1、学校代码：10251 学 号：030130968硕 士 学 位 论 文题 目 L-赖氨酸脱羧酶的酶学性质及其应用研究专 业 生物化工研究方向 生物催化姓 名 寇凤雨导 师 叶勤 教授定稿日期：2016 年 5 月 16 日分类号： Q81 密级： U D C： 华 东 理 工 大 学学 位 论 文L-赖氨酸脱羧酶的酶学性质及其应用研究寇凤雨指导教师姓名： 叶勤 教授 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室孙际宾 研究员 中国科学院天津工业生物技术研究所申请学位级别： 硕士 专 业 名 称： 生物化工论文定稿日期： 2016-5-16 论文答辩日期： 2016-5-18学位授予单位： 华 东
2、理 工 大 学学位授予日期： 答辩委员会主席：钟建江 教授评 阅 人：郑平 研究员吴辉 副教授华东理工大学研究生学位论文提交要求根据校学位评定委员会要求，研究生学位论文全文（含纸质版和电子版）必须提交档案馆保存。研究生学位论文全文电子版由档案馆按 （选择以下一项）方式，转交或不转交图书馆，并提供公开阅览服务 。 可以公开 3 年后公开 10 年后公开 不公开注：选择、或的需经学校国家技术转移中心备案，以为学校技术转移提供服务。学位论文作者签名： 指导教师签名：年 月 日 年 月 日国家技术转移中心负责人签名：（公章）年 月 日作 者 声 明我郑重声明：本人恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学
3、位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的结果。除文中明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何他人已经发表或撰写过的内容。论文为本人亲自撰写，并对所写内容负责。论文作者签名： 年 月 日华东理工大学硕士学位论文 第 I 页L-赖氨酸脱羧酶的酶学性质及其应用研究摘要赖氨酸脱羧酶(LDC) 能够催化 L-赖氨酸脱羧生成 1,5-戊二胺和二氧化碳，是生物戊二胺合成途径中的关键酶。其催化产物 1,5-戊二胺(Cadaverine)是一种广泛存在于动物、植物和微生物中具有生物活性的含氮碱性有机化合物，工业上可用于合成高性能尼龙材料。挖掘具有高催化活性、高 pH 稳定性、热稳定性好的 LDC
4、对戊二胺工业化生产具有重要的意义。本课题利用数据库酶基因挖掘技术，获得 24 个不同来源的 LDC 候选酶，并克隆表达了来源于 E. coli 的 CadA 和 LdcC 作为对照，进行酶学性质表征。通过优化诱导表达条件，筛选出 10 个能够稳定表达的 LDCs，其中来源于 Photobacterium angustum、 Aliivibrio salmonicida、 Edwardsiella tarda 的 PaLdc、AsLdc 和 EtLdc 酶活性较高。纯化了 LDC，并测定了纯酶的酶学性质。发现 CadA、LdcC、PaLdc、AsLdc 和 EtLdc 的最适 pH 分别为5.5
5、、7.5、6.5、7.5、7.0。随着 pH 升高至 8.5 的碱性条件时， AsLdc 和 EtLdc 仍分别保持45.6%和 42.5%的相对活性，而 CadA、LdcC 和 PaLdc 的相对活性分别降低至 7%、26.8%和 5.2%。在各自最适 pH 下 CadA、LdcC 、PaLdc、AsLdc 和 EtLdc 的最适反应温度分别为 50C、55C、60C 、50C 和 60C。经 50C 孵育 12 小时后，CadA、 LdcC、PaLdc、AsLdc 和 EtLdc 分别能够保持 50.8%、0%、61.7%、75.2%和 46.3%的相对活性,这表明 LdcC 具有热不稳定
6、性。CadA、LdcC、PaLdc 、AsLdc 和 EtLdc 对底物L-赖氨酸的 Km 分别为 0.75 mM、1.24 mM、1.15 mM、0.94 mM、0.68 mM。通过测定不同浓度戊二胺对 LDCs 的抑制，发现 4-6 mM 的戊二胺即可抑制 LDC 约 50%的酶活力。采用蛋白质活性电泳和动态光散射方法研究了在不同 pH 下 LDC 的多聚体状态。结果表明 AsLdc 和 CadA 在各自最适 pH 下十聚体的比例最大，因此推测十聚体形式很可能是 AsLdc 和 CadA 酶活力最高的聚合形式。研究说明 pH 可以调控 LDC 的多聚体状态，而多聚体状态则会影响 LDC 的
7、酶活力。最后，对 AsLdc 和 CadA 在 1 L 发酵罐水平进行全细胞催化生产 1,5-戊二胺，当控制催化反应 pH 为 5.5，催化 7 小时后，AsLdc 和 CadA 的催化效率相当。当控制催化反应pH 为 7.5，催化 7 小时后，AsLdc 和 CadA 的底物转化率分别为 100%和 82.8%，戊二胺摩尔产率分别为 96.9%和 97.5%。研究结果表明 AsLdc 在偏碱的环境下具有更高的催化性能，可大大减少生产过程中的酸用量，有望为工业化生产 1,5-戊二胺提供催化性能优越的新酶源。关键词：赖氨酸脱羧酶；1,5-戊二胺；基因挖掘；酶学表征；全细胞催化第 II 页 华东理
8、工大学硕士学位论文Enzymatic Properties of L-Lysine Decarboxylase and its Application in Cadaverine ProductionAbstractLysine decarboxylase (LDC) is the key enzyme of cadaverine biosynthesis pathway, catalyze the conversion of L-lysine to cadaverine and carbon dioxide.The catalytic product cadaverine widely ex
9、ists in animals, plants and microorganisms. It is a bioactive nitrogenous alkaline organic compound, has extensive application in industry for synthesis of high performance nylon material. Therefore, a good LDC having high catalytic activity, high pH stability and thermal stability is of great impor
10、tance for the development of industrial production and application of cadaverine.In the present thesis, 24 LDC candidates from different sources, together with two equivalents E. coli CadA and LdcC as control, were selected by using database enzyme mining method. Cloning of these enzymes were carrie
11、d out in E. coli,.and 10 LDCs were successfully and stably expressed by induction optimization. Among them, three enzymes from Photobacterium angustum, Aliivibrio salmonicida, Edwardsiella tarda, abbreviated as PaLdc, AsLdc and EtLdc, respectively, were found to exhibit higher enzyme catalytic activ
12、ity to L-lysine, and thus were further purified for characterization. The optimum pH of CadA, LdcC, PaLdc, AsLdc and EtLdc are 5.5, 7.5, 6.5, 7.5, 7.0, and the maximum enzyme activity are 171.6, 51.5, 176.3, 205.1, 141.9Umg-1, respectively.Under alkaline condition such as pH 8.5, AsLdc and EtLdc sti
13、ll showed residual relative enzyme activities of 45.6% and 42.5%, respectively, whereas CadA, LdcC and PaLdc reduced to 7%, 26.8% and 5.2% of their relative activities, respectively. The optimum temperatures of CadA, LdcC, PaLdc, AsLdc and EtLdc under each optimum pH condition were 50 C, 55 C, 60 C,
14、 50 C and 60 C, respectively. After incubated at 50 C for 12 hours, CadA, LdcC, PaLdc, AsLdc and EtLdc kept 50.8%, 0%, 61.7%, 75.2% and 46.3% of relative activity, respectively, and this indicating the LdcC is thermal labile. Km values of L-lysine of the five enzyms were 0.75 mM, 1.24 mM, 1.15 mM, 0
15、.94 mM and 0.68 mM, respectively. Inhibition effect of different cadaverine concentrations on LDCs were determined and found that about 4-6 mM cadaverine inhibited 50% of their activity.Moreover, the relationship among oligomeric state of the LDCs, pH value and the activity was studied by using nati
16、ve PAGE electrophoresis and dynamic light scattering method. The highest proportion of AsLdc decamer was observed at pH 7.5, which agrees well with the fact that the highest activity of AsLdc appears at pH 7.5. Similarly, the highest percentage of CadA decamer was observed at its optimum pH of 5.5.
17、Therefore, the decamer state is likely the most 华东理工大学硕士学位论文 第 III 页active form of AsLdc and CadA. The results suggested that pH may contribute to the stabilization of oligomeric states of LDCs and further affect their activities.Finally, whole-cell catalysis with the novel enzymes AsLdc and CadA wa
18、s carried out in a 1L fermentor. AsLdc and CadA showed similar catalytic efficiency at pH 5.5 after 7 hours reaction, with substrate conversion efficiency at 91.4% and 92.6%, and cadaverine molar yield at 98.6% and 98.5%, respectively. AsLdc showed a better catalytic ability at more alkaline pH such
19、 as pH 7.5, with substrate conversion efficiency at 100% and 82.8%, and cadaverine molar yield 96.9% and 97.5%, after 7 hours reaction. The results indicated that AsLdc has an obvious advantage for catalysis under alkaline condition, which would significantly reduce the acid usage in industrial cata
20、lytic production of cadaverine , therefore reduce the negative influence on environment. Keywords: Lysine decarboxylase; 1,5-pentanediamine; Gene mining; Characterization of enzymatic properties; Whole-cell catalysis第 IV 页 华东理工大学硕士学位论文目录第 1 章 前言 .11.1 L-赖氨酸脱羧酶 (LDC) .11.1.1 LDC 生物学功能11.1.2 LDC 在生物催化
21、领域的应用21.1.3 LDC 的来源及理化性质31.1.4 LDC 酶活测定方法41.2 LDC 的多聚体结构及酶分子改造.41.2.1 LDC 的结构与功能的关系51.2.2 LDC 的酶分子改造61.3 戊二胺概述71.3.1 戊二胺的理化性质.71.3.2 戊二胺的制备方法.71.3.3 戊二胺的应用.81.4 本课题的研究目的及意义81.5 本课题的研究内容9第 2 章 L-赖氨酸脱羧酶的克隆与表达 .102.1 引言102.2 实验材料102.2.1 菌株及质粒 LDC 生物学功能.102.2.2 仪器及设备.112.2.3 培养基.132.2.4 溶液.142.3 实验方法142
22、.3.1 菌种活化培养.142.3.2 大肠杆菌基因组 DNA 提取 152.3.3 目的基因的克隆.152.3.4 质粒构建.162.3.5 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化.172.3.6 转化子的验证.182.3.7 基因挖掘.182.3.8 全基因合成.19华东理工大学硕士学位论文 第 V 页2.3.9 蛋白诱导表达.192.3.10 BCA 蛋白质定量 .202.3.11 SDS-PAGE 电泳检测 202.3.12 LDC 酶活力测定方法202.4 结果与讨论222.4.1 CadA 与 LdcC 过表达质粒的构建 .222.4.2 不同来源的赖氨酸脱羧酶的克隆及筛选.222.4.3
23、 LDC 在大肠杆菌中的诱导表达232.4.4 LDC 粗酶活性比较242.5 本章小结26第 3 章 L-赖氨酸脱羧酶酶学性质研究 .273.1 引言273.2 实验材料273.2.1 菌株及质粒.273.2.2 仪器及试剂.273.2.3 培养基.273.2.4 溶液.273.3 实验方法283.3.1 蛋白诱导表达及纯化.283.3.2 LDC 最适 pH、最适温度测定方法 283.3.3 LDC 热稳定性测定方法293.3.4 LDC 热变性测定方法293.3.5 LDC 动力学参数测定方法293.3.6 戊二胺抑制曲线测定方法.293.4 结果与讨论293.4.1 LDC 在大肠杆菌
24、中的诱导表达及纯化293.4.2 LDC 的最适 pH 和最适温度 .313.4.3 LDC 的热稳定性323.4.4 LDC 的动力学常数343.4.5 戊二胺抑制曲线的测定.353.5 本章小结36第 4 章 L-赖氨酸脱羧酶的多聚体状态表征 .384.1 引言384.2 实验材料384.2.1 菌株及质粒.38第 VI 页 华东理工大学硕士学位论文4.2.2 仪器及试剂.384.2.3 溶液.394.3 实验方法394.3.1 蛋白质活性电泳.394.3.2 动态光散射.394.4 结果与讨论404.4.1 蛋白质活性电泳测定 LDC 多聚体状态.404.4.2 动态光散射测定 LDC
25、的多聚体状态.404.5 本章小结42第 5 章 L-赖氨酸脱羧酶全细胞催化评价 .435.1 引言435.2 实验材料435.2.1 菌株及质粒.435.2.2 仪器及试剂.435.2.3 培养基.435.2.4 溶液.435.3 实验方法445.3.1 种子培养.445.3.2 重组菌诱导表达.445.3.3 全细胞催化.445.3.4 SDS-PAGE .445.3.5 戊二胺浓度测定.455.3.6 赖氨酸含量测定.455.4 结果与讨论455.4.1 摇瓶水平全细胞催化.455.4.2 发酵罐水平全细胞催化.475.5 本章小结49第 6 章 结论与展望 .516.1 主要结论516
26、.2 论文创新点526.3 今后工作展望52参考文献 .53硕士在读期间撰写的论文 .60华东理工大学硕士学位论文 第 VII 页致谢 .61华东理工大学硕士学位论文 第 1 页第 1 章 前言1.1 L-赖氨酸脱羧酶(LDC)L-赖氨酸脱羧酶 (L-lysine decarboxylase，简称 LDC，EC 4.1.1.18)能够催化 L-赖氨酸脱羧生成 1,5-戊二胺( 简称尸胺)和二氧化碳，是生物体内戊二胺合成途径中的关键酶。LDC 对底物具有高度的专一性，并以磷酸吡哆醛(PLP)作为辅酶对 L-赖氨酸进行脱羧反应，其反应如图 1.11。图 1.1 L-赖氨酸脱羧反应Fig. 1.1
27、Reaction of L-lysine decarboxylate1.1.1 LDC 生物学功能L-赖氨酸脱羧酶在微生物细胞生长过程中起着重要作用，其脱羧赖氨酸催化生成的戊二胺是具有生物活性的含氮碱性有机物。戊二胺和腐胺、亚精胺、精胺等统称为多胺 2，广泛存在于植物、动物、微生物及病毒中 3。研究表明多胺在生命过程中起着重要的生理作用 4。LDC 的生理功能主要有以下几点：(1) LDC 脱羧生成的戊二胺与 DNA、RNA 等相互作用，其带正电荷的氨基与核酸上带负电的磷酸基团相结合可以稳定核酸结构，对 DNA 的复制、基因转录和翻译具有重要的调节作用 5，但具体作用机制尚不清楚。(2) 在生
28、物胞内，LDC 脱羧产生的戊二胺是调节铁离子浓度的“铁亲和系统”的主要组成成分，而这种系统对铁离子具有高亲和力 6-8。高浓度的铁对细胞具有毒害作用，因此胞内铁同化系统对胞内铁离子浓度具有严格的控制 9-13。LDC 脱羧赖氨酸形成戊二胺，戊二胺是形成铁载体的前体，6 个戊二胺单体形成一个复杂的八面体结构去铁胺 B，如图 1.2，而铁离子浓度又能够调节 LDC 基因的表达，所以生物体可以通过调控 LDC 的表达来调节胞内铁离子浓度 14。第 2 页 华东理工大学硕士学位论文图 1.2 L-赖氨酸到去铁胺 B 的生物合成 7Fig. 1.2 Biosynthesis of desferrioxa
29、mine B from L-lysine7(3) LDC 脱羧产生的戊二胺可以和氧自由基反应，帮助消除生物体内自由基对机体的损伤，从而保护微生物细胞免受氧的毒害 15-18。 (4) 内源性的 LDC 脱羧作用以及胞内高浓度戊二胺的积累可导致外膜渗透性降低，从而对某些抗生素，如氨基糖苷类和头孢霉素类抗生素具有抑制作用 19-22。(5) 当微生物在 pH 3.0-5.0 的环境面临酸胁迫时，LDC 脱羧产生的戊二胺可以通过戊二胺- 赖氨酸转运蛋 CadB 高效地将戊二胺转运到胞外环境，从而使细胞免受极端pH 条件所造成的损伤，这对细胞面对酸胁迫时的正常生长具有重要作用 23-26。(6) LD
30、C 合成的戊二胺是小韦荣球菌(Veillonella parvula)、嗜碱性韦荣球菌(Veillonella alcalescens)、反刍兽新月单胞菌 (Selenomonas Ruminantium)和解脂厌氧弧菌(Anaerovibrio lipolytica)等这些严格厌氧的革兰氏阴性菌的肽聚糖组分 27-29。在这些细菌中戊二胺首先被转化成 D-谷氨酸残基，转肽酶再将 D-谷氨酸残基合成肽聚糖 30。1.1.2 LDC 在生物催化领域的应用1.1.2.1 一步发酵法一步发酵法就是采用廉价的碳源，例如葡糖糖、淀粉、木糖等作为底物，经过细胞一步发酵合成戊二胺。Qian 等人利用葡萄糖作
31、为底物，以 E. coli K12 W3110 作为宿主，采用一步发酵法生产戊二胺 31。通过对戊二胺代谢途径进行改造，最终大肠杆菌工程菌合成戊二胺的得率为 0.12 g/g 葡萄糖，发酵浓度为中戊二胺浓度为 9.61 g/L。由于谷氨酸棒状杆菌是发酵生产赖氨酸的常用高产菌株，而赖氨酸是合成戊二胺的前体物质，因此很多研究者选择谷氨酸棒状杆菌作为宿主菌进行代谢改造发酵生产戊二胺 32-37。 Mimitsuka 等人利用谷氨酸棒杆菌为工程菌，将 cadA 基因插入到高丝氨酸脱氢酶基因位点，最终发酵液上清液中测得戊二胺的积累量为 2.6 g/L38。Tateno 等人将淀粉酶基因 amyA 和 c
32、adA 在谷氨酸棒杆菌中克隆并共表达，构建的工程菌可以直接利用可溶性淀粉发酵生产戊二胺，戊二胺产量最终能够达到 2.39 g/L34。Buschke 等在谷氨酸棒状杆菌中共表达木酮糖激酶基因 xylB 和木糖异构酶基因 xylA，并且过表达了 cadA 基因，通过发酵木糖合成戊二胺，最终戊二胺的产量为 1.42 g/L36。华东理工大学硕士学位论文 第 3 页1.1.2.2 两步催化法两步催化法首先将碳源经过糖酵解途径转变成赖氨酸，然后通过发酵诱导表达赖氨酸脱羧酶获得全细胞或进一步提取酶，将底物赖氨酸进行生物催化转化生成戊二胺。酶法催化采用游离酶作为催化剂，其优点是大大减少了催化时间，但酶易失
33、活。全细胞催化法利用完整的生物细胞作为催化剂进行催化转化，省去了繁琐的酶提取过程，使得制备更加简便快速，并且增强了酶稳定性，提高了催化效率，降低了生产成本 39。Nishi 等利用强启动子 Plac 构建质粒并在 E. coli JM109 宿主菌中过表达 cadA，分离并收集菌体，投入底物赖氨酸经过 6 小时的催化后，赖氨酸的转化率机乎达到100%，戊二胺产量达到 69 g/L40。Young Hoon 等人采用 E. coli XL1-Blue 工程菌过表达 ldcC，控制初始菌体 OD600=50，赖氨酸初始浓度为 200 g/L，经过 120 小时催化后最终获得 133.75 g/L
34、的戊二胺，底物转化率为 80%41。Shashi Kant Bhatia 等人利用 E. coli YH91 工程菌过表达 cadA 基因，并采用海藻酸钡固定化细胞，发现固定化的细胞具有比游离细胞更好的热稳定性，经过 4 小时催化后，上清液中的戊二胺含量为 75.8 g/L，底物转化率为 84%42。1.1.3 LDC 的来源及理化性质LDC 能够催化 L-赖氨酸脱羧生成 1,5-戊二胺和二氧化碳，是戊二胺合成途径中的关键酶，在细胞生长过程和受到酸胁迫时起着重要的作用。大多数微生物中都存在LDC，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、尸杆菌
35、(Bacterium cadaveris)、耐碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamensia)、毛链霉菌(Streptomyces polosus)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、青紫色素杆菌 (Chromobacterium violaceum)、反刍动物月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)等微生物中 43-45。LDC 也存在于一些高等植物中，例如黄瓜、家山黧豆等 46,47。不同来源的 LDC 的氨基酸序列一致性比较高，大肠杆菌来
36、源的 cadA与 ldcC 以及来自于蜂房哈夫尼菌的 ldc 编码的氨基酸序列的相似性分别为 69.4%和80%， ldcC 和蜂房哈夫尼菌的 ldc 氨基酸序列相似性为 68.6%。并且它们对底物的特异性表现相当专一。另外，反刍动物月形单胞菌的 ldc 基因编码的赖氨酸脱羧酶不仅可以催化赖氨酸，而且还可以催化鸟氨酸，并且对两个底物具有相似的 Km 和 Vmax 值 48。目前对来源于 E. coli 的两种 LDC 研究的比较清楚。诱导型酶 CadA49和组成型酶LdcC43, 50是来源于 E. coli K12 MG1655 的两种 LDC,它们都以磷酸吡哆醛为辅因子来催化 L-赖氨酸。
37、 CadA 的最适 pH 是 5.5，但在随着 pH 的升高酶活显著下降，在 pH=8.5时完全失活。LdcC 的最适 pH 是 7.5，在广泛的 pH 范围内均有活性 43。尽管 LdcC 具有较高的最适 pH，但在它们各自最适 pH 条件下，CadA 的比酶活高于 LdcC51。大肠杆菌赖氨酸脱羧酶 CadA 和 LdcC 的最适温度都是 52C，但是 CadA 的热稳定性更优越，第 4 页 华东理工大学硕士学位论文它在 70C 时仍能保持很高的活性，而 LdcC 从 37C 开始，随着温度升高热稳定性显著下降 52。1.1.4 LDC 酶活测定方法LDC 能够催化 L-赖氨酸脱羧生成 1
38、,5-戊二胺和二氧化碳，通过检测单位时间内生成的戊二胺或二氧化碳的量都能够计算出 LDC 的酶活。目前，LDC 酶活测定最常用的检测方法包括微量检压法、分光光度法。1.1.4.1 微量检压法测定 LDC 酶活微量检压法是通过测定二氧化碳的量来检测酶活力，主要仪器采用华勃氏呼吸仪53。该仪器的基本原理是：在一个定温定体积的密闭体系中检测气体变化，当有气体被吸收时，体系内的气压降低，当有气体生成时，体系的压力就会上升，压力的变化可以通过测压计读出。由此，根据压力变化计算出 LDC 脱羧所产生的二氧化碳的量，从而测定出 LDC 的酶活力。该方法操作复杂不易操作，需要精确控制。1.1.4.2 分光光度
39、法测定 LDC 酶活Phan A 等建立了分光光度法测定尸胺 54。分光光度法测定的原理是根据 LDC 脱羧生成的戊二胺与 2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)反应生成的产物特异性的溶于甲苯，而赖氨酸和 TNBS 反应生成的产物不溶于甲苯，因此通过甲苯萃取戊二胺和 TNBS 反应的产物，在 340 nm 波长下测定度数，根据标准曲线，求出戊二胺的浓度。该测定方法简单，测定结果准确，但需要使用具有毒性的有机溶剂甲苯。1.2 LDC 的多聚体结构及酶分子改造2011 年 Kanjee 等人解析了大肠杆菌来源的赖氨酸脱羧酶 CadA 的晶体结构(PDB:3N75)51,55-57。CadA 的每个亚
40、基有三个结构域：N 端 Wing 结构域，核心结构域，以及 C 端结构域。其中核心结构域又可以分为 Linker 结构域以及和 I 型折叠类 PLP 依赖型脱羧酶家族相关的 PLP-SD 亚结构域 58和 SD4 亚结构域，图 1.355。华东理工大学硕士学位论文 第 5 页图 1.3 CadA 二聚体的结构域组成 55Fig. 1.3 Structure of CadA dimer55CadA 是由五个二聚体组成的十聚体(图 1.4)它属于 I 型折叠类 PLP 依赖的脱羧酶家族中的原核细胞鸟氨酸脱羧酶(pODC)亚类 55。同 pODC 亚类中的其它大肠杆菌脱羧酶，例如组成型赖氨酸脱羧酶
41、LdcC44，诱导型精氨酸脱羧酶 AdiA59以及鸟氨酸脱羧酶 SpeF 和 SpeC60相类似。CadA 的两个亚基需要通过核心结构域进行二聚体化后，才能形成一个完整的活性中心。CadA 中的 Wing 结构域主要参与二聚体之间的相互作用，进而形成十聚体。图 1.4 CadA 的十聚体结构 55Fig. 1.4 Structure of CadA decamer551.2.1 LDC 的结构与功能的关系大肠杆菌中超过 80%的蛋白质是由两个或更多的亚基组成，其中约 80%是同源多第 6 页 华东理工大学硕士学位论文聚体 61。研究表明多聚体的状态受到多种因素的影响，例如多聚体结合界面关键氨基
42、酸位点的突变、pH、酶浓度、离子强度等。微生物能够灵活而又高效地调控其胞内多聚体结构状态，还对不利环境维持正常生理功能至关重要 62,63。Sabo 等人研究表明 CadA 在十聚体状态下的酶活要高于其二聚体或更高阶的多聚体形式 42。Houry 等人报道，在偏酸性 pH 条件下 CadA 主要以十聚体形式存在，随着pH 的升高或酶浓度的降低 CadA 将解聚成二聚体，当 pH5时又会形成更高阶的多聚体形式。以上特性保证了细菌在受到酸胁迫情况下，CadA 诱导表达后将以具有较高催化活性的十聚体结构存在，从而快速生成碱性的戊二胺来中和酸性 pH。Houry 等通过对 CadA 晶体解析后，对其多
43、聚体界面上的氨基酸位点 L89R 和L547R 进行了突变，结果发现这两个突变体只有二聚体形式，并且活性也比野生型的CadA 要低 64,65。以上研究表明，对于具有多聚体结构的酶界面上氨基酸的突变，很有可能影响酶结构的稳定性和它的功能。因此，研究赖氨酸脱羧酶多聚体界面上氨基酸的突变对其结构和酶学性质的影响具有重要意义。1.2.2 LDC 的酶分子改造工业生产中常常伴随着强酸、强碱、高温等极端环境，然而大多数天然酶的稳定性较差，催化效率较低难以满足工业化生产的需要。随着分子生物技术、结构生物学和生物信息学的飞速发展，研究者们逐渐开始重视对天然酶的改造，以获得能够创造巨大工业应用价值的催化剂。目
44、前酶分子改造常用的技术是(半)理性设计和定向进化，蛋白质( 半) 理性设计是蛋白质工程最常用技术之一，通过解析获得酶分子的结构或者通过软件对蛋白质结构和相互作用进行预测，进而对选定的点进行突变，从而优化酶分子的性质。另外，1993 年,美国科学家 Arnold FH66首先提出酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶。酶分子定向进化能够在很短的时间内模拟自然界进化过程，体外改造酶基因，定向选择出所需性质的突变酶。利用二步发酵法催化生产戊二胺的过程中，随着产物戊二胺的浓度增加，发酵液的 pH 不断增加，强碱条件会导致 LDC 的多聚体状态由高酶活性的十聚体变为较低酶活性的二聚
45、体。然而通过添加酸来调节 pH 不仅造成环境污染而且对后续的分离纯化造成困难。因此对 LDC 进行酶分子改造使其十聚体结构更加稳定或者酶活性更高，不仅可以减少生产过程的酸用量而且大大提高了催化效率。CadA 所属的 pODC 亚类具有高度保守的结构域和相似的催化机制 51，因此通过对其进行改造，系统分析归纳出的 CadA 结构和性质之间关系的一般规律，对该家族中其它 LDC 的分子改造具有指导意义。目前已经有报道研究了 LDC 酶分子改造对其结构和功能的影响。Houry 等人通过研究细菌酸胁迫与严谨应答之间的关系 55发现，当细菌面临营养匮乏的时候，严谨应答效应分子 ppGpp 能够强烈抑制
46、CadA 的活性，从而降低在营养匮乏时对赖氨酸的消耗。为了测定 ppGpp 与 CadA 结合对于大肠杆菌响应酸胁迫与严华东理工大学硕士学位论文 第 7 页谨应答的影响，作者通过理性设计构建了 CadA 的点突变体 R97A 和 R206S，以及仅形成二聚体的 L89R。研究发现在 pH 为 6.5 时，野生型 CadA 被 ppGpp 强烈抑制，而R97A 和 R206S 则不受抑制。另外， L89R 也不受到 ppGpp 抑制，但它的比活性比野生型低 5 倍左右。Ouyang 等人通过利用易错 PCR 和 DNA 改组等定向进化技术，对蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei AS1.100
47、9)来源的赖氨酸脱羧酶进行改造，得到了活性提高的突变体V147F/E583G，其活性为野生型的 1.62 倍 67。作者推测由于 E583G 位于参与形成酶活性中心通道的 C 端结构域，该残基可能对于酶活性的调控起主要作用。1.3 戊二胺概述1,5-戊二胺 (1,5-Diaminopentane)又名尸胺、尸毒素、 1,5-二氨基戊烷，是生物胺类中的一种 4。生物胺是一类具有生物活性的含氮有机化合物的总称，根据其结构可分为三类：脂肪族，包括腐胺、尸胺、精胺、亚精胺等；芳香族，包括酪胺、苯乙胺等；杂环胺，包括组胺、色胺等。随着生物行业的发展，戊二胺作为平台化合物开始受到人们的广泛关注。戊二胺与己
48、二胺互为同系物，可以代替己二胺并与己二酸按照 1：1的摩尔比来合成新型聚酰胺 56 (即尼龙 56，Polyamide 56)，如图 1.5 所示。新型聚酰胺56 具有耐磨性强、熔点较高、耐有机溶剂等优点，其性能可以媲美目前最常用的聚酰胺 66，是一种环保型可再生的生物材料，具有广阔的市场前景。图 1.5 聚酰胺 56 反应方程式Fig. 1.5 Reaction equation of polyamide-561.3.1 戊二胺的理化性质戊二胺的分子式为 C5H14N2，分子量为 102.18，沸点 178-180C，易燃，有毒，具强刺激性。在常温下戊二胺是一种粘稠状液体，有六氢吡啶的臭味，在空气中戊二胺易发烟能形成二水化合物，易溶于水、乙醇，难溶于乙醚，深度冷冻可凝固结晶。戊二胺是广泛存在于生物体内的含氮
