1、1,第八章 微生物遗传变异 和菌种保藏,第一节 基本概念 第二节 遗传变异的物质基础 第三节 微生物的突变 第四节 微生物的基因重组 第五节 微生物遗传变异的应用 第六节 菌种的衰退、复壮和保藏,2,本章教学的目的与要求,1 理解遗传型与表型、遗传与变异等概念 2 熟悉三个经典实验的过程以及说明的问题 3 了解七个水平，熟悉其中相关概念 4 掌握基因突变类型、特点与机制 5 理解变量试验、涂布试验影印平板培养过程与说明问题 6 掌握细菌基因重组方法及类型 7 掌握菌种衰退的原因、菌种复壮和保藏的方法,3,第一节 基本概念,遗传（heredity） 生物在繁殖延续后代的过程中，亲代与子代之间性状
2、相似的现象，称遗传 性状：形态、结构、生态、生理、生化 变异variation 在生物繁殖过程中，子代与亲代或子代之间性状不同的现象，称为变异. 两者的关系 遗传保证了物种的存在和延续，保持了种属性状的相对稳定 变异推动了物种的进化和发展，产生变种和新种,4,第一节 基本概念,遗传型(genotype) 指某一生物个体所含有的全部遗传因子，即基因的总和. 表型(phenotype) 具有某遗传型的生物只有在适当的环境条件下，通过自身的代谢和发育，才能将它具体化，即产生表型 两者的关系,5,研究微生物遗传的意义,微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的生物学基本理论问题中最热衷的研究对象 对微生物
3、遗传规律的深入研究 促进了现代分子生物学和生物工程学的发展 为育种工作提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展,6,微生物的独特生物学特性,个体的体制极其简单 营养体一般都是单倍体 繁殖速度快 易于积累不同的中间代谢产物或终产物 菌落形态特征的可见性和多样性 环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性 易于形成营养缺陷型 各种微生物一般都有相应的病毒 存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式.,7,第二节 遗传变异的物质基础,三个经典实验遗传物质在细胞中存在的部位和方式,8,三个经典实验,转化实验（transforma
4、tion） 噬菌体感染实验 植物病毒的重建实验,9,1、转化实验 Transformation F.Griffith,转化 指A品系的生物吸收了来自B品系生物的遗传物质而获得了B品系的遗传性状的现象 实验者 F.Gruffith(1928)； O.T.Avery等(1944) 实验材料 肺炎链球菌 Streptococcus pneumoniae,10,1、转化实验 Transformation F.Griffith,细菌的特点 S型菌株：有致病性，有荚膜，菌落表面光滑 R型菌株：无致病性，无荚膜，菌落表面粗糙 组实验 动物试验 细胞培养试验 分离后S细胞物质对R细胞转化实验,11,1）动物试
5、验,12,动物实验结果与结论,结果 第一组：活S型细菌可以使白鼠死亡 第二组：活R型细菌不使白鼠死亡 第三组：加热杀死后S细菌，不使白鼠死亡； 加热杀死的S型和活R型细菌混合可使白鼠死亡 结论 R型菌株获得了S菌株的遗传性状，说明S菌株体内有一种“转化因子”,13,2）细胞培养实验,14,细胞培养实验结果,结果 第一组：活S型细菌使白鼠死亡，并从鼠体内分离到有毒细菌 第二组：活R型细菌不使白鼠死亡，并从鼠体内分离到无毒细菌 第三组：将S细菌型加热杀死，不使白鼠死亡，鼠体内无有毒细菌 第四组：将加热杀死的S细菌型和活R型细菌，使白鼠死亡，鼠体内分离到有毒细菌 结论 S型细菌存在的转化物质，通过某
6、种方式进入R型细胞内，并使R型细胞获得稳定的遗传形状 R-S,15,3）分离后的S细胞物质对R细胞的转化,16,不同成分转化试验结果与结论,结果 第一组：S菌多糖活R型细菌，不使鼠死亡 第二组：S菌蛋白质活R型细菌，不使鼠死亡 第三组：S菌RNA活R型细菌，不使鼠死亡 第四组： S菌DNA活R型细菌，鼠死亡 结论 只有S型中的DNA才能使R型转化为S型，RNA、多糖和蛋白质都不具备转化能力,17,1、转化实验 Transformation F.Griffith,实验（1）结论 R型菌株获得了S菌株的遗传性状，说明S菌株体内有一种“转化因子” 实验（2）结论 加热杀死的S型菌内可能存在一种转化物
7、质，通过某种方式进入R型细胞内,使R S 实验（3）结论 只有S型中的DNA才能使R型转化为S型，多糖和蛋白质都不具备转化能力,18,2、噬菌体感染实验,研究者 A.D.Hershey和M.Chase 实验材料 E. Coli、T2嗜菌体 实验原理 用同位素32P标记噬菌体的DNA、用同位素35S标记噬菌体的蛋白质，然后再感染宿主细胞 噬菌体侵染细菌时，只是把核酸注入到宿主体内，而把蛋白质外壳留在外面,19,2、噬菌体感染实验,实验过程 首先用含有32P和35S的培养基中培养大肠杆菌 用标记过的大肠杆菌培养T2噬菌体 再用标记过的T2噬菌体侵入没有标记的大肠，通过保温搅拌离心 检测上清和沉淀中
8、放射性元素的情况 结果 35S位于上清液中，而32P存在于底部 又一次证明：遗传物质是DNA，而不是蛋白质,20,3、病毒的拆开与重建实验,研究者 H. Fraenkel-Conrat和Singer(1956)(1956) 实验材料 烟草花叶病毒(TMV)和霍氏车前花叶病毒(HMV) 方法 将两病毒的核酸与衣壳蛋白分开 然后交叉重建成杂合病毒 做感染试验,观察所成病斑类型 再分离,21,实验说明 遗传物质是DNA而不是蛋白质,实验证明：遗传物质是RNA,22,结论,实验证实 细胞的遗传物质不是蛋白质或其他物质 细胞生物的遗传物质是DNA 病毒的遗传物质可以是DNA或是RNA,23,朊病毒的发现
9、和思考,朊病毒含有微量的核酸，仍未发现？ 朊病毒仅由蛋白质构成 朊病毒的遗传物质为蛋白质？,24,二、遗传物质在细胞内的存在形式,细胞水平 细胞核水平 染色体水平 核酸水平 基因水平 密码子水平 核苷酸水平,25,细胞水平,存在的部位 遗传信息绝大部分都集中在细胞核或核质体中 数目 原核微生物：球菌：单核杆菌：多有两核放线菌菌丝细胞是多核，孢子是单核 真核微生物：单核：酿酒酵母，真菌孢子多核：米曲霉，粗糙脉孢霉,26,细胞核水平,真核 有核膜，形成有完整形态的核 98%DNA在核内，与组蛋白结合形成染色体 10%的RNA存在于核内，90%存在于细胞质中 原核 无核膜，呈松散的核质体状态 染色质
10、不与蛋白结合 核外遗传物质,核外遗传物质,原核微生物,真核微生物,细胞质,2m质粒,R因子,COL质粒,巨大质粒,Ti质粒,降解性质粒,线粒体,叶绿体等,F因子,28,染色体水平,真核生物 染色体数目不同 染色体倍数不同 倍数：指同一细胞中染色体的套数 单倍体:一个细胞中只有一套相同功能的染色体 双倍体:一个细胞中有二套相同功能的染色体. 原核生物 仅有一条染色体，单倍体.,29,核酸水平,核酸种类 DNA：绝大多数生物的遗传物质 RNA：部分病毒 核酸的组成 真核：DNA总是缠绕着组蛋白，两者一起构成了复合物染色体 原核：DNA都是单独存在的,30,核酸水平,核酸结构 DNA：绝大多数是双链
11、，部分病毒是单链 RNA：绝大多数单链，少数是双链 核酸的长度 真核生物的DNA比原核生物的长得多 不同生物间的差别很大 核酸的形状 真核：核内DNA呈念珠状链，核外呈环状 原核：DNA呈环状，在细菌质粒中超螺旋 病毒粒：呈环状或线状,31,基因水平,基因 在生物体中，一切具有自主复制能力的遗传功能单位，都可称为基因 基因的物质基础是一个具有特定核苷酸顺序的核酸片段 基因的大小 分子量：一个基因6.7105 Da 碱基对：一个基因约有1000bp 数量：每个细菌约有500010000个基因,32,基因水平,原核生物基因的种类 启动基因(promotor) 转录的起始部位，是RNA聚合酶附着和启
12、动的部位 操纵基因(opera tor) 它能控制结构基因转录的开放或关闭 结构基因(structure gene) 通过转录和翻译过程来执行多肽(酶及结构蛋白)合成的 调节基因 它是调节结构基因的活动基因,33,密码子水平,遗传密码 是指DNA链上各个核苷酸的特定排列顺序 基本单位：密码子(codon) 每个密码子是由核酸分子上的3个核苷酸顺序所决定 三联密码子一般都是由mRNA上的3个核苷酸顺序表示 四种核苷酸组成的三联密码子数量 可达64种，决定20种氨基酸的合成,34,核苷酸水平,核苷酸 核苷酸是核酸组成的基本单位 种类 脱氧核糖核苷酸 腺苷酸(dAMP)、鸟苷酸(dGMP)、胸苷酸(
13、dTMP) 和胞苷酸(dCMP) 核糖核苷酸 AMP、GMP、UMP和CMP,35,第三节 微生物的突变,概念 基因突变体的主要类型 基因突变的特点 基因突变的机制,36,一、概念,突变(mutation) 指生物体内遗传物质发生数量或结构变化的现象 变异 由突变导致遗传性状改变叫变异 突变率 指每个细胞在每一世代中发生突变的概率 常用的基因突变符号,37,一、概念,突变的类型 基因突变(gene mutation）：是由于DNA链上的一对或少数几对碱基发生改变而引起的 染色体畸变(chromosomal aberration)：是DNA的大段变化(损伤)现象 表型(phenotype) 是指
14、可以观察或检测到的个体性状或特征，是特定的基因型在一定环境条件下的表现,38,一、概念,基因型（genotype) 指储存在遗传物质中的信息，即DNA碱基序列 野生型 未发生突变的从自然界分离到菌株 突变体 野生株经突变后带有新的遗传性状的菌株,39,二、突变体的主要类型,形态突变型 生化突变型 条件致死突变型 致死突变型,40,二、突变体的主要类型,形态突变型 指突变引起细胞形态变化或引起菌落形态改变 形态变化：细菌的鞭毛、芽孢或荚膜的有无 菌落形态：外形的光滑、粗糙和颜色的变异 生化突变型 指一类发生代谢途径变异但没有明显形态变化的突变型 常见有：营养缺陷型、抗性突变型发酵突变型、毒力突变
15、型,41,生化突变型,营养缺陷型 由基因突变而引起代谢过程中某种酶合成能力丧失的突变型，必须在原有培养基中添加细胞不能合成的营养成分才能正常生长 类型：氨基酸、维生素和嘌呤嘧啶缺陷型 抗性突变型 是一类能抵抗有害理化因素的突变型 类型：抗药性、抗紫外线和抗噬菌体等.,42,生化突变型,发酵突变型 指从不能利用到能够利用某种营养物质的突变型 毒力突变型 指突变后致病能力增强或减弱的突变型. 产量突变型 指产生某种代谢产物的能力增强或减弱的突变型,43,二、突变体的主要类型,条件致死突变型 指在某种条件下具有致死效应，而在另一条件没有致死效应的突变型 如温度敏感突变株 致死突变型 由于基因突变造成
16、菌体死亡或生活能力下降 双倍体生物能够以杂合子的形式存活下来，一旦形成纯合子，则发生死亡,44,三、基因突变的特点,随机性 稀有性 独立性 可逆性 稳定性,45,随机性,定义 各种性状的突变可以在没有任何人为的诱变因素处理的情况下，可以发生在生物的任何个体的发育时期及任何基因上 特点 自发性、随机性和不对应性. 三个经典实验 变量试验 涂布试验 平板影印培养试验,46,变量试验(fluctuation test),实验要点 利用E.coli 和T1噬菌体设计了试验 实验结果 甲管的50个皿中,各皿间抗性菌落数相差极大 而来自乙管的则各皿数目基本相同 实验说明 E.coli 抗噬菌体性状的产生，
17、并非由噬菌体T1诱导出来的，而是在它接触T1前，在某次分裂过程中自发产生的.,47,涂布试验（Newcombe experiment),实验要点 噬菌体对固体平板上的E.coli 的影响 实验结果 未涂布组共有抗性菌落28个 涂布组共有抗性菌落353个 实验说明 突变与噬菌体无关 涂布使抗性菌株均匀分布 抗性突变可在任何时间发生,48,影印培养实验（replica plating),实验要点 证明在一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法 实验结果 可在根本未接触链霉素的情况下,筛选出大量的抗链霉素的菌株 实验说明 微生物的抗药性突变是自发产生,与相应的环境因素毫不相关,49,
18、稀有性,定义 指生物的基因自发突变的频率较低且稳定 突变率 是每一个细胞在每世代中发生某一基因突变的几率 不同生物的突变率不同 细菌和噬菌体：10-410-10 高等动植物：10-510-8,50,独立性、可逆性、稳定性,独立性 每个突变体的发生是随机的、独立的、互不干扰的 可逆性 任何性状的突变型都具有可逆性 稳定性 突变株的遗传性状是稳定的、可遗传的,51,四、基因突变的机制,基因突变的概念 基因突变的类型 基因突变的机制 碱基置换 译码突变 染色体畸变,52,基因突变的概念,基因突变 基因突变是指DNA分子结构或数目的变化 自发突变、诱发突变 自发突变 在自然条件下自发进行的突变 引起自
19、发突变的原因 由背景辐射和环境因素引起 由微生物自身有害代谢产物引起 由DNA复制过程中碱基配对错误引起,53,基因突变的概念,诱发突变 是通过人为的方法，利用物理、化学或生物的因素而引起的突变 诱变剂：凡具有诱变效应的任何因素 诱变剂的种类 物理因素： UV、激光、离子束、X射线、射线、快中子 化学因素：亚硝酸、烷化剂、碱基类似物、吖啶类化合物,54,基因突变的机制,55,基因突变的机制,基因突变的机制 碱基置换 移码突变 染色体畸变,56,碱基置换(base substitution),定义 是DNA分子中的碱基对置换引起的 类型 转换（transition） DNA链中的一个嘌呤被另一个
20、嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 颠换（transversion） DNA链中的一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换,57,碱基置换(base substitution),引起碱基对置换的原因 互变异构 在DNA分子的四种碱基中，T和G可以酮式或稀醇式、C和A可以氨基式或亚氨基式出现,T：烯醇式,互变异构引起的碱基对置换,T,A,颠换,59,引起碱基对置换的原因 化学诱变剂 是一类可直接或间接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，不论在机体内或在离体条件下均有作用 诱变剂种类 间接引起置换诱变剂：碱基结构类似物 直接引起置换诱变剂：亚硝酸、羟胺和各种烷化剂,碱基置换(base su
21、bstitution),60,间接引起置换的诱变剂,碱基结构类似物 诱变剂的结构与碱基结构类似种类 5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-脱氧尿嘧啶（5-dU） 8-氮鸟嘌呤（8-NG）、2-氨基嘌呤（2-AP）、6-氯嘌呤（6-CP） 作用机制 通过细胞的代谢活动掺入到DNA分子中后而引起碱基置换，故是间接的,61,亚硝酸 可使含有氨基的碱基发生氧化脱氨作用 羟胺 专一性地与胞嘧啶C反应，使其能与腺嘌呤A配对，使G-C转换为A-T 各种烷化剂 可以与核苷酸分子中的磷酸基、嘌呤、嘧啶等起烷化作用，造成DNA功能损伤和改变,直接引起置换的诱变剂,62,碱基置换(base substitution),由碱
22、基置换引起的3种突变型 同义突变 不影响蛋白质中氨基酸的组成 错义突变 引起蛋白质中氨基酸的组成发生改变 无义突变 变成终止密码子，使其不能合成完整的多肽,63,移码突变(frame-shift mutation ),定义 指DNA分子中增添或缺少几个碱基对，而造成其后面全部全部遗传密码发生转录和翻译错误的基因突变 突变程度 突变点后的所有密码子都发生改变 产生移码突变株 种类 自然产生：发生于减数分裂时期 人工诱变产生：一般用吖啶类诱变剂,64,染色体畸变(chromosomal abrration),定义 由于某些理化因素的作用，造成DNA分子的大损伤所引起的突变 染色体结构的变化形式 染
23、色体内畸变 缺失、重复、插入、易位、倒位 染色体间畸变 指非同源染色体间的易位,65,染色体畸变(chromosomal abrration),物理诱变剂诱变的机制 紫外线：可引起DNA碱基对的变化 变化方式 DNA链的变化：DNA链的断裂或链间的交联 相邻嘧啶会形成嘧啶二聚体和水合物 X射线、射线和快中子 直接作用：使硷基间、DNA间、糖与糖酸间化 学键断裂 间接作用：自由基导致DNA分子不同程度损伤,66,染色体畸变(chromosomal abrration),物理诱变剂诱变的机制 热 可引起碱基变性导致碱基配置错误 生物诱变因子 可以在基因组的任何部位插入，引起基因的失活，而导致突变
24、转座子：是自然界固有的生物诱变因子，是细胞中能改变自身位置的一段DNA序列,67,第四节 微生物的基因重组,基因重组 原核微生物的基因重组 真核微生物的基因重组,68,基因重组（gene recombination）,基因重组 凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式. 特点 在离体条件下对DNA分子切割并与载体DNA分子连接，从而得到重组DNA 重组方式,69,基因重组（gene recombination）,重组方式,原核基因重组,真核基因重组,转化,有性杂交,原生质体融合,接合,转导,准性杂交,基因重组方式,70,原核微生物的基因重组,
25、转化 转导 结合 原生质结合,71,原核微生物的基因重组,特点 片段性：仅一小段DNA序列参与重组 单向性：即从供体菌向受体菌作单方向转移 转移机制独特而多样，如接合、转化和转导 共同之处 基因的转移，导致了遗传重组 不同之处是 转化是通过裸露的DNA 转导则需要噬菌体作媒介 接合是通过细菌间的直接接触,72,转化(transformation),转化 受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换，把它组合到自己的基因组中，从而获得了供体菌的部分遗传性状的现象 受体菌(recipient/receptor):转化基因的接受者 供体菌(donor):转化基因的提供者 转化子（transfor
26、mant ） 转化成功的菌株成为转化子 转化因子 来自供体菌的具有转化活性的外源DNA片段,原核微生物的基因重组,73,转化(transformation),转化发生的条件 转化因子 同源性 分子质量大小适宜 受体菌 需处于感受态 感受态出现的因素 菌龄 感受态因子出现 培养条件,原核微生物的基因重组,74,转化(transformation),转化发生的过程 吸附 切割 入胞 重组 复制 转化子形成,原核微生物的基因重组,75,转导（transduction）,转导 以缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传形状的现象称为转导 转导子
27、（transductant）：获得新遗传性状的受体细胞 转导噬菌体：携带供体部分遗传物质的噬菌体 转导种类 普遍性转导 局限性转导,原核微生物的基因重组,76,普遍性转导(generalized transduction),定义 指供体菌中任何部位的基因都能被某一噬菌体携带并传递给受体菌的转导 普遍性转导的类型 完全普遍性转导 流产普遍性转导,原核微生物的基因重组,77,普遍性转导(generalized transduction),完全普遍传导(complete transduction) 进入受体菌的供体菌的DNA片段与受体菌染色体同源区段配对，通过双交换整合在染色体上，随受体菌的分裂，每
28、个子细胞都含有这个片段 特点 以其野生型菌株作为供体菌 营养缺陷型菌株作为受体菌 噬菌体作为转导媒介，对供体菌是烈性噬菌体，对受体菌是温和噬菌体,原核微生物的基因重组,78,普遍性转导(generalized transduction),流产普遍传导(abortive transduction) 进入受菌体的供体菌DNA片段不与受菌体染色体整合，也不能复制，仅能转录而得到表达 特点 细胞进行分裂时,只能将这段DNA分配给一个子细胞，另一子细胞只获得供体基因的产物-酶 能在选择性培养基平板上形成微小菌落 供体菌DNA片段不与受体菌染色体整合 不可自我复制,原核微生物的基因重组,79,局限性转导(
29、specialized transduction ),定义 通过某些部分缺陷的温和噬菌体，将供体菌的少数特定基因携带到受体菌的转导 根据转导频率的高低可分为 低频传导(low frequancy transduction ,LFT) 通过溶原菌释放的噬菌体所进行的转导，只能形成极少数的转导子 高频传导(high frequancy transduction ,HFT) 通过双重溶原菌释放的噬菌体所进行的转导，形成的转导子的频率很高,原核微生物的基因重组,80,局限性转导(specialized transduction ),特点 仅转导供体菌少量特定基因 该特定基因由部分缺陷温和噬菌体携带 缺
30、陷温和噬菌体是由于误切所致，或由于双重溶源菌的裂解而形成 局限转导噬菌体的产生要通过UV等因素对溶源菌的诱导并引起裂解后才产生,原核微生物的基因重组,81,接合（conjugation）,接合 通过供体菌和受体菌完整细胞间的直接接触而传递大段DNA的过程称为接合 接合子：获得新性状的受体细胞称为接合子 接合及其发现 研究细菌接合方法的基本原理 通过U形管证实：接合需要细胞的直接接触 能进行接合的微生物种类 细菌：以G-的肠道菌为常见 放线菌：链霉菌属、诺卡氏菌属及天蓝色链霉菌,原核微生物的基因重组,82,大肠杆菌的接合,F因子(fertility factor) 是一种独立于染色体的小型环状D
31、NA 具有自主的与染色体进行同步复制和转移到 其它细胞中去的能力 凡有F因子的菌株称为雄性菌株，其细胞表面产生14条中空而细长的丝状物,称为性菌毛 根据F因子的有无，将E. coli分为四种 F+菌株 、F-菌株、Hfr菌株和F菌株,原核微生物的基因重组,83,大肠杆菌的接合,F因子与接合菌株 F+菌株 雄性菌株，细胞内存在游离F因子，细胞表面有与F因子数相当的性菌毛 具有与雌性菌株相结合且使其获得F因子 F-菌株 雌性菌株，胞内无F因子和胞表面无性菌毛，但可获得F因子 F+菌株和F-菌株结合过程 还可接受来自Hfr菌株的一部分或全部染色体信息,原核微生物的基因重组,84,大肠杆菌的接合,F因
32、子与接合菌株 Hfr菌株 雄性高频重组菌株，胞内存在与染色体整 合的F因子 与雌性菌株接合可产生高频重组子而得名 Hfr菌株和F-菌株结合过程 F菌株 由不正常切割而形成特殊F因子，即携带有小段染色体基因 F因子传导：利用F菌株与F接合可将供体染色体DNA传入F 菌株,原核微生物的基因重组,85,四种菌株的接合传递图,与Hfr接合,原核微生物的基因重组,86,真核微生物的基因重组,有性生殖 准性生殖,87,有性生殖,定义 一般指性细胞之间的结合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术 产生于两个单倍体核之间 通过质配、核配、减数分裂 酿酒酵母的基因重组 酿酒酵母的生活史,88,
33、准性生殖（parasexual eproduction）,定义 同种生物的两个不同的体细胞发生融合，不经减数分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子的杂交方式 基本过程 菌丝连接 形成异核体 核融合 体细胞交换,89,90,接 合,91,第五节 微生物遗传变异的应用,诱变育种 原生质体融合育种 基因工程,92,诱变育种,自发突变与育种 诱变育种 营养缺陷型的筛选,93,自发突变与育种,生产中选育菌种 自发突变与丰富实际经验和细致观察及抓住良机，选育优良的生产菌株 定向选育 选用某一特定因素，长期处理某一微生物的培养物，同时不断地连续传代，以达到累积相应自发突变株 被动的育种方法，费时费力，
34、而且结果难以预测，育种过程缓慢,94,梯度平板法gradient plate,梯度平板法gradient plate,95,96,诱变育种,诱变育种 是通过人工的方法处理微生物使之发生突变，并运用合理的筛选程序和方法，把适合人类需要的优良菌种筛选出来的过程 实践意义 提高生产性能与改善产品质量 扩大品种与简化生产工艺 方法简便易行、条件和设备要求简单,97,诱变育种的一般方法,出发菌株的诱变处理 突变体的筛选,98,出发菌株的诱变处理,出发菌的选择原则 具有优良性状的菌株 对诱变剂敏感的菌株 以单倍体纯种为出发菌 诱变剂的选择原则 在同样效果下选用最方便的 在同样方便的情况下选择最高效的因素
35、充分利用复合处理的协同作用,99,出发菌株的诱变处理,选用最适的诱变剂量 剂量：一般指强度与作用时间的乘积 表示方法：常采用杀菌率来作各种诱变剂的相对剂量 诱变剂的剂量对产量变异的影响 正变较多地出现在偏低的剂量中 而负变则较多地出现于偏高的剂量中 经多次诱变而提高产量的菌株中，更容易出现负变,100,突变体的筛选,初筛 目的：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来 方法：一般通过平板稀释法获得单个菌落，然后对菌落进行相关性状的初步筛选 复筛 目的：对初筛出的菌株的有关性状作精确的定量测定，然后经过小试、中试，才能用于生产 方法：一般是将微生物摇瓶培养，然后再对培养液
36、进行分析测定,101,诱变育种选育的突变株的基本环节,102,营养缺陷型的筛选,营养缺陷型 是指通过诱变产生的，在某些营养物质的合成能力上出现缺陷，必须在培养基中加入相应的有机营养成分才能生长的变异菌株 营养缺陷型突变株的应用 科学研究 生物测定 生产菌株,103,与营养缺陷型突变有关的三类遗传型个体,野生型 从自然界分离到的任何微生物在其发生营养缺陷突变前的原始菌株 营养缺陷型 经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株 原养型 营养缺陷型突变经回变或重组后产生的菌株，营养要求在表型上与野生型相同,104,与营养缺陷型菌株筛选有关培养基,基本培养
37、基（M.M，minimal medium） 含有能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基“用”表示 完全培养基（C.M，complete medium） 满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。用“”表示 补充培养基（S.M，supplemental medium） 在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。用A或B表示,105,营养缺陷型的筛选方法,中间培养 分离突变核和未突变核 选择合适的培养基 淘汰野生型 抗生素法 菌丝过滤法 梯度培养法 差别杀菌法,106,营养缺陷型的筛选方法,检出缺陷型 点种法 夹层培养法 限量补充培养法 影印接种
38、法 鉴定缺陷型 生长谱法,107,原生质融合育种（protoplast fusion）,原生质融合 通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子的过程 所获得的重组子叫融合子（fusant） 适用范围 原核生物和各种真核微生物和高等植物细胞,108,原生质融合育种（protoplast fusion）,原生质体融合的优点 可以实现远缘菌株间的基因重组 杂交频率较高 可进行多亲本融合 遗传物质的传递更为完整 通过原生质体融合提高产量,109,原生质融合育种的步骤,选择亲本 亲株均要有一定的遗传标记、标记必须稳定 原生质体的
39、制备 在高渗溶液中选择适当的方法去除细胞壁 细菌和放线菌主要采用溶菌酶 酵母菌和霉菌一般用蜗牛酶和纤维素酶 影响原生质的制备的因素 菌体的前处理、培养时间 、酶浓度 、酶降解的温度 、酶降解的时间 、渗透压稳定剂,110,原生质融合育种的步骤,原生质体的再生 使原生质体恢复细胞壁，并能进行生长和繁殖 原生质再生率的计算影响因素 本身的再生特性 原生质的制备条件 再生培养基的成分 再生的培养条件,原生质再生率=,破壁前菌数-剩余菌数,再生菌数-剩余菌数,100%,111,原生质融合育种的步骤,原生质体的融合 选用恰当的方法，促使原生质的融合 融合的方法 化学助融：加入助融剂 物理助融：离心、电脉
40、冲、激光等方法 生物助融：生物提取物,112,原生质融合育种的步骤,融合子的检出与鉴定 检出 直接检出法 间接检出法 鉴定 形态学 生理生化 遗传学 生产性能,113,第六节 菌种的衰退 复壮和保藏,菌种的衰退与复壮 菌种的保藏 国内外菌种保藏部分情况,114,菌种的衰退与复壮,衰退（degeneration） 菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退 衰退的原因 基因突变 对菌种工作放任自流 盲目传代 不搞纯化与复壮育种等,115,菌种的衰退与复壮,菌种衰退的现象 菌落和细胞形态的改变 生长速度缓慢，产孢子越来越少 抵抗
41、力、抗不良环境能力减弱等 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降,116,菌种的衰退与复壮,菌种衰退的防止 控制传代次数 创造良好的培养条件 利用不同类型的细胞进行接种传代 采用有效的菌种保藏方法,117,菌种的衰退与复壮,菌种的复壮 复壮 使衰退的菌种恢复原来的优良性状 复壮的类型 狭义的复壮 从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施 广义的复壮 在尚未衰退前经常进行菌种分纯、性能测定或利用选择性培养基等措施确保菌种性状保持与日益巩固,118,菌种的衰退与复壮,菌种的复壮的措施 纯种的分离 把退化菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，经扩大培养，就可
42、恢复原菌株的典型性状 常用的分离纯化的方法：平板稀释法、单细胞或单孢子分离法等 通过寄主体进行复壮 对于寄生性的退化菌株，可回接到相应寄主体，以恢复或提高其寄生性能 淘汰已衰退的个体,119,菌种的保藏,原理 选典型菌种的优良纯种，创造降低微生物代谢活动强度、生长繁殖受抑制及难以发生突变的环境条件 环境要素：干燥、低温、缺氧、无营养、避光以及添加保护剂等 任务 收集实验与生产菌种、菌株；确保其不死、不衰、不乱及便于研究、交换和使用的目的,120,菌种保藏的方法,低温保藏法 冷藏法 斜面菌种：45，一般36个月移植一次 半固体穿刺接种：于普通冰箱，可612个月移植一次 低温法 -20左右 超低温
43、法 -70、-150-196 保藏期长达数年至数十年,121,菌种保藏的方法,隔绝空气保藏法 石蜡油封藏法 在培养好的菌种管内加上灭菌石蜡油 可保存12年 橡皮塞密封保藏法 用橡皮塞代替棉塞用固体石蜡封口，4保存 琼脂柱穿刺封口 穿刺培养 石蜡油封闭,122,菌种保藏的方法,干燥保藏法 原理：断绝水分、降低代谢活动 方法 砂土管保藏法：将干燥砂粒与细土混合后灭菌制成砂土管,然后接种保藏，保藏期110年 真空冷冻干燥法：在低于-15下,快速将细胞冻结, 并保持细胞完整，然后在真空中使水分升华至干,123,菌种保藏的方法,寄主保藏法 此法适用于专性活细胞寄生物 方法 连续在培养基上 连续在活宿主上
44、,124,国内菌种保藏部分情况,中国微生物菌种保藏管理委员会(CCCCM) 普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC) 中科院微生物所,北京(AS),真菌、细菌; 中科院武汉病毒研究所,武汉(AS-IV),病毒 工业微生物菌种保藏管理中心(CICC) 轻工业部食品发酵工业科学研究所, 南京(ID),真菌; 卫生部药品生物制品检定所,北京(NICPBP),细菌； 中国医学科学院病毒研究所,北京(IV),病毒,125,国内菌种保藏部分情况,中国微生物菌种保藏管理委员会(CCCCM) 农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC) 中国农业科学院土壤肥料研究所,北京(ISF) 抗菌素菌种保藏管理中心(CACC) 中国医学科学院抗菌素研究所北京(IA)； 四川抗菌素工业研究所,成都(SIA),新抗菌素菌种; 华北制药厂抗菌素研究所,石家庄(IANP),生产用抗菌素菌种 兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC) 农业部兽医药品监察所,北京(CIVBP),126,国外菌种保藏部分情况,美国的“美国典型菌种收藏所”(ATCC) 美国“农业研究服务部菌种收藏所”(ARS) 荷兰“真菌中心收藏所”(CBS) 日本“大阪发酵研究所”(IFO) 法国“里昂巴斯德研究所”(IPL) 西德 “柯赫研究所”(RKI) 苏联“苏联科学院微生物研究所”(IM),127,128,
