnt be detected in the mice immunized with IgHV3(FR), IgHV3(FR)-IL-2 and control pcDNA3.0. The antibody against lymphocyte line of IgHV3
19、family could be detected since the second week in the mice immunized with IgHV3(FR)-IL-2. 本文由探生科技技术人员提供，如果您想了解更多关于抗体的信息，可以访问 Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家查找相关资料,希望对您有帮助！3The antibody could be detected since the fourth week in the mice immunized with IgHV3(FR). The antibody against antibody against lymp
20、hocyte line of IgHV3 family couldnt be detected in the mice immunized with IgHV1(FR), IgHV1(FR)-IL-2 and pcDNA3.0. The antibody against K562 could not be detected in the serum of mice of all the five groups. These results indicate that the antibody against lymphoma and lymphocyte of the same IgHV fa
21、mily could be induced by IgHV(FR)/ pcDNA3.0 and IgHV(FR)-IL-2/pcDNA3.0. The quantity of IFN- in serum of the mice immunized with IgHV1(FR)-IL-2/pcDNA3.0 or IgHV3(FR)-IL-2/pcDNA3.0 were higher than immunized with IgHV1(FR)/pcDNA3.0 or IgHV3(FR)/pcDNA3.0 or pcDNA3.0（ P0.05）. Conclusion The gene fragme
22、nts of IgHV(FR) could be used to construct IgHV family specific nucleic acid vaccine to lymphoma .The vaccine could induce anti-lymphoma immune response in mice by muscle injection. The expressing vectors of IgHV(FR)-GM-CSF/IL-2 could induce stronger immunoreaction.Key words nucleic acid vaccine; ge
23、ne family specific; Immunoglobulin; framework region; Cytokine; Lymphoma本文由探生科技技术人员提供，如果您想了解更多关于抗体的信息，可以访问 Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家查找相关资料,希望对您有帮助！4淋巴细胞表面的免疫球蛋白可变区序列各不相同，称为独特型。利用淋巴瘤表面特有的免疫球蛋白独特型可以作为抗原，诱导机体产生抗淋巴瘤的免疫反应。免疫反应的目标是针对独特型上的抗原决定簇。迄今许多人认为这些抗原决定簇主要位于免疫球蛋白可变区上的超变区（CDR 区） 。每个淋巴细胞克隆都有不同的 CDR 区，如
24、果希望利用诱导免疫反应的方法治疗淋巴瘤，必须为每例患者提供不同淋巴瘤的不同 CDR 区序列上的抗原来诱发免疫反应。我课题组近期的工作发现，独特型抗原的大部分抗原决定簇位于免疫球蛋白可变区（IgHV）的框架区 1。依据免疫球蛋白框架区的不同可以把淋巴细胞或者淋巴瘤细胞分为种基因家族。制备相应的 IgHV 家族特异性框架区序列表达载体作为核酸疫苗，有可能诱发机体抑制相应的淋巴瘤的生长的免疫反应。如果框架区序列与某种细胞因子序列形成融合蛋白共同表达还可能加强免疫反应。本文克隆了 IgHV1、IgHV3 框架区基因片段，构建 IgHV1、IgHV3 与细胞因子 IL-2 或者 GM-CSF 的共表达载
25、体，作为家族特异性抗淋巴瘤核酸疫苗注射给小鼠，观察到这种类型的核酸疫苗可以成功诱发抗淋巴瘤免疫反应。材料与方法1. 克隆免疫球蛋白重链可变区基因片段：本室建立脐带血免疫球蛋白基因文库中IgHV3 有 810 个 IgHV3/pBluescript 克隆，在 2琼脂糖电泳选择片段长度差异较大的 6个 IgHV3 片段测序，生物信息资源分析计算机评分系统预测选择最适片段。含 IgHV1 家族个片段的 IgHV1/pcDNA3 克隆是本室以前构建的 2，同样用计算机评分系统预测选择最适片段。2生物信息资源分析计算机评分系统预测 T 细胞表位：通过 http:/www.expasy.ch /tools
26、/DNA.html，将得到的 IgHV1、IgHV3 重链可变区的核酸序列翻译为氨基酸序列；在http:/ www.ncbi. nlm.nih.gov/Igblast 基因库，与胚系重链可变区的氨基酸序列比较同源性，区分出 4 个框架区（FR）和 3 个超变区（CDR） ；利用 Rammense4 计算机评分系统预测获得的 IgHV1、IgHV3 编码序列上位点限制性 T 细胞表位。确定细胞表位分布，选择代表性序列构建表达载体。3构建 IgHV3、IgHV1 去除 CDR3 区的真核表达载体：根据 T 细胞表位预测结果从IgHV1、IgHV3 序列中各选取 1 个在多种 HLA 型别均具有较高
27、积分 T 细胞表位的序列为模板，PCR 获得 IgHV1、IgHV3 框架区基因片段，上游引物设计在 IgHV1、IgHV3 的引导区内，5端设计了 Kozak 序列及 KpnI 的酶切位点；下游引物分别设计在它们的 FR3 区，5端设计了终止密码子及 EcoRI 的酶切位点，序列如下：VH1 上：5TATAGGTACCACCATGGACTGGACCTGGAG3VH1 下：5TTAAGAATTCCTATCTCGCACAGTAATACACAGCCGT3VH3 上: 5TATAGGTACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTG3VH3 下：5TTAAGAATTCCTAAGTCGCACAGT
28、AATACACGGCCGT325l 反应体系含 1.5 mmol/L MgCl2、1buffer（Promega） 、0.1mmol/L 4dNTP （Promega） 、0.25mol/L 引物、50-100ng 模板 DNA 和 1.25IU TaqDNA 聚合酶（Promega） ；94预热 5 分钟后接 30 个循环（9430 秒，5630 秒，7230 秒） ，72延伸 7 分钟。PCR 产物经 KpnI 和 EcoRI 酶切后，定向克隆到真核表达载体 pcDNA3.0 中。选取阳性克隆测序（上海博亚生物技术有限公司） 。4构建 IgHV1、IgHV3 和细胞因子融合基因真核表达载体
29、：PCR 获得 3端含接头（linker ）的 IgHV1 和 IgHV3 框架区基因片段:上游引物分别与 VH1 上和 VH3 上相同，下游本文由探生科技技术人员提供，如果您想了解更多关于抗体的信息，可以访问 Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家查找相关资料,希望对您有帮助！5引物分别设计在它们的 FR3 区，5端设计了包含编码 10 个亲水性并有低电荷效应的氨基酸序列作为 linker，序列如下：VH1(FR)下:5AGAGCCTCCGCCACCGGATCCACCGCCACCTCTCGCACAGTAATACACAGCCGT3VH3(FR)下:5AGAGCCTCCGCCACC
30、GGATCCACCGCCACCAGTCGCACAGTAATACACGGCCGT3PCR 反应条件同上。PCR 获得 5端含 linker 的 GM-CSF 和 IL-2 基因片段: 用 PcD-hIL-2 和 P-hGM-CSF 质粒（北京大学医学部免疫教研室马大龙教授惠赠）作为模板扩增 hIL-2 基因和 hGM-CSF 基因，在 GM-CSF 和 IL-2 基因上游引物 5端设计了包含编码 10 个亲水性并有低电荷效应的氨基酸序列作为接头（linker） ，下游引物 5端设计了终止密码子及 EcoRI 的酶切位点，序列如下：hGM-CSF 上：5GGTGGCGGTGGATCCGGTGGCG
31、GAGGCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCA 3hGM-CSF 下：5TTAAGAATTCCTAACTCCTGGACTGGCTCCCAGC3h-IL-2 上：5GGTGGCGGTGGATCCGGTGGCGGAGGCTCTGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAG3h-IL-2 下：5TTAAGAATTCCTAAGTTAGTGTTGAGATGATGC3PCR 反应条件同上。将 IgHV1 和 IgHV3 框架区基因片段分别与 GM-CSF 和 IL-2 基因片段连接形成融合基因，取 IgHV1 和 IgHV3 框架区基因片各 1ul 分别与 GM-CSF 和 IL-2
32、 基因片段 1ul 混匀，在 PCR仪上 94C 变性 10 分钟，逐渐退火，每 30 秒下降 10C，至温度下降至 30C。在退火产物中加入 Klenow 片段、dNTP、buffer 和去离子水室温 30 分钟，75C 10 分钟灭活 Klenow 片段。各取 1ul 上述反应产物为模板进行 PCR 扩增 IgHV1（FR）-GM-CSF、IgHV3（FR）-GM-CSF、IgHV1(FR)-IL-2 和 IgHV3(FR)-IL-2 融合基因, 上游引物分别用 VH1 上及 VH3 上，下游引物分别用 GM-CSF 和 IL-2 的下游引物。PCR 反应条件同上。PCR 产物经 KpnI
33、 和 EcoRI酶切后，定向克隆到真核表达载体 pcDNA3.0 中构建 IgHV1、IgHV3 和细胞因子融合基因真核表达载体。选取阳性克隆测序（上海博亚生物技术有限公司） 。将 IgHV(FR)/ pcDNA3.0、IgHV(FR)-GM-CSF/ pcDNA3.0 和 IgHV(FR)-IL-2/ pcDNA3.0 在 TOP10 菌中大量扩增，用 QIAgen Giga 无内热源质粒提取试剂盒大量提取质粒。IgHV1、IgHV3 和细胞因子融合基因真核表达载体在体外表达：通过脂质体介导法瞬时转染 COS 细胞（非洲绿猴肾细胞系） ，在 6 孔板上接种 2105COS 细胞（2ml/孔）
34、 ，37C CO2 培养箱中培养 24 小时后每孔细胞贴壁约 60，细胞生长状态好。IgHV1(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0、IgHV1(FR)-IL-2/pcDNA3.0、IgHV3(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0 和 IgHV3(FR)-IL-2/pcDNA3.0 各复种 2 孔，以 pcDNA3.0 空质粒复种 2 孔作为阴性对照。按照Invitrogen 公司提供的转染程序进行，脂质体 Lipofectic:DNA 为 3：1（V/W）,导入外源DNA2ug/孔。转染 48 小时后取培养上清，通过双夹心 ELISA 法（DIACLONE 公司）检测上清中的 GM-CS
35、F 及 IL-2 表达量。. 免疫动物获得抗血清：将 20 只 68 周的健康纯系雄性 Balb/c 小鼠随机分为五组，每组 4 只。第 1 组注射 IgHV3(FR)/pcDNA3.0。第 2 组注射 IgHV3(FR)-IL-2/ pcDNA 3.0。第 3 组注射空质粒载体 pcDNA3.0 作为对照组。第 4 组注射 IgHV1(FR)/pcDNA3.0。第 5 组注射 IgHV1(FR)-IL-2/pcDNA3.0。预先在小鼠双侧股四头肌注射 0.25%盐酸布比卡因，每侧50l，3 天后分组免疫。各小鼠分别于第 0、2、4 周各免疫一次，共三次,100g/次。分别于第 0、2、4、6
36、、8 周经小鼠眼内眦血管取血留取血清。7. 间接免疫荧光法检测小鼠免疫后抗 Namalwa 细胞和抗正常淋巴细胞抗体的生成情况：将淋巴瘤 Namalwa(IgHV1 家族)细胞、正常 IgHV3 家族 B 淋巴细胞、淋巴瘤 Daudi 细胞(非本文由探生科技技术人员提供，如果您想了解更多关于抗体的信息，可以访问 Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家查找相关资料,希望对您有帮助！6IgHV1、IgHV3 家族)及红白血病 K562 细胞（510 5/ml）离心机甩片，丙酮固定；将 5 组血清按一定比例稀释作为一抗，FITC 标记的兔抗小鼠免疫球蛋白（DAKO 公司）作为二抗，荧光
37、显微镜下读片。实验中设置 3 种阴性对照：以 1：40 稀释的免疫前小鼠血清作为一抗，一抗和二抗均用 PBS 代替，仅一抗用 PBS 代替。8. 双夹心 ELISA 法检测小鼠免疫后血清中 IFN- 含量。按照晶美公司试剂盒说明。9. 统计学处理：将各组的小鼠血清抗体滴度取负对数后，采用 t 检验进行比较。各组的小鼠血清的 IFN- 含量采用 t 检验进行比较。结 果1获得免疫球蛋白重链可变区基因片段：从脐带血免疫球蛋白基因文库中有 810 个IgHV3/pBluescript 克隆获得片段长度均介于 400500bp 之间 IgHV3 基因片段，克隆产物经 KpnI 和 EcoRI 酶切后出
38、现预期条带，选取 6 个片段长度差异较大的 IgHV3/pBluescript阳性克隆测序，测序结果显示获得了 IgHV3 基因家族不同的片段，主要差异位于 CDR3 区（序列图略） 。2生物信息资源分析选择 IgHV1、IgHV3：6 个新构建的 IgHV3/pBluescript 阳性克隆和本室保存的 6 个 IgHV1/pcDNA3.0 阳性克隆的 IgHV 基因和编码氨基酸序列在http:/www.ncbi.nlm.nih.gov /Igblast 基因库与胚系重链可变区序列比较同源性。Rammense 计算机评分系统预测这 12 个克隆的 T 细胞表位，积 21 分以上定为 T 细胞
39、表位。每个 IgHV1、IgHV3 基因上有分别受 HLA-A1、HLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA-A*26、HLA-A3、HLA-B*2705、HLA-B*4402、HLA-B*5101 和 HLA-B8 等位点限制的 T 细胞表位 30 个左右，其中 90以上的 T 细胞表位位于框架区，而且积分排位于前 10的 T 细胞表位都位于框架区。将分析到的 T 细胞表位所在序列与本课题组以往克隆的急性淋巴细胞白血病可变区序列 3及 Lefranc5报导的胚系可变区代表序列分析到的 T 细胞表位所在序列进行同源性分析，选择家族特异性、代表性的 IgHV1、IgHV3 序列各一构建表
40、达载体。3获得 IgHV1、IgHV3 家族特异性真核表达载体：IgHV1、IgHV3 各 1 个在多种 HLA 型别均具有较高积分 T 细胞表位的序列为模板，PCR 扩增其框架区基因片段，片段长度约350bp 左右，产物经 KpnI 和 EcoRI 酶切后，定向克隆到真核表达载体 pcDNA3.0 中，获得IgHV1(FR)/ pcDNA3.0 和 IgHV3(FR)/ pcDNA3.0，两者经 KpnI 和 EcoRI 酶切后出现预期条带（图 1，2） ，测序结果分别与 IgHV1/pcDNA3.0、IgHV3/pBluescript 测序结果比较，证实在 IgHV1(FR)/ pcDNA
41、3.0 和 IgHV3(FR)/pcDNA3.0 去掉了IgHV1/pcDNA3.0、IgHV3/pBluescript 的 CDR3 区，保留了其 FR 区，成功构建IgHV1、IgHV3 框架区组成的家族特异性真核表达载体。4获得 IgHV1、IgHV3 和细胞因子融合基因真核表达载体：经 PCR 获得在 5端包含编码 10 个氨基酸序列接头（linker）的 IgHV1(FR)和 IgHV3(FR)片段，长度约 380 bp 左右；同时经 PCR 获得在 3端包含编码 10 个氨基酸序列接头（linker）的 GM-CSF 和 IL-2 片段，片段长度分别为 418bp 和 429bp；
42、将 IgHV1(FR)和 IgHV3(FR)片段分别与 GM-CSF 和 IL-2 片段连接，经 PCR 扩增分别获得 IgHV1(FR)GM-CSF 、IgHV1(FR)-IL-2、 IgHV3(FR)-GM-CSF 和 IgHV3(FR)-IL-2 融合基因片段，片段长度约 800 bp，产物经 KpnI 和 EcoRI 酶切后，定向克隆到真核表达载体 pcDNA3.0 中，得到 IgHV1(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0、IgHV3(FR) -GM-CSF/pcDNA3.0、IgHV1(FR)-IL-2/pcDNA3.0 和 IgHV3(FR)-IL-2/pcDNA3.0。表达载
43、体质粒经 KpnI 和 EcoRI 酶切后出现预期条带（图 1，2） 。将融合基因质粒进行双向测序，结果本文由探生科技技术人员提供，如果您想了解更多关于抗体的信息，可以访问 Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家查找相关资料,希望对您有帮助！7显示融合基因序列完全正确，无移码突变和碱基错配。5IgHV1、IgHV3 和细胞因子融合基因真核表达载体可以在体外表达： ELISA 检测瞬时转染 COS 细胞 48 小时后培养上清中 GM-CSF 及 IL-2 的表达量（表 1） 。培养上清中IgHV1(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0 及 IgHV3(FR)-GM-CSF/pcD
44、NA3.0 中 GM-CSF 的表达量高于对照组空质粒 pcDNA3.0 200 倍以上；IgHV1(FR)-IL-2/pcDNA3.0 和 IgHV3(FR)-IL-2/pcDNA3.0中 IL-2 的表达量高于对照组空质粒 pcDNA3.0 60 倍以上。说明 IgHV1(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0和 IgHV3(FR)-GM-CSF/pcDNA3.0 可在体外暂时表达并分泌 GM-CSF; IgHV1(FR)-IL-2/ pcDNA3.0 和 IgHV3(FR)-IL-2/pcDNA3.0 可在体外暂时表达并分泌 IL-2。6.免疫动物血清抗体可识别同家族淋巴瘤细胞或者同家族
45、淋巴细胞的独特型抗原:5 组免疫动物第 2、4、6、8 周鼠血清与 IgHV1 家族淋巴瘤细胞系 Namalwa 细胞反应， IgHV1(FR)-IL-2 组在首次免疫后第 2 周开始检测到抗 Namalwa 细胞抗体，IgHV1(FR)组在首次免疫后第 4 周开始检测到抗 Namalwa 细胞抗体，IgHV3(FR)组、IgHV3(FR)-IL-2 组和pcDNA3.0 组小鼠的血清始终呈阴性反应；5 组免疫动物第 2、4、6、8 周鼠血清与 IgHV3 家族正常淋巴细胞系细胞反应， IgHV3(FR)-IL-2 组在首次免疫后第 2 周开始检测到抗体，IgHV3(FR)组在首次免疫后第 4
46、 周开始检测到抗体，IgHV1(FR)组、IgHV1(FR)-IL-2 组和pcDNA3.0 组小鼠的血清始终呈阴性反应；小鼠阳性血清分别与 K562 和 Daudi 细胞行间接免疫荧光检测不与 K562 和 Daudi 细胞反应（图 3） 。进行血清倍比稀释发现出现阳性反应的组在第 6 周时抗体滴度达到高峰，第 8 周开始下降（表 2,图 4,5） 。将第 1 组(IgHV3(FR)组)和第 2 组(IgHV3(FR)-IL-2 组)以及第 4 组(IgHV1(FR)组)和第 5 组(IgHV(FR)-IL-2 组)小鼠免疫后 6 周血清的抗体滴度取负对数行 t 检验，结果显示第 2 组抗体
47、滴度高于第 1 组,第 5 组抗体滴度高于第 4 组,差异具有统计学意义 P0.05(分别为 0.049825 和 0.024008)。 7. 免疫动物血清中 IFN- 含量的检测: IgHV1(FR)-IL-2 组和 IgHV3(FR)-IL-2 组与pcDNA3.0 组相比具有显著统计学差异, P 值分别为 0.000453 和 0.000959 ；IgHV1(FR)组和 IgHV3(FR)组血清中 IFN- 含量与 pcDNA3.0 组相比无统计学差异(P 值分别为 0.464644和 0.356843)（表 2） ；IgHV1(FR)-IL-2 组和 IgHV3(FR)-IL-2 组小
48、鼠血清中 IFN- 含量比IgHV1(FR)组和 IgHV3(FR)组高，差异具有显著统计学意义,P 值为 0.000134。讨 论尽管肿瘤的化疗和放疗取得了很大进展，但是这些疗法缺乏特异性，目前已经认识到，只有调动患者自身的免疫功能，才有望治愈肿瘤。肿瘤的免疫治疗需要了解肿瘤相关抗原。淋巴瘤表面特有的免疫球蛋白独特型抗原可以作为肿瘤抗原，诱导机体产生抗淋巴瘤的免疫反应。这种免疫反应的目标是针对独特型上的抗原决定簇。我们注意到 6，B 淋巴细胞依据免疫球蛋白重链可变区(IgHV)基因标记分类，可以分为 IgHV1-IgHV7个基因家族。正常人体内分属个家族的 B 细胞共同执行免疫功能，各占一定
49、的份额。如果某一家族的淋巴细胞克隆性扩张而且失控，会导致淋巴系统恶性肿瘤；如果各家族淋巴细胞所占份额异常，免疫反应失衡，也可能导致自身免疫疾病。淋巴瘤同样可以根据基因类型分成 7 个基因家族，利用这一特征有可能发展针对某一基因淋巴瘤的新型免疫治疗方法。各个 IgHV基因家族的框架区完全相同,CDR 有所不同。迄今许多人认为这些抗原决定簇主要位于免疫球蛋白可变区上的互补决定区（CDR） ，主要在 CDR3 区，每个淋巴细胞克隆都有不同的CDR3 区。如果希望利用诱导免疫反应的方法治疗淋巴瘤，必须为每例淋巴瘤患者制备不同本文由探生科技技术人员提供，如果您想了解更多关于抗体的信息，可以访问 Fantibody全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家查找相关资料,希望对您有帮助！8的 CDR3 序列上的抗原来诱发免疫反应。我课题组近期的工作发现，事实上独特型大部分抗原决定簇位于免疫球蛋白可变区（Ig
