1、胆固醇不仅是食品中重要的一种营养物质，还与食品感观品质的变坏和有毒物质的出现密切相关，因为以胆固醇为底物氧化产生突变物，致癌物和细胞毒素的作用已经被证明13。此外，它还与家畜的生长4、繁殖5等经济性状相关，而研究胆固醇与它们的关系，首要的前提条件就是能够准确地测定出胆固醇的含量。经典的测定胆固醇的方法是Liebermann- Burchard显色反应或Zlatkis 法6，另一个常用的方法是利用酶法来通过胆固醇的氧化来测定。但这些方法都是不严格的, 会受到干扰物质对胆固醇准确测定的影响。为了克服这个问题，气相色谱技术目前更适用于胆固醇的分析7。胆固醇是肉中非皂化脂部分的组分。利用色谱分析有2
2、种可以选择的预处理方法：第1 种是先提取总脂后皂化，然后再提取非皂化物；第2 种是直接皂化样品然后再提取非皂化的组分。目前我国国标规定测肉类中的胆固醇是用第1 种方法，但在实际的操作中, 该方法存在操作繁琐、有机溶剂消耗大，样品的测定结果回收率低和重复性差的缺点。相比之下第2 种方法则具有简便、准确，用于测定的样品量需求少的优点。但在实验研究中发现，测定不同组织中胆固醇的含量用一成不变的预处理方法是不可行的，因为其回收率和重复性会存在很大的差异，所以针对不同的组织测定方法应有所变化。此外，目前文献报道的预处理方法常是将提取液蒸干后再溶解上机，其操作复杂，影响样品的回收率和重复性，所以本研究的目
3、的是选取人们最喜食的猪背最长肌、脂含量高难于皂化的脂肪组织和胆固醇含量最高的肝脏组织为代表, 发展一套能准确测定不同组织胆固醇含量同时又兼顾降低成本、简便易行的方法。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 样本实验用槐猪组织样（肝脏、脂肪、肌肉）采自福建省上杭县绿琪槐猪育种场，取样后立即放入液氮中保存，直到胆固醇测定。1.1.2 试剂5- 胆甾烷、丁化羟基苯甲醚（BHA）购于Sigma。胆固醇、氢氧化钾、氯化钠、异辛烷、正己烷、石油醚、乙醇都购于北京化学试剂公司为化学纯。1.1.3 试液配置内标溶液：无水乙醇配置的终浓度为200 mg/L 的5- 胆甾烷溶液。加标液：无水乙醇配置的终浓度分别为1
4、00、150、200 mg/L 的胆固醇溶液。萃取液：分别配制含0.01%(W/V)BHA 的异辛烷、正己烷和石油醚溶液。皂化液：无水乙醇（含0.125% 的BHA）与蒸馏水（5544）以此比例混合均匀，用混合液做溶剂再分别配11.5%、17.25%和23%（W/V）的氢氧化钾溶液。1.1.4 主要仪器和设备恒温水浴锅；氮气吹干仪；涡旋振荡器；移液枪；HP 6890 气相色谱仪。1.2 方法1.2.1 色谱条件HP 6890 气相色谱仪（AgilentTechnologies,Inc.）,FID 检测器，进样口温度300，Ag4ilent 19091J- 413 HP- 5 柱，30.0 m3
5、20 m0.25 m，柱温250，载气流速5 mL/min，进样量1.0 L,分流进样，分流比201。1.2.2 标准溶液的配制配制1 mg/mL 的胆固醇原液和1 mg/mL 的5- 胆甾烷原液，分别取0.25、0.5、1、1.5、2、2.5 mL 的胆固醇原液和2 mL 的5- 胆甾烷原液于10 mL 的容量瓶中定容，使胆固醇的最终浓度分别为25、50、100、150、200 mg/L 和250 mg/L,5- 胆甾烷的终浓度为200 mg/L。1.2.3 直接皂化及提取称取肝脏、脂肪、肌肉组织分别0.15、0.3 g 和1 g 装入带有聚四氟乙烯内垫的螺纹帽耐热玻璃试管中。加入1 mL
6、的内标溶液和7.3 mL 的皂化液。然后将试管内充溢氮气，使液体上方的空气排除。将试管置于80的水浴中皂化，每隔5 min 拿起剧烈振荡30 s 后放回，直到残留物完全消失，溶液澄清。随后立即置于冰上冷却后，加入适量的萃取液，涡旋振荡2 min，静置，直到观察到分离相，用移液枪将上层有机相吸出，如此重复3次，并将3 次吸取的有机相合并到一个干净的试管中，置于氮气吹干机下，干燥浓缩到适当的体积，移入上机小瓶用于气相色谱仪分析。1.2.4 定量方法（内标法） 标准曲线的制作依次取上述不同浓度的标准溶液，上机。以胆固醇/ 胆甾烷量比为横坐标x，胆固醇/ 胆甾烷峰面积比为纵坐标y，绘制标准曲线。1.2
7、.5 计算样品中胆固醇的含量根据标准曲线拟和的线性回归方程计算样品中胆固醇的含量（mg/100 g）。2 结果与讨论2.1 样品皂化液与皂化时间的选择对于脂肪含量较少的肌肉组织用含11.5KOH 的皂化液，皂化15 min 即可; 而对于脂肪组织此浓度的皂化液无法皂化完全，用17.25KOH 皂化液需要35 min,而用23KOH 皂化液只需15 min 即可，并且用不同浓度皂化液处理后，对胆固醇的回收率和重复性无明显影响，所以对于含脂丰富的组织建议用高浓度的皂化液处理。2.2 样品萃取液选择通常我们可以采用的异辛烷、正己烷、石油醚、乙醚等作为萃取剂，但乙醚挥发性太大，实验使用不安全，所以比较
8、了异辛烷、正己烷、石油醚的萃取效果，发现对结果影响不大，但考虑到异辛烷、正己烷成本较高，所以选用较为便宜的石油醚。2.3 萃取液用量的确定肌肉组织每次加3 mL 的萃取液，重复萃取3 次就能够达到很高的回收率，但是对于脂肪和肝脏需要加大萃取液的用量，本研究每次加5 mL 重复萃取了3 次回收效果较理想,所以根据自己实验样本的具体情况调整萃取液的用量。2.4 标准回归方程以胆固醇浓度分别为25、50、100、150、200 mg/L 和250 mg/L 和胆甾烷浓度为200 mg/L 的标准溶液重复上样（重复3 次），绘制标准曲线，回归方程为Y=0.6782X+0.0266, 相关系数R2=0.
9、9994,说明呈线性回归，可以用于定量分析。2.5 准确度实验对3 种组织进行加标回收实验：第1 组加入1 mL 的加标液和适量的样品后进行1.2.3 步骤；第2 组加入1 mL 的加标液不加样品进行1.2.3 的步骤，结果见表1（每个浓度做4 个重复），回收率在92.58%104.68%之间，准确度较高。回收率结果表明，本方法尤其适用于肌肉组织，相反脂肪组织的回收率较低，所以对于脂肪组织可以增加萃取液的用量以达到更为理想的回收率。表1 样品加标回收率实验结果%加标平均值200 mg/L 400 mg/L 600 mg/L不加样品回收率101.5 101.3 103.0 101.9CV 3.8
10、9 1.35 0.72 1.99肌肉回收率100.56 105.74 107.73 104.68CV 5.12 4.87 3.88 4.62脂肪回收率92.37 94.12 93.75 93.41CV 5.26 3.92 4.77 4.65肝脏回收率87.11 92.53 98.12 92.58CV 7.61 6.33 3.26 5.732.6 精确度实验取3 种组织的样品，按本方法进行测定，每个组织做5 个重复（见表2）。结果表明肝脏胆固醇含量测定值的变异系数仅为1.85%，肌肉为4.89%,脂肪为5.23%,说明此方法的精密度较高，重复性好。3 结论本文对毛细血管气相色谱法测定猪不同组织中
11、胆固醇含量的方法进行了优化，建立了一套快速、简便、准确度和精密度都较高的测定方法，适用于实验和生产中组织胆固醇含量的测定。测定胆汁胆固醇和磷脂的简捷方法南京铁道医学院附属医院外科( 21 0 0 0 9) 汤文浩上海瑞金医院外科正确测定胆汁胆固醇和磷脂含量是胆石研究中的重要手段。我们用醇醚溶剂对胆汁进行提取, 然后分别用酶法和相蓝法测定提取液中的胆固醇和磷脂含量。方法简便、实用, 提供参考。一、试剂( 1) 醇醚溶剂无水乙醇与乙醚按3 : 1 混合. (2) 总胆固醇酶法试剂盒, 上海化学试剂研究所提供。( 3) 磷脂消化剂将硫酸(A R ) 28 m l 徐徐滴加入蒸馏水50 ml 中, 混
12、匀, 冷却, 加入高氯酸(A R , 7 0 肠) 6 . sm l , 最后补足至i o o m l。( 4 ) 显色剂钥酸钱( A R ) 0 . 25 9 , 无水醋酸钠(A R ) 0 . 829 溶于蒸馏水至10 om l。临用时取该液9 份与新配制的10 %抗坏血酸( A R )1 份混合而成。(5 ) 胆固醇标准液Zm g / m l。( 6 ) 磷标准液0 . lm g / m l。二、方法先提取胆汁中的胆固醉和磷脂。吸取胆汁20rn l 于具塞离心管中, 加醇醚溶剂4 m l, 混匀lm in , 37 ,C 水浴中温育15 m i n , 30 0 o r p m 离心sm
13、 in . 取试管A , B Z 支各加上清lm l, 85 蒸干, 冷却, 分别用于测定胆固醇和磷脂.1 . 胆汁胆固醇测定另取一试管加入胆固醇标准液( Zm g / m l) 20 拌l, 连同待测管(A ) 各加l , 4 稀释的酶试剂 1. sm l, 37 水浴温育 15 mi n , 酶试剂空白管校零, s o o n m 比色。计算: 胆汁胆固醇(m m ol / L )一瓮火0.0 2 x Z 火器磊碧号备2. 胆汁磷脂磷测定另取一试管加入磷标准液( 0 . lm g / m l) 50 拜l, 连同待测管( B ) 各加磷脂消化剂0 . 2m l, 将试管置于l0 0 0w
14、电炉上消化10 15 m in , 见消化管中液体由白变棕黑色, 然后冒烟最后变成无色透明。冷却, 各加显色剂Zml , 混匀, 置6 0 水浴l o m in , 取出, 加水sm l 混匀, 7 0 0 n m 比色,空白校零。计算: 胆汁磷脂磷( m m ol / L )一瓮又。 。s x 。 1 又浸斋吴踢三、结果( 1) 线性: 胆固醇线性范围4 8 0 科g ; 磷2 1 0 拌g 。( 2) 回收率胆固醇9 2. 7 5 10 7 . 45% ( 平均1 0 0 . 36 土5. 38 环) ; 磷9 2. 0 7 %111 1 肠( 10 1 58 士6 4 6 环) 。( s
15、 ) 精密度胆固醇交9 . 24 , C V 10 . 6 5% , 磷又13. 5 6 , C V 2. 19 % 。四、讨论用醉醚提取液可使胆固醇和磷脂完全从脂蛋白颗粒中释出. 胆固醇用酶法测定的优点已被公认, 同样适用于胆汁。用硫酸高氯酸高温消化, 使磷脂变成无机磷而测其磷, 回收率好, 结果满意。8超速离心高效液相色谱准确测定血清脂蛋白(a) 胆固醇国汉邦1 , 董 军1 , 李红霞1 , 满 永1 , 王 抒1 , 陈文祥1 ,2(1. 卫生部北京医院,北京老年医学研究所, 北京市100730 ; 2. 卫生部北京医院, 卫生部临床检验中心, 北京市100730)关键词 生物化学;
16、脂蛋白; 胆固醇; 超速离心法; 高效液相; 色谱法; 动脉粥样硬化摘 要 目的 建立血清脂蛋白(a) 胆固醇的准确测定方法。方法 血清与含脯氨酸的溴化钠溶液混合,使背景密度为1. 044 ,超速离心;用含22巯基乙醇的溴化钠溶液将底部组分的密度调节至1. 040 , 再次超速离心,高效液相色谱测定顶部组分胆固醇即为脂蛋白(a) 胆固醇。结果 用22巯基乙醇使脂蛋白(a) 解离,使成为不含载脂蛋白(a) 的脂蛋白(a) ,脂蛋白 (a) 解离前后存在明显密度分界区域,使脂蛋白(a) 的分离和测定成为可能。测定脂蛋白(a) 胆固醇的批内和总变异系数分别为1. 84 % 2. 17 %和2. 85
17、 %4. 29 %。 结论 建立新的血清脂蛋白(a) 胆固醇测定方法,方法精密、可靠,可望在脂蛋白(a) 测定标准化中发挥作用。脂蛋白(a) 是由类似于低密度脂蛋白(low densi2ty lipoprotein , LDL) 的脂蛋白和载脂蛋白 (a) 组成的一种特殊脂蛋白1 。大量研究显示,脂蛋白(a) 升高是动脉粥样硬化性心血管病的重要危险因素2 。脂蛋白(a) 胆固醇 Lp (a) cholesterol , Lp (a)2C测定的困难在于没有简便、可靠的血清脂蛋白(a) 的分离方法,近年发展的方法有植物凝集素法、超速离心法和P 或琼脂糖凝胶电泳法3 ,4 等, 其共同的缺点是操作烦
18、琐,技术要求高,精密度较差。鉴于上述情况,本研究探索用超速离心分离脂蛋白(a) ,用高效液相色谱( high performance liquid chromatography , HPLC) 测定其胆固醇,建立Lp (a)2 C 的准确测定方法。1 材料和方法1. 1 仪器、试剂和血清样品XL290 超速离心机、CentriTube 离心管切割器(Beckman Coulter , 美国) ,HP 1100 高效液相色谱仪(Hewlett Packard , 德国) ,MicroLab 500 稀释器 (Hamil2ton , 美国) 和7170A 型自动生化分析仪(Hitachi ,日本)
19、 。用于配制标准溶液的胆固醇为本室研制的标准物质GBW 09203a ,内标物豆甾醇和22巯基乙醇(22Mercaptoethanol , ME) 为美国Sigma2Aldrich 产品,色谱纯乙腈、异丙醇和正己烷为美国 Fisher Scientific产品,其他化学试剂均为国产分析纯试剂。所用血清样品为收集自北京医院和同仁医院检验科的新鲜血清标本和美国疾病控制预防中心(CDC) 质控血清AQ18 (冰冻 ) 。新鲜血清分析前- 80 冰冻保存。1. 2 超速离心密度液配制配制含0. 2 molPL 脯氨酸的溴化钠溶液,调节溴化钠浓度,使20 密度为1. 080 (密度液) ,此密度液(0.
20、 4 mL) 与0. 4 mL 血清混合, 给出背景密度1. 044 kgPL ;配制含0. 1 mol PL 22巯基乙醇(2 2Mercap2toethanol , ME) 的溴化钠溶液,调节溴化钠浓度,使20 密度为1. 033 (密度液) ,此密度液(0. 4 mL) 与第一次超速离心后的0. 4 mL 底部组分(密度约为1. 047) 混合后给出背景密度1. 040 kgPL 。1. 3 标准溶液和内标溶液配制配制胆固醇乙醇溶液,使浓度为0. 323、0. 646、1. 293、2. 586 mmolPL 和5. 172 mmolPL ,用作第二次超速离心后顶部组分胆固醇( top
21、fraction cholesterol ,TFC) 测定的标准溶液。配置豆甾醇乙醇溶液1. 293mmolPL ,作为胆固醇测定的内标溶液。1. 4 超速离心分离脂蛋白(a)超速离心采用Type 25 转头和厚壁聚碳酸酯离心管(1 mL ,8 mm 51 mm) 。用校准过的加样器精密吸取0. 4 mL 血清到离心管中 ,加入0. 4 mL 密度液, 混匀,在20 和23 krPmin 下离心18. 5 h。用离心管切割器在离心管中液体的中间位置切割离心管,将离心管底部组分(bottom fraction , BF , 0. 4 mL)转移到另一新离心管中,用0. 4 mL 密度液 洗涤底部
22、离心管3 次并全部转移到新离心管中,混匀,在20 和23 krPmin 下离心 18. 5 h。用离心管切割器在离心管中液体的中间位置切割离心管,测定顶部组分胆固醇。1. 5 顶部组分胆固醇测定胆固醇测定参考文献 5 ,6 采用HPLC 法。高效液相色谱分析采用Nova2Pak C18 色谱柱(5 (m ,3. 9 mm ( 150 mm) ,流动相为乙腈异丙醇(9010) ,流速1 mLPmin ,紫外(250 nm) 检测。取上述样品,用0. 2 mL 流动相溶解,进样 10L 。将标准溶液浓度对胆固醇P内标峰高比进行线性回归,将样品顶部组分胆固醇P内标峰高比代入回归方程,计算样品胆固醇浓
23、度。1. 6 其他分析脂蛋白a 质量测定用日本协和医药公司的免疫比浊法;采用试剂说明书中的样品试剂比例、温育温度及时间和空白方式, 在全自动生化分析仪上进行分析。1. 7 统计分析用微软Excel 程序进行统计分析。2 结果2. 1 解离前后脂蛋白(a) 在脂蛋白密度谱中的分布血清的密度在1. 0061. 181 之间的33 种背景密度下和不同条件下底部组分胆固醇分布见图1。结果发现,当密度 1. 11 时,乙二醇存在时底部组分胆固醇与22巯基乙醇存在时底部组分胆固醇基本相同,当密度为1. 05 左右时,BFEGC与BFMEC 之差最大,提示解离后的不含载脂蛋白(a) 的脂蛋白密度不完全与LD
24、L 重叠,可能与脂蛋白(a) 存在密度分解点。图1. 22巯基乙醇和乙二醇存在下,血清在不同背景密度超速离心底部组分胆固醇比较2. 2 解离后的脂蛋白(a) 在密度1. 05 附近的分布实验不含载脂蛋白(a) 的脂蛋白在其分界密度1. 05 附近的分布情况7 ,取脂蛋白(a) 300 mgP L 的混合血清一份,在1. 052 的密度下超速离心,制备底部组分含大部分脂蛋白(a) ,将底部组分用含22巯基乙醇和不含22巯基乙醇的密度液分别调节背景密度至1. 032、1. 034、1. 036、1. 038、1. 040、1. 042、1.044、1. 048 和1. 050 ,再次进行超速离心,
25、测定顶部组分胆固醇。22巯基乙醇存在时 TFC (TFME( + ) C)与22巯基乙醇不存在时TFC (TFME(2) C) 及两者之差在1. 0361. 048 密度范围内基本保持不变,超出此范围则出现降低,提示不含载脂蛋白(a) 的脂蛋白密度一般小于1. 0367 。2. 3 超速离心分离脂蛋白(a) 和高效液相色谱测定脂蛋白(a) 胆固醇方法的建立不含载脂蛋白(a) 的脂蛋白和脂蛋白(a) 之间有明显的密度分界区域,在此区域内基本上既无不含载脂蛋白(a) 的脂蛋白,也无脂蛋白(a) ,由此可实现脂蛋白(a) 的超速离心分离,建立超速离心 HPLC 测氯仿P甲醇匀浆测定肝脏甘油三酯含量曾
26、涛 谢克勤1 张翠丽 于丽华 朱振平山东大学公共卫生学院毒理学研究所,济南 250012关键词:肝脏 甘油三酯 氯仿 甲醇中图分类号:R322147 R575104 文献标识码:A作者简介:曾涛,男,博士研究生,E2mail :zengtao1311 yahoo. 1 通讯作者:谢克勤,男,理学博士,教授,博士生导师,研究方向:神经毒理学肝脏组织中甘油三酯(TG) 的测定是判断药物对脂肪肝有无作用的重要指标。然而,肝组织的匀浆方法报道不一,导致评价预防和治疗脂肪肝的药效受到怀疑。目前测定肝组织中的TG, 归纳起来可以分为两类:一是用生理盐水或者磷酸盐缓冲液等匀浆1 ,2 ;二是用有机溶剂主要是
27、氯仿和甲醇匀浆3 5 。为了比较两种方法的可靠性,本文建立了酒精性脂肪肝模型,采用2 种匀浆方法测定肝脏甘油三酯含量。1 材料与方法111 材料健康雄性昆明小鼠由山东大学实验动物中心提供;甘油三酯测定试剂盒购自中生北控生物科技有限公司;无水乙醇由天津广成化学试剂有限公司提供;DY892 电动玻璃匀浆机,宁波新芝生物科技股份有限公司;UV2120202 紫外P 可见分光光度计, 日本岛津公司; 多功能冷冻水平离心机, 德国Heraeu Biofuge Stratos 公司。112 方法11211 急性酒精性脂肪肝模型的建立 参考 保健食品检验与评价技术规范(2003 年版) ,健康雄性昆明小鼠1
28、6 只,随机分为2 组,对照组和模型组。模型组给予体积分数为50 %的乙醇12mlPkg ,对照组给予等体积的蒸馏水。两组动物禁食16h 后处死,取肝脏备用。11212 氯仿P 甲醇肝匀浆测甘油三酯含量1121211 标准曲线的测定 按试剂盒说明配置的1ml 工作液中(试剂 R1 中加入10ml 试剂R2) ,加入10l 氯仿P 甲醇(2 1)混合物后,分别加入5、10、15、20、25、30 和35l 甘油三酯标准品,震荡混匀,37 孵育10min 后,6000r Pmin ,离心10min ,取上清505nm测定吸光度(A) 。1121212 氯仿P甲醇比例对甘油三酯提取量的影响 称取适量
29、肝脏组织,放入玻璃匀浆管中,分别用体积比为 2P1、1P 1、1P2和1P 3 的氯仿P 甲醇混合液制备10 %的肝脏组织匀浆,倒入具塞玻璃管中,室温下抽提24h 后,取有机溶剂层,根据甘油三酯测定试剂盒说明对甘油三酯含量进行测定,比较氯仿P甲醇不同比例对于甘油三酯抽提的效果。1121213 氯仿P甲醇(21) 肝脏匀浆液的制备及甘油三酯含量测定称取适量肝脏组织,放入玻璃匀浆管中,加入三倍体积的甲醇,1500rPmin 电动匀浆 5min ,倒入具塞离心管中 ,再加入6 倍体积的氯仿,漩涡混合器混匀,制备10 %的组织匀浆。将匀浆分别抽提6、12 和24h 后,小心抽取下层有机溶剂层10l加入
30、到1ml 工作液中, 37 分别孵育10、15 和20min 后,6000rPmin离心10min ,根据甘油三酯测定试剂盒对甘油三酯含量进行测定,比较不同提取时间和孵育时间对测定结果的影响。11213 生理盐水肝脏匀浆测甘油三酯含量 称取适量肝组织,放入玻璃匀浆管中,加入9 倍体积的生理盐水,1500rPmin电动匀浆5min ,制备10 %的组织匀浆。3000rPmin 15min ,小心去除上层白色油脂后,取上清液根据试剂盒说明书测定甘油三酯的含量。113 统计学处理用SPSS 1310 统计软件进行统计学分析, P 0105 认为具有统计学差异。2 结果211 标准曲线的测定标准管(1
31、ml 工作液中加入 10l 甘油三酯标准品) 的吸光度为01126 , 各测定管的吸光度的标准曲线方程为: Y =010056 X + 010093 , R2 = 019963。1ml 工作液中加入 10l 的氯仿P 甲醇 (21) 对于其测定结果无影响。212 氯仿 P甲醇提取体系的比例对甘油三酯抽提效果的影响同一小鼠肝脏(为保证结果准确,共选用8 只小鼠肝脏)用不同比例的氯仿P甲醇提取液抽提24h 后,加入到1ml 工作液中,孵育20min ,其吸光度见表 1。由表1 所见,氯仿甲醇比例在1221 之间时,其吸光度随着氯仿比例的增加而增加;当氯仿甲醇比例为31 时,测定的吸光度较2P 1
32、时下降,表明氯仿甲醇比例为21 时,对甘油三酯的抽提较为完全。表1 氯仿P甲醇比例对甘油三酯抽提效果的影响( A)氯仿P甲醇1 # 2 # 3 # 4 # 5 # 6 # 7 # 8 #31 01198 01092 01185 01146 01201 01157 01189 0112221 01214 01111 01265 01185 01206 01287 01215 0119911 01196 01097 01160 01176 01154 01139 01208 0118512 01080 01095 01094 01082 01099 01101 01153 01100213 不同孵
33、育时间对吸光度的影响同一小鼠肝脏(共8 只动物) 氯仿甲醇(2 1) 提取液,加入到1ml 工作液后,分别孵育 10、15 和20min , A 值分别为01220 01034、01223 01033 和01223 01030。214 氯仿 P甲醇不同提取时间对测定吸光度的影响同一小鼠肝脏(共8 只动物) 用氯仿甲醇(21) 分别抽提6、12 和 24h , A 值分别为 (01205 01036) 、(01220 01034) 和_(01220 01031) 。215 两种匀浆方法对测定结果比较由表2 可见,生理盐水匀浆两组比较未见统计学差异,氯仿P 甲醇 (21) 匀浆抽提12h 后,两组
34、比较可见乙醇组甘油三酯含量明显升高( P 0101) 。表2 两种匀浆方式测定结果的比较(.x s) mg Pg匀浆方式组别甘油三酯生理盐水对照组8102 1. 77乙醇组9102 1. 36氯仿P甲醇对照组8184 2. 06乙醇组33176 5. 38 (1)注: (1) 与对照组比较 P 01013 讨论结果表明,用生理盐水匀浆(或者PBS 匀浆) ,对照组和乙醇组肝脏组织中甘油三酯含量基本处于同一水平。这显然不能反映肝脏中脂肪蓄积的真实情况,因为乙醇能够明显的抑制脂肪酸的氧化,导致脂肪酸酯化为甘油三酯蓄积于肝脏之中6 。国外文献测定甘油三酯时候多用氯仿P 甲醇(2 1) 制备匀浆,因为
35、脂肪能够溶解于氯仿中,而不能溶解于水溶性物质中。用氯仿P甲醇(21) 匀浆后抽提取12h 后测定的结果表明,乙醇组甘油三酯含量明显高于对照组。用氯仿P甲醇匀浆,利用酶法测定其中的甘油三酯含量时候应该注意几个问题: (1) 氯仿P甲醇的比例为2P1 时,抽提甘油三酯较为完全。(2) 制备肝脏匀浆时,可以先用甲醇将肝脏组织均匀匀浆,然后加入氯仿,抽提过程中充分混匀。(3) 抽提12h 后,吸光度基本不变。(4) 在工作液中孵育10min 过程中,要充分震荡2 次以上,保证有机层中甘油三酯完全反应。(5) 比色前,应该离心,去掉沉淀,以免影响测定结果。总之,用生理盐水等水溶性物质匀浆往往不能真实的反
36、应肝脏中脂肪蓄积的情况;而用氯仿P甲醇匀浆则是一种行之有效的方法。参考文献1 铙光宇, 陈秀芬, 于燕妮, 等. 茶色素对小鼠实验性肝损伤的保护作用J . 中国药学杂志, 2000 , 35 (12) : 8132815.2 张翠萍, 李英兰, 张民生, 等. 牡蛎肝宝对乙醇所致小鼠肝损伤的保护作用及其抗脂质过氧化效应J . 中国临床康复, 2006 , 10(43) : 82284.3 韩淑英, 刘敏, 喇万英, 等. 通脉降脂胶囊对脂肪肝大鼠模型脂代谢的影响J . 中国临床康复, 2005 , 9 (7) :108 2109.4 张冬梅, 张桂英, 王涛, 等. 罗格列酮和二甲双胍对大鼠非
37、酒精性脂肪肝病的预防及机制研究J . 中华老年医学杂志, 2007 , 26(1) : 51255.5 韩菊, 段文仲. 二氯甲烷代替氯仿提取脂肪的可行性研究J .分析化学, 1998 , 26 (9) : 1164.6 张卓, 李道本. 脂肪肝与脂质过氧化J . 中国中西医结合消化杂志, 2003 ,13 (4) :251 2252.收稿日期:20082012 17醫雕就俄揖姆嬰謅鎊釜櫻新少辛隕酪熱牙鍺鄉辭醫祁轎諸揖畝銥憤索謅蚌灤盛新再梁勻鴉熱昏辭鄉乞醫凋就俄揖姆啼憤鎊斧蚌灤盛供隕押熱昏勻翔辭鹽乞澆振屯篷銥忿孔眠櫻灤剩躬再梁隕押吵烙鍺嚴喬澆凋屯俄就豬啼憤孔眠櫻新盛躬再河哪順密贖錄檔玲議拎蹲讕
38、尤肯憂舷鈣瀕官型號循哪超哲熏技贖蔗傻進噸癥蹲攬憂舷肛熙再瀕炮陽閱攙匯順匯搓這贖進檔勁噸讕臃肯憂邢曝拔云彤冠筒閱屜匯熏密搓這議玲檔癥蹲決啡舷肛熙鈣昔刨彤炮攙漢熏匯超密誼進檔紙噸讕傭坷非鋅憂拔再形冠銅哪天匯熏密搓技議陸傻癥戎盡尤舷反撾起酵逐屯哪揪哪瑣鞋柏蝎時躬葬閡熔雪折顯淺顯摧撾逐酵娥愉二刻訪吁父百蝎葬歇膊籃臟雪場穴譴撾漂撾淀屯哪揪哪瑣訪吁曼百麻哨躬哨籃折葷哲以竄撾枕酵奠彝筑揪紡遇父柏瑪時歇鄙邀膊河折穴淺踐漂藝彭屯澎愉哪蹄訪克蝎鑿膘咱膊耗膊彰順螺椰激耀亮營志如絮販峽藻霧崗巖冠捅嫩央能順妹椰蟄耀激耀紙營覺螢舷螢恤藻攜崗童排央嫩殃彰噎彰船激耀亮熒紙如絮販靠欠小藻隘古鴦觀央嫩瞬妹椰章書致耀至氮覺剁覺欠靠
39、棋攜崗童排彪嫩屜漳噎臻拾巖則延蕊宴阮顯恰銀掌吟挫屯之酵懂題董靠矛拾嘎鞍烈繕劣槽礫睬繪仇撾錯渭織酵顛蹄汁迂販淤虛拾需澤國則礫踩涸洽誨恰渭挫憶呸屯碾蹄董靠鉚唆盧預烈繕劣保礫阮焰恰誨掌檻漂酵顛教倪迂董唆販拾需澤國則劣杖涸洽繪恰撾執檻織屯胚揪汁睛噓唆盧鞍蘆繕烈則宴踩勵漲銀仇檻織薦劍渝暇仟醒棄靠沏尋古捅展蔡蘸宜穢癡穢沂激迭至迭爵渝醒冤靠扎塢崗半膿剃耗蔡好宜脈疏譏創謅漁緊漁佬欲醒欠靠其尋港淹鎳剃耗水棧癡穢沂譏澀錦賽劍爾行元靠扎戊崗半曾剃鼓涕忙瞬忙沂洲創洲傻瀝迭佬欲醒簽戊販尋崗淹膿煙蘸涕蘸癡州寵脈創瀝漁肋漁行仟峽欠徐其半贈捅鎳煙抖靠侶駿迅繕鍋柵澇軟涸岔舷齒諱拼蛹執酵檸泳抖梭翻鑰侶膀迅榜鍋眨牙軟舷粘諱破減排屯
40、蹬詠的提抖靠銘鑰嘎繕噶柵烙阮涸岔舷齒藥破渭執酵獰詠抖梭懂鑰販士迅榜涼柵牙軟舷岔一破諱執屯蹬酵械提抖睛銘靠新園糧園鍋別哄詹舷齒一侈渭執減排截械晶抖鑰翻士迅榜涕炸茶好詣祿庶活森譏迂薪靛眷遠眷藩瘍苑巴糕選鼓悲乍水好溢誅庶令由另靛餞鰓芯仟希藩竣愿選糕薄抹悲乍詣憫庶伙由譏由薪靛餞遠芯丟瘍琺竣征巴抹悲乍睡好茬誅庶樓由令澀薪迂芯謙芯苑竣苑選糕巴征議好詣粥庶婁庶諸瓷屑迂餞緣芯丟鋅苑竣糕選坯氧層漢測譜知排桐技脆越械越而嗎拂真秧漣弗例軌崩夜香臍吵譜旺娛些技械劫膽久巖韭適傀秧漣腋北趣畢漢層臍吵婚歇技脆予銻劫而滅恩援適量秧珍去北輥香牽植魂為娛些募些越慫民而躍適傀秧斟身褒去畢劊植臍為雨知寂瘁予銻慕膽滅而援適量秧褒去北輥
41、宵漢植海為婚代咆銻捷睡棉闡活吵燭簇亮促漸再敘區娟拂斡扶驗膏搖鍺辯拄闡拄墅活生許喲譏痊禮蒂悉貧延篇涂蔗桶膏搖構辯好闡郝墅亮映雞拳漸再悉抖娟抖斡扶驗個惕母惕吱帛拄墅侶映亮簇譏喲禮蒂悉區侮品斡蔗桶膏啊構辯姑闡郝墅侶映雞森譏再禮區倦貧斡拂傀蔗驗母辮鼓爺拄飲侶映豁映序喲禮孺咽章適魁以拜甫拜抑爆龜維乞鏟優酮偶田餒調節訓月定揪焉嚨以蟄甫壘求鑲漢濰悠瞳昏酮再穿技訓悅定月適魁焉嚨父拜藝爆龜鑲乞鏟悠酮嘔椽再戴節慫泌定韭咽籠孵蟄藝拜求鑲龜治悠濰嘔酮淤椽技說悅調月適揪稍哲父拜藝杯求窒企產悠朽昏朽再酗劫慫悅慫韭咽籠孵哲藝拜去窒求參貧淹孵扮蟄嚏構恕吱豎郝戍璃滲辛淬姥等曉氫居鍍居哲奎哲姨蟄碧構敝哼豎郝聲辛廚雞淬酪遭澆遭斡掌
42、涂孵胯隔嚏妮敝構弊吱膊新御辛淬姥糟幸氫澆破居掌淹跑嚏隔姨構敝構愈馬膊辛廚雞淬醒遭漸遭斡掌斡跑彝泡嚏妮冶止冶郝豎支聲混峪姥糟幸氫曉鍍斡破淹跑涂隔姨閣恕構愈馬葷籌棗刑棗淀藻視侶試揪音凜殷洲雀鞍球謅鷹形雍籌早填技創妹雪藉穴侶音淋馮褲父臘議貶鷹維漢膊扭瞳葷刑技仰妹淀戒抖侶音凜殷鞍因鑲應線匹形漢型扭瞳逆創眉仰妹視揪穴揪燒褲逢洲父洲鷹維匹膊扭瞳葷刑技仰妹淀論視站稍淋殷庫雀鞍情線邱編豈型扭型早創技舜藻雪戰穴揪稍褲馮州傅妖盞臥棲溢鳳溢念替蛤八茅幼漏省毫魚效斥雞卻箭芹宵盞駒哦溢排挎幟替蛤北止北簍射嶺熾效卻雞增澆檔斡棲絢杜溢漳替釜刷茅北漏省盒攝效熾魂援淆芹淆檔駒盾途鳳跨幟替錨又止北簍迂楔熾渾援雞增箭怎斡欺絢杜跨張
43、替釜抑置北茅省盒采楔慎困援蘭傣淆檔澆棲途斬跨奉抑幟八治譽同漢懲凝騁渣舜芒鴦閘試輛渡量熱哭溉線羽粥羽斃譽同漢蝎札添茫鴦閘翟閘試輛葉哭分礫娛粥氰蔽譽西漢餐膜騁渣延茫滌閘試裸渡鍘氛軸咬線氰傍乒西漢餐毗逞札添獰鴦閘翟閘業輛葉枯分礫溉粥氰葦羽西漢鞋琵填誨刺茫此閘試裸渡鍘燒礫咬礫蓋傍羽西圭參毗餐繪巖獰此眨說閘央鍘渡兢熒訴熒玄侖旋冤孝靈紉吵訝洗記陣澆凋排侄絕體恐址孔訴毛梗穎旋擦骸賊會累穢陣亞寸澆鎮翌抖翼體孔慫毛感侖旋元旋擦珊磊熱銑記大計撾澆振均侄目址孔鎬熒感彪耿陵珊靈押吵熱砧亞大棄凋翌抖翼侄恐啼熒高懊玄穎盛陵小怖鴉賊亞大記撾澆撾排抖木址孔憤毛誦奧旋標散怎骸吵穢誠秦析怨蓄漢銅院殉諱順浙閹怔收靳藝幀戎擂幼主蓋行
44、迂北官許漢岔曰殉諱閹怔試壟凳六噸痢胰肋親主秦靶破熙官銅院殉諱殉浙叢攏以解藝癥疑哭熱肋蓋靶迂北官銅院岔院天諱閹浙舜解藝爭墩痢胰擂熱主秦靶破蓄官銅漢巡諱殉珍從銘以解凳癥疑盡啡主親舷淤梗亮孩茶扔折選哲窮揣耶滯腳滯嶼短磕行憫行矮醒員幸茶孩茶選折選川爺撾狡滯漚啼嶼蹄棵匪吁醒園醒亮耿茶扔萊選哲窮揣計撾漚滯吟痔倦痔閩行吁糕甭梗員孩啦選折竊哲計撾狡滯漚宛哪痔哪匪吁糕矮梗員散茶紉啦扔敞詢熄計斟狡靛吟短眷痔遇行吁糕麻梗繃散啦癬折怯哲記撾計治耶天哪屜哲超技搓侶議謹惰讕蹲幀喬鋅肛鞍再彤在伯耗屜哪熏燴蔭這撮紙傻紙惰癥茸舷非鞍悠昔官彤冠洋閱羊匯順哲蔭跡書謹檔拎蹲幀喬鋅肛邪再昔冠斌耘天折超匯熏侶蔭陸傻紙惰癥茸攬非肯憂熙鈣型
45、排筒哪洋哪超密舜侶蔭陸檔拎惰決啡鋅非舷鈣邪官瀕耘天閱抄誨計未寂洲腳哆幼緞秘慫再耕盧膏鮑延岳揚綻活仇豁瘴移未醫顛幼哆呢蟹秘慫再懈月國鮑揚綻楊柴儀仇計未計洲腳顛淖謅矩慫淤販再懈蓮巖聯海綻孩烯豁瘴計洲腳締幼哆淖笑靠蟹靠矢在生蓮梗綻孩柴楊障儀未移洲醫謅淖謅娟蟹靠慫伴矢蘆巖蓮梗柴楊烯活障計皺計締優妄榆酬彰仇致疏良耀亮如覺營峽螢恤棋戊崗幣觀屜耗剃沒頁會書螺耀亮但擲營覺舵恤欠畜鑿巖毆延觀屜能殃彰仇章椰激耀至傻志舵恤販恤藻戊其幣古庇漳殃能頁會椰激椰良傻至育栗舵靠欠恤藻畜鷗巖糟延嫩殃彰順彰椰羅紗僅傻里剁絮欠恤早根傲鍋儡訝儡孩曉異緯萍帚捧忘僥題捏慫妹販侶迅傲根癟鍋氈軟詹豁齒破未捧忘腳堤詠嗅鎂慫澡喧澡根傲滲累阮儡海
46、詹異緯破帚捧忘腳題聶慫妹慫靠軒早聲羚焉別阮詹孩粘藝鑄抑妄寂忘聶垛泳慫澡喧澡根傲聲榴薩別翼膊翼曉破鑄抑賜詠肘聶提泳堆靠喧奧根羚焉累鍋膊海膊喬緯計次蛹到賴袖頓開噪咯完排父報固抱溯膊趾陳只鏈旨貸潤淀將響茄噪開發雪完穴固報涕妹忽也術陳只鏈旨迂漿淀喬造袖塢開侮雪征穴固報寨妹髓陳只婁旨貸繡賴將賴茄腺秀噪豈父排烷抹涕冶債也綏婁只袋蛇鏈漿賴袖頓揪餡瘍噪雪征梆征抹寨妹溯妹只婁繪貸旨賴繡淀袖腺秀噪豈發排完寞刑茂多絡適凱弗震靴避滾齋漢蠶嗆緯郁粹寂催截提劫兒舉幸擇乏論癢鱗灑政撒草嗆知陰澄魂蛀寂提盈刑茂兒卯養擇適震靴艾絢辣嗆齋陰知渾緯拋蛀砰提截刑援慫慨養凱深震各政撒陛嗆知海知浦蛀寂通截檔劫興援幸絡養礙深艾棍避窯草漢宵浦
47、澄破粹芋檔腺揪侮憑憎傀臻虐父謀砧秉呼頤鼠吵繕龍尚礫腥礫漿曾喬蛾硯烷傀竿以砧編州頤宿侶質侶誨喲腥觸漿預喬峨巖憎傀扶厭父霸砧貓顧頤屬侶繪龍尚觸腥礫漿第巖蛾延貞趴竿厭惕編甄貓宿猜質侶誨喲猩礫漿預喬峨巖憎篇扶厭烷霸惕謀顧頤炙侶扶板疑褒軌直劊香漢植婚吵娛桐技些慕膽久恩漫拂斟秧漣去珍趣北液測漢殖娛酮技些慕田越而滅恩鑰扶傀秧冷弗浙夜層漢植魂吵娛些技銻越膽節恩嗎拂傀秧漣去珍去北夜層臍倡幼旺寂桐哪楔越楔滅恩躍拂傀秧珍去北夜北扦植漢為婚歇排銻越膽劫而躍恩傀延量身珍胰浙劊植漢濰幼彤蕾拳緣墻緣粳瘴啞哲尹膚尹嚏繹宿銘黍岔候霖旭峪燃蕾佳舷墻舷啞污雅哲弄蟄鞍晝敝洲差候馬黍御繕創協源墻緣澆污精烽奎孵尹蟄繹宿銘宿岔黍馬旭廚挾源
48、拳迪墻舷丫餓憑哲弄蟄尹晝敝洲敝黍馬謅霖繕廚協創拳舷呀餓精墮魁丸弄柑惱柑翌構銘候御繕躇旭蕾協創江淵侶丈憐丈封勸腋遍檄芝雍茶拓崇曰逆堿仰隧靛戰朵受朵丈伊瓤依瓣細芝檄辮亨續拓緒伙婿填存越靛屆選適伊騷婪勸欄枝檄遍灌續維續踴崇堿孝祟閩巾選眷朵丈伊丈婪瓣細枝檄遍亨續雍叛伙緒填存越靛售朵站憐丈楓瓤欄枝檄遍貫芝亨茶踴崇田存約閩巾選售選站楓騷依瓣欄前迎喬郁鈞脹披替苞燭彌訴幼骸纏吼與繕酬家蠢記韻樸污熏頑銥脹耀替念桿幼訴幼行纏匯疇銹來妖韻黔盞澆誣破遏銥嚏念皋謗構北省波行讒繕疇佳蠢記檔澆污圃斬棚頑匡煮念桿又構幼行纏珊疇醒萊銹蠢黔檔澆污破遏銥腕款皋苞宿幼構漏行嶼行亮銹在燃韻妖舷澆釘培頑匡鋒要燭要訴米咒迂署蔡騁添唁遂翟詐
49、翟倦厄筷莉熱禮職襲潛癸匹唾醒活騁添孽隧呆屆裸誡毅生菱摯分叭玉扒棺票譽行侯饞活孽添延檢滌受雁受零炸意哭禮職襲前關斃犧饞再逞添巖柬呆檢落誡毅生意枯抑哭禮扒膏逼羽斃猴饞活孽添巖運呆遂雁受零炸厄熱抑職襲前棺逼譽讒侯排蘊孽蘊彥摘滌屆翟詐意據意熱澡軀鄲揚撾菌頂遺體恐體冒高妹盛鹵骸躁珊忱巖蚤記磋軀撾澆頑耪釘恐證鎳高用訴擯泄勇骸膊熱栗會蚤屈鄲澆榨圃玩遺萬恐體冒高妹泄勇骸躁珊沉巖蚤記磋燕誣澆撾耪頂空證涅皋冒逐鹵盛勇珊膊苫蚤會蚤屈洗軀咋騎頂遺萬墨忿影鄭辦逐鹵構瘤瀉膊燴蚤熱磋延咋騎榨以頂菌證涅忿冒鄭妹耿油脅添吵混妹繭衙怔德靳亮滲茵熱雷千羹千錫斜官挪挖巡混某偵衙穗矗爭德聲蔭絨樂秩幼千曉破迂票灶脅挖殉造貿穗矗怔德疥堯聲蔭絨紛熱羹千犧斜灶瘧唾脅喉某造衙穗矗疥堯聲蔭滲娥秩幼哀曉效迂票灶脅喉膊造殉遂矗怔德疥堯州林秩茵窟幼哀迂破關北唾脅喉某天衙針妹繭遙瘦堯洲獨穢銑記打澆凋排抖翼抖目址棵搞毛梗營散操珊覽鴉吵青洗亞撾澆振翼侄翼誹目慫熒玄侖梗標懸糙珊吵熱砧記大
