多项实验操作技术.doc

1、华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文1实验用方法步骤Sup 1.1 PCR （使用 Transgene PCR Taq Mix，货号： 20915）1. 在 PCR 反应管中调制反应液：Reagent Quantity, for 25l of reaction mixtureTaq DNA Polymerase Mix 12.5 l 10M Primer 上游 1 l10M Primer 下游 1 lcDNA 1 lSterile deionized water Up to 25lTotal 25 l /Sample 反应体系根据实际情况调整 将上述各成分加入到 0.2ml 的 PC

2、R 薄壁管中；2. PCR 扩增：Step Temperature, C Time, min Number of cycles Note起始变性 95 3 1变性 94 0.5退火 60-70 0.5退火温度比理论退火温度大概低 5C，再根据反应结果优化延伸 72 0.5-1.530-35每分钟延伸 1000bp最终延伸 72 10 1反应结束后，取扩增样品 5l，琼脂糖凝胶电泳分析结果，DNA marker 判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备分析使用。华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文2Sup 1.2 琼脂糖核酸电泳1 用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放于制胶板上，架好梳子；2

3、 根据 DNA 片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的凝胶：称量琼脂糖干粉，加入三角烧瓶内，加入 TAE 电泳缓冲液（2030 ml） ；3 微波炉内加热熔化，冷却片刻，加入荧光染料(EB)，充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；4 室温下凝胶完全凝结后，拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；5 倒入电泳缓冲液（量以没过胶面 1mm 为宜） ，除去样品孔内气泡；6 DNA 样品中加入 10Loading buffer，混匀，将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；7 接通电源，红色为正极，黑色为负极，使 DNA 样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。电压 60100V，电泳时间 2040

4、min；8 根据指示剂泳动的位置，待指示剂到达胶 3/4 处时终止电泳；9 在凝胶成像仪上观察电泳带及位置，并与核酸分子量标准 Marker 比较被扩增产物的大小。 琼脂糖凝胶浓度与线形 DNA 的最佳分辨范围琼脂糖凝胶浓度 线形 DNA 的最佳分辨范围（bp）0.5% 1,00030,0000.7% 80012,0001.0% 50010,0001.2% 4007,0001.5% 2003,0002.0% 502,000Sup 1.3 胶回收纯化 DNA1 琼脂糖电泳，将目的条带用刀切下放入到 EP 管中，称量重量；2 按照每 100mg 加 400l 的量加入 binding buffer

5、，57 振荡器中温育振荡，直至溶解；3 取出纯化柱，将上述溶解液转移至柱中，室温下放置 2 min，8,000rpm 离心 1 min，弃 EP 管中的液体，将纯化柱放回 EP 管中；4 加 700l 的 wash buffer 至柱中，8,000rpm 离心 30 sec，弃收集管中的液体；5 加 500l 的 wash buffer 重复洗涤一次，最后将纯化柱放入 EP 管中 10,000rpm 离心 30 sec，除去残留的 wash buffer；6 将纯化柱放入一个新的 EP 管中。加 3040l H2O 或者 Elution buffer 至纯化柱膜的中央，室华 中 科 技 大 学

6、 博 士 学 位 论 文3温放置 2 min，10,000rpm 离心 1 min 洗脱 DNA，将 DNA 溶液放置-20保存备用。Sup 1.4 酶 切（应用 NEB 限制性内切酶，双酶切）1. 确定待切样品的浓度，选择合适的限制性内切酶和 Buffer。2. 在 0.5 ml 的 EP 管中加入如下成分：Reagent Quantity, for 40l of reaction mixture10Reaction Buffer 4 l 限制性内切酶 1 2 l限制性内切酶 2 2 l待切样品 xl（根据浓度确定）Sterile deionized water Up to 40lTotal

7、 40 l /Sample3. 混匀样品，离心使样品沉于管底。4. 将离心管置于 37中温育 1-3 hr。5. 用未酶切的质粒或 DNA 片段作为对照，琼脂糖电泳鉴定酶切结果。Sup 1.5 连 接（应用 NEB T4 DNA 连接酶）1. 确定待经酶切回收后的载体和片段的浓度。2. 在 EP 管中加入如下成分：Reagent Quantity, for 40l of reaction mixture10Reaction Buffer 4 l T4 DNA 连接酶 2 l待连接样品 载体与片段的 mol 比为 14Sterile deionized water Up to 40lTotal

8、40 l /Sample3. 混匀样品，短暂离心使样品沉于管底。4. 16连接过夜，连接完的样品直接用于转化或-20冰箱保存备用。Sup 1.6 转 化（应用 Transgene 公司 DH5 感受态细胞）1. 取一只感受态细胞于冰上融化。华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文42. 加入 1l 纯质粒或全部 20l 连接产物，吹打混匀，冰浴 30 min。3. 42水浴，90 sec，立即放入冰浴中 2 min。4. 加入 0.8ml SOC，于 37 恒温摇床上 250rpm1hr 温育。5. 将菌液 4000rpm/min 离心 5min，留 200l 上清将菌体再次混匀，均匀涂

9、于含抗生素的琼脂平板表面，平板于 37倒置培养过夜。Sup 1.7 重组子的筛选和鉴定1. 挑取平板上的菌落接种于 10ml 含适当抗生素的 LB 培养基中，37摇床培养过夜。2. 取菌液 3-4ml，13,000rpm3min 离心，弃上清。3. 小量制备质粒 DNA(使用 Qiagen 质粒小量制备试剂盒 )。4. 酶切分析，酶切样品进行琼脂糖电泳鉴定是否有目的片段。5. 酶切鉴定正确的重组子分成两份，一份保种，另外一份进行测序反应。Sup 1.8 质粒的大量制备（碱裂解法）1. 配制 100ml LB 3 瓶，高压灭菌备用，冷却至室温后，每瓶各加 100l 筛选抗生素（储存液），加菌液

10、150l，37，300rpm，过夜2. 取出菌液，倒入 EP 管，每管约 40ml3. 4，10000 rpm 离心 5 min4. 去上清，每管加入 5ml 冰预冷的灭菌 STE 洗涤沉淀，2 管合 1 管5. 4，10000 rpm 离心 5 min，去上清6. 每管加入 8ml 灭菌的溶液，混匀，将沉淀充分悬浮起来7. 加入 16ml 溶液，混匀，室温放置 10 min，轻轻地颠倒 5-10 次8. 加入 12ml 溶液，轻轻混匀，勿剧烈晃动，冰上放置 10 min9. 4，10000rpm 离心 15 min10. 取上清，每管约 36ml11. 每管分成 2 管，每管加入等体积的异丙

11、醇，混匀，-20放置 10 min，沉淀核酸12. 4，10000rpm 离心 10 min13. 去上清，每管加入 2ml 70乙醇洗涤沉淀14. 4，10000rpm 离心 5 min，去上清，干燥15. 干燥后，取其中 1 管加入 1ml 灭菌的 TE，溶解沉淀后取出依次溶解其余几管16. 在第一管中再加入 1ml TE 洗一遍，各管均用此 1ml TE 洗，最终沉淀溶于 1 管，体积共2ml华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文517. 加入 2ml 5M Licl（已过滤）， -20放 10 min，沉淀 RNA18. 4，10000rpm 离心 10 min19. 收集上清

12、约 4ml，加入等体积异丙醇沉淀核酸，-20放 10 min20. 4，10000rpm 离心 10 min21. 去上清，用 70乙醇 2ml 洗涤沉淀22. 4，10000rpm 离心 5 min，去上清，干燥23. 加入 1ml 含 RNase 的 TE（20g/ml）溶解核酸沉淀，37放置 30 分钟，转入小 EP 管中24. 加入等体积酚，混匀，4，10000rpm 离心 5 min，收上清25. 加入等体积酚氯仿，混匀， 4，10000rpm 离心 5 min，收上清26. 加入等体积氯仿，混匀，4，10000rpm 离心 5 min，收上清27. 加入 100l 10M NHAc

13、（已过滤）， 1ml 无水乙醇，混匀，-20 放置 10 min28. 4，10000rpm 离心 5 min，去上清，无菌操作台内干燥29. 加入适量的无菌 TE 溶解沉淀。30. 稀释 200 倍测 OD260 值：DNA 浓度=OD稀释倍数50(g/l) (OD260/OD280 应 1.8-2.0 间) ，-70 保存或20备用。Sup 1.9 真核细胞的转染（应用 Invitrogen 公司转染试剂 Lipofectamine2000 和 Gibco 公司无血清培养基 Opti-MEM，货号：31985 ）1. 在 6 孔板中接种 1-3105 细胞/孔，加入 2ml 完全培养基，置

14、含 5% CO2 孵箱中 37培养过夜2. 待细胞长到 50-80%时，在无菌离心管中配制如下溶液：a) 溶液 A：将 2g 待转染的超纯 DNA 稀释到 250l 无血清培养基中b) 溶液 B：将 8l Lipofectamine2000 稀释到 250l 无血清培养基中3. 混合溶液 A 和 B，轻轻混匀，无菌操作台室温放置 20min4. 用 2ml 无血清培养基轻轻洗涤细胞，每孔加入 1.5ml 无血清培养基，将脂质体复合物加入到孔中，摇晃混匀，置 CO2 孵箱中 37孵育 6 hr5. 用完全培养基替换转染液，继续培养6. 24-72hr 后进行后续实验Sup 1.10 重组腺病毒构

15、建，扩增及纯化（AdEasy System ）1. 目的基因的克隆（pAdTrack-CMV）华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文6a) 选择适当酶切位点，进行酶切连接，将目的片段插入 pshuttle-CMV 或 pTrack-CMV 质粒b) 重组质粒鉴定： 酶切鉴定或测序鉴定c) 重组质粒扩增，纯化并准备适量含目的基因的穿梭质粒d) 用 PmeI 单酶切线性化重组穿梭质粒，电泳鉴定质粒是否完全被切开e) 胶回收线性化质粒，以备共转化使用2. 共转化a) 大肠杆菌 BJ5183 电转感受态制备i. 琼脂板上挑取单个 BJ5183 菌落，接种于 LB 培养基中，37摇菌过夜ii.

16、接种 25ml 过夜培养物于 500ml LB 培养基，37振摇，至 OD600 达到 0.6iii. 迅速将培养物置于冰浴中 30min，至充分冷却iv. 将菌液转移至预冷的离心管中，4，4000 rpm 离心 15 min，弃培养液，回收细胞v. 以 10ml 预冷的 10%甘油洗涤沉淀，低温离心，共两次vi. 加约 1ml（适量）预冷的 10%甘油重悬沉淀，稀释悬液 100 倍，测量 OD600，至稀释浓度为 2-31010 个细胞/ ml (1.0 OD600 约 2.51010 个细胞/ml) ，分装，-80 保存备用b) 病毒骨架质粒转化感受态大肠杆菌，扩增，纯化c) 将 1-5l

17、 (约 1g) 线性化的穿梭质粒及 1l（约 100ng/l）病毒骨架质粒（pAdEasy-1）加入至含约 40l BJ5183 电转感受态的 EP 管中混匀,冰上冷却d) 将混合物加入电转杯，电击（1800-2200V/mm,5ms）e) 取出样品，加入 0.8ml SOC 或 LB 培养液，37，250rpm 振荡 40minf) 室温，4000rpm 离心 5 min，弃部分上清（保留 0. 2ml）g) 混匀细菌涂于含抗性平板（25-50mg/ml） ，37培养 16-20hrh) 挑取平板上长出的菌落（较小的菌落为宜） ， 接种于 8ml 的 LB 培养基，37培养 10-15hri

18、) 碱裂法提取质粒，进一步酶切鉴定。以 PacI 单酶切，0.8% 琼脂糖凝胶电泳如显示出一条大片段（约 30kb） ，及一条小片段（约 3.0 或 4.5kb）华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文7j) 取 1-5l 阳性质粒转化至 DH5 大肠杆菌细胞，扩增细菌并纯化质粒3. 重组病毒质粒和包装质粒共转染 293A 细胞a) 293A 细胞培养：接种 2106 293A 细胞于 25cm2 培养瓶，使生长密度约 50-70%，换无血清培养基培养b) 以 PacI 单酶切重组病毒质粒（约 4g） ，完全线性化后，乙醇沉淀，再以 20 l ddH2O溶解c) Lipofectamin

19、e2000 转染重组病毒质粒和包装质粒，37，5% CO 2 培养 6hrd) 6hr 后，弃无血清培养基，另加入 6ml DMEM 完全培养基（含 10% 胎牛血清）e) 培养过程中观察细胞生长情况。约 5-7d 后可观察到细胞绿色荧光4. 重组病毒鉴定a) 转染 5-7d 后，收集细胞沉淀，加入 2ml 灭菌的 PBS 混悬，冻融细胞，离心后收集上清保存于-80b) 取 30-50% 步骤 a 中上清，感染 50-70%饱和度的 25cm2 培养瓶中 293A 细胞，2-3d 后可见细胞变圆，脱壁，漂浮c) 感染后 3-5d，当 1/3-1/2 细胞漂浮时收集细胞，反复冻融法裂解细胞（37

20、 2min，液氮15min，反复 4 次） ，获得病毒d) 通过 PCR 鉴定重组腺病毒产生，取 5l 病毒上清加入 10l 蛋白酶 K，55孵育 1hr，再煮沸 5min，离心后取 1-2l 作 PCR5. 重组病毒扩增，纯化a) 75cm2 培养瓶中接种 293A 细胞，至密度达到 90%，加入适量病毒上清感染细胞b) 细胞变圆，且有 1/3-1/2 细胞漂浮，收集细胞，1500 rpm 离心 5min，弃上清c) 以灭菌 PBS 重悬沉淀，反复冻融 4 次。4下 10000rpm 离心 5mind) 使用 SICOR Biotech 腺病毒纯化试剂盒纯化腺病毒（货号：1160440）Su

21、p 1.11 细胞核/细胞浆蛋白提取（使用凯基公司试剂盒，货号：KGP1100 ）1. 取培养细胞 5106-1107 个/mL，弃去培养液，细胞用预冷的 PBS 洗涤两遍2. 用 1mL 预冷的 PBS 刮下细胞转移至预冷的 1.5mL 微量离心管中3. 4离心，1500rpm，5min 收集细胞，尽可能取去上清，勿留残液，估计细胞压积 PCV（离华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文8心后的紧实细胞体积）4. 每 20L 细胞压积中，加入 200L 预冷的 BufferA(使用前每 mLBufferA 加入1LDTT，5LPMSF(100mM，溶于异丙醇)，5L 蛋白酶抑制剂 )，

22、最大转速涡旋剧烈振荡15sec，放置冰上 1015min5. 加入 11L 冷 Buffer B，最大转速涡旋剧烈振荡 5sec，放置冰上 1min； 6. 最大转速涡旋剧烈振荡 5sec 后，4离心，12000rpm ，5min7. 将上清转入另一预冷的洁净微量离心管，置于冰上，得胞质蛋白8. 离心沉淀物（细胞核）中加入 100L 预冷的 Buffer C（使用前每 ml Buffer C 加入 1L DTT，5LPMSF，5L 蛋白酶抑制剂） ，最大转速涡旋剧烈振荡 15s，放置冰上 40min，每间隔 10min 涡旋剧烈振荡 15sec9. 4离心，12000rpm，10min，尽快将

23、上清转入一预冷的洁净微量离心管，得核蛋白10. 上述提取的胞质蛋白和核蛋白进行蛋白定量（BCA 法） ，分装并保存于-80备用Sup 1.12 Western Blotting1. 蛋白样品制备a) 组织样品在含液氮的研钵中研磨成粉状，转入 EP 管中；培养细胞样先倒掉培养瓶或六孔板中培养液，按照细胞冻存方法收集细胞，1500rpm 离心 5 分钟收集细胞b) 每瓶细胞加 3ml 4预冷的 PBS（0.01M pH7.2 7.3） ，1500rpm 离心 5 分钟，将 PBS 弃净后置于冰上（组织样品省去此步骤） 。c) 按 1ml RIPA 裂解液加 10ul PMSF（100mM ） ，混

24、匀置于冰上。d) 每 5106 细胞加 400l 含 PMSF 的 RIPA 裂解液，冰上裂解 30min，使细胞充分裂解。e) 4，12000rpm 离心 5min。f) 将离心后的上清分装转移倒 0.5ml 的离心管中放于-80保存。2. 蛋白含量的测定取每份蛋白样品，按 BCA 法测定蛋白浓度（BCA 试剂盒购自 Pierce 公司，货号：115986 ） 。3. SDSPAGE 电泳和转膜a) 清洗玻璃板：洗洁精擦洗过后用自来水冲洗，双蒸水冲洗干净后立在筐里晾干b) 灌胶与上样i. 玻璃板对齐后放入制胶夹中卡紧。配 10分离胶，加入 TEMED 后立即摇匀灌胶，华 中 科 技 大 学

25、博 士 学 位 论 文9待胶面升到绿带中间线高度，胶上加一层水或异丙醇，液封胶凝ii. 胶充分凝固后倒去胶上层水或异丙醇并用吸水纸将水吸干iii. 配 4的浓缩胶，加入 TEMED 后立即摇匀灌胶，将剩余空间中灌满浓缩胶，插入齿梳，待胶凝固后以电泳缓冲液冲洗一次，将其放入电泳槽中，拔出齿梳。iv. 计算含 40-50g 蛋白的溶液体积上样， 取出样品至 200l 的 EP 管中，加入2SDS 上样缓冲液至终浓度为 1，沸水中煮 5-10min 使蛋白变性，加入溴酚蓝指示剂。v. 加足够的电泳液后上样。c) 电泳：浓缩胶 80-100V，到分离胶以后用 120V，电泳至蛋白 Marker 完全分

26、开，根据目的蛋白的分子量确定适当电泳时间。d) 转膜：100V 恒压转印 2.5 hr 4. 免疫反应a) 将膜用 TBST 从下向上浸湿后，移至含有封闭液（5%脱脂牛奶，TBST 配制）的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭 1hr。b) 将一抗用 TBST（1：1000 或其他适宜浓度）稀释，室温下孵育 2 hr 后，用 TBST 在室温下脱色摇床上洗两次，每次 5-10min；再用 TBST 洗一次，10min。c) 二抗室温下孵育 2 hr，用 TBST 在室温下脱色摇床上洗两次，每次 10min；再用 TBST洗一次，10min，进行 ECL 检测。5. 化学发光，显影，定影，图像分析a

27、) 将 A 和 B 两种试剂在 EP 管中等体积混合；1min 后，将混合液点于膜上，1min 后，将膜移至一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入 X-光片夹中。b) 在暗室中，将 1显影液和定影液分别到入平皿中；在红灯下取出 X光片，用切纸刀剪裁适当大小；打开 X-光片夹，把 X-光片放在膜上，根据信号的强弱适当调整曝光时间。 c) 曝光完成后，打开 X-光片夹，取出 X-光片，迅速浸入显影液中，出现明显条带后，终止显影d) 把 X-光片浸入定影液中，定影时间一般为 5-10min，以胶片透明为止e) 自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干6. 凝胶图象分析：将胶片进行扫描，用 Bio-Rad 凝胶

28、图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文10附. 配制 Tris-甘氨酸 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）溶液成分 5 10 15 20 25 30 40 506%水 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.530%丙烯酰胺溶液 1 2 3 4 5 6 8 101.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.510% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.510%

29、过硫酸氨 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5TEMED 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.040 0.0508%水 2.3 4.6 6.9 9.3 11.5 13.9 18.5 23.230%丙烯酰胺溶液 1.3 2.7 4 5.3 6.7 8 10.7 13.31.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.510% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.510%过硫酸氨 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0

30、.4 0.5TEMED 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.040 0.05010%水 1.9 4 5.9 7.9 9.9 11.9 15.9 19.830%丙烯酰胺溶液 1.7 3.3 5 6.7 8.3 10 13.3 16.71.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.510% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.510%过硫酸氨 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5TEMED 0.005 0.010 0.015 0.02

31、0 0.025 0.030 0.040 0.05012%水 1.6 3.3 4.9 6.6 8.2 9.9 13.2 16.530%丙烯酰胺溶液 2 4 6 8 10 12 16 201.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.510% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.510%过硫酸氨 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文11TEMED 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.040

32、 0.05015%水 1.1 2.3 3.4 4.6 5.7 6.9 9.2 11.530%丙烯酰胺溶液 2.5 5 7.5 10 12.5 15 20 251.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.510% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.510%过硫酸氨 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5TEMED 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.040 0.050附. 配制 6% Tris-甘氨酸 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺

33、凝胶电泳 5%积层胶所用溶液不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）溶液成分 1 2 3 4 5 6 8 10水 0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1 5.5 6.830%丙烯酰胺溶液 0.17 0.33 0.5 0.67 0.83 1 1.3 1.71.5 mol/L Tris (pH8.8) 0.13 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75 0 1.2510% SDS 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.110%过硫酸氨 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1TEMED 0.005 0.0

34、10 0.015 0.020 0.025 0.030 0.040 0.050Sup 1.13 流式细胞仪细胞周期分析（SubG1 法）1. 细胞培养至对数生长期，加入处理因素处理至预定时间后，以胰酶消化细胞，适时终止消化，取约 1107 个细胞置低速离心机 1200 rpm 离心 5 min。2. 以冰预冷的 PBS 洗两遍，1200 rpm 离心 5 min。3. 将细胞以 80的冰乙醇固定，置-20放置过夜。4. 将固定好的细胞离心，去除乙醇后以 PBS 洗二遍。5. 去上清，每管加入 PC Buffer 100l，室温放置 30min，其间每 10min 振荡一次。6. 以 PBS 洗一

35、遍，离心，去上清。7. 每管加入 RNase 10l，10PI 5l，4避光放置 30-50min 后上机检测8. Modfit 3 软件分析细胞周期结果。华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文12华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文13Sup 1.14 流式细胞仪检测细胞内 Ki-67 的表达1. 乙醇固定过夜的细胞 1500rpm 离心 5min，去上清2. PBS 洗涤一遍，1500rpm 离心 5min3. 0.5% Triton X-100 500l 处理细胞，冰上放置 5min4. PBS 洗涤一遍，1500rpm 离心 5min5. 以 1% BSA 稀释一抗（

36、1:100）6. 将 100l 一抗稀释液加入细胞管中，用加样枪吹打混匀，放置 4冰箱中过夜。7. PBS 洗涤一遍，1500rpm 离心 5min，去上清8. 以 1% BSA 稀释 FITC 标记的荧光二抗（1：20）9. 将 100l 荧光二抗稀释液加入细胞中，混匀，室温避光放置 30min。10. PBS 洗涤一遍，1500rpm 离心 5min11. 加入 500l PBS、20l PI 染色液 （含 500g/ml，1%Triton X-100）和 10l RNase （5g/l ）室温避光放置 20min，流式细胞仪检测Sup 1.15 3H-Thymidine 检测细胞 DNA

37、 合成1. 用 PRON 处理 24 孔板一小时，用 PBS 洗两次，种植细胞 4105 个细胞/孔2. 用含 10%FBS 的 DMEM 培养细胞 24 hr。去除含 FBS 的 DMEM 培养基，用 PBS 清洗一次。加入不含 FBS 的 DMEM 培养基饥饿细胞 24 hr3. 去除饥饿培养基，换上完全培养基及处理因素处理细胞，同时每孔加入 1uCi/ml 的 3H-Thymidine（取 1MCi/ml 的原液，稀释 10 倍）10ul ，培养 24 hr4. 去除培养基，用冰预冷的 PBS 清洗细胞一次5. 每孔中加入 1ml 冰预冷的 10%TCA，固定细胞 30min6. 去除

38、TCA，加入 250ul 0.3mol/L 的 NaOH，用 NaOH 吹打沉淀，完全溶解沉淀。7. 转移溶解后的沉淀到 Micro beta 专用 24 孔板，并与液闪液 1：1 混合 10min8. 完全密封 24 孔板，在摇床上剧烈振荡约 10min，使 DNA 溶液与液闪液充分混合9. Micro beta 检测Sup 1.16 总 RNA 提取（Trizol 法提取）1. 样品准备：a) 组织样品：取新鲜组织样品或液氮中保存组织样品，置盛有液氮的研钵中研磨成粉状b) 细胞样品：将预定处理因素处理后的细胞以 0.25%胰蛋白酶（不含 EDTA）消化，离心收集于 EP 管中，PBS 洗一

39、遍后置于冰上备用。华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文142. 提取组织 RNA 时，每 100mg 组织用 1ml Trizol 试剂对组织进行裂解；提取细胞 RNA 时，每5-10 x106 个细胞加 1ml Trizol 后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；3. 将组织或细胞的 Trizol 裂解液转入 EP 管中,在室温（ 15-30）下放置 5 min；4. 每 1ml Trizol 加 0.2ml 氯仿，剧烈震荡 15 sec，室温下（ 15-30）放置 2-3 min 后，12000rpm（4）离心 15min；5. 取上清，每 1ml Trizol 加 0.5ml

40、异丙醇， 室温（ 15-30 ）放置 10 min，12000 rpm（28）离心 10min；6. 弃上清，加 1ml 75%乙醇进行洗涤沉淀，涡旋混合，9000 rpm（4）离心 5 min，弃上清；7. 让沉淀的 RNA 在室温下自然干燥（不能过于干燥） ，用 RNase-free water 溶解 RNA 沉淀，-80保存备用。Sup 1.17 cDNA 第一链合成（应用 Ferments 试剂盒，货号：0049509 ）1 取提取的总 RNA 样品 750ng-1000ng，调制反应液：Reagent Quantity, for 40l of reaction mixtureTota

41、l RNA 2l(750ng-1000ng)Oligo(dT)18 2lRNase Free dH2O 20lTotal 24l /Sample2 将混合液置 65孵育 5 min3 配制如下混合液后混入上述样品中：Reagent Quantity, for 40lRNase Inhibitor 2l(750ng-1000ng)5Reaction Buffer 8l10 dNTP 4lMaxima Reverse Transcriptase 2l Total 16l /Sample4 将上述混合物置 42孵育 60min，65孵育 5min 后，置-80备用。Sup 1.18 转染细胞的稳定筛

42、选华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文151 确定抗生素作用的最佳浓度：a) 提前 24 hr 在 96 孔板或 24 孔板中接种细胞 8 孔，接种量以第二天长成 25%单层为宜，置 CO2 孵箱中 37培养过夜。b) 将培养液换成含抗生素的培养基，抗生素浓度按梯度递增（0, 50, 100, 200, 400, 600, 800 和 1000g/ml） 。c) 培养 10-14 天以绝大部分细胞死亡浓度为准 ,一般为 400-800g/ml，筛选稳定表达克隆时可比该浓度适当提高一个级别维持时使用筛选浓度的一半.2 转染按 Sup 1.9 步骤进行。3 转染 72 hr 后按 1:1

43、0 的比例将转染细胞在 6 孔板中传代，换为含预试验中确定的抗生素浓度的选择培养基。在 6 孔板内可见单个细胞，继续培养可见单个细胞分裂繁殖形成单个抗性集落，此时可用两种方法挑选单克隆。a) 滤纸片法：用消毒的 5 x 5mm 滤纸片浸过胰酶，将滤纸片贴在单细胞集落上 10-15sec，取出粘附有细胞的滤纸片放于 24 孔板中继续加压培养。细胞在 24 孔板中长满后转入25cm2 培养瓶中，长满后再转入 75cm2 培养瓶中培养。b) 有限稀释法：将细胞消化下来后做连续的 10 倍稀释（10 -2-10-10） ，将每一稀释度的细胞滴加到 96 孔板中培养，7-10d 后，选择单个克隆生长的孔

44、再一次进行克隆。4 Elisa 或 Western blot 检测单克隆细胞中外源蛋白的表达情况，由于不同克隆的表达水平存在差异，选择表达量最高的克隆传代并保种。Sup 1.19 Anexin-V/PE 细胞凋亡检测1. 细胞用不含 EDTA 的 0.25%胰蛋白酶消化收集；2. 用 PBS 洗涤细胞二次（1200rpm, 5min），取 1106 细胞用于染色；3. 用 400l Binding Buffer 悬浮细胞；4. 加入 5l Annexin V, 混匀，加入 5l PI，混匀；5. 室温避光反应 10 min，流式细胞仪检测。Sup 1.20 BrdU/PI 双参法测定细胞 DN

45、A 合成1. 取固定后细胞 PBS 洗 1 遍，PBS-T（含 0.1%BSA，0.5%tween-20）洗 1 遍，1200rpm，5min.2. 弃上清，向每管细胞中加入 2N 盐酸 500l（250l PBS-T+250l 4N HCL），室温下放置约45min, 1200rpm,5min.3. 弃上清，以 0.1M 四氢硼砂（PH=8.0）洗 1 遍，1200rpm,5min, 弃上清4. PBS-T（含 0.1%BSA，0.5%tween-20）洗 1 遍，1200rpm,5min, 弃上清华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文165. 加鼠抗 BrdU 一抗（1：100 稀

46、释），4孵育 2 hr，1200rpm,5min, 弃上清6. PBS-T（含 0.1%BSA，0.5%tween-20）洗 1 遍，1200rpm,5min, 弃上清7. 加 FITC 标记的羊抗鼠二抗（ 1：20），室温避光放置 1 hr 后，1200rpm,5min, 弃上清8. 每管加入 PBS-T（含 0.1%BSA，0.5%tween-20）100l, RNase 10l，10PI 5l，4避光放置 15min 后流式细胞仪检测。Sup 1.21 免疫组化染色1. 切片的预处理：a) 洗衣粉液浸泡 30 分钟，冲洗，晾干b) 洗液 （含强酸、高锰酸钾等）浸泡 24 hr，冲洗，晾干

47、c) APES（1:50 丙酮溶液） 10-20 sec（使用玻璃容器和切片架）d) 纯丙酮 I，约 10 sec。纯丙酮 II，约 5 sece) 晾干，备用2. 石蜡切片免疫组化染色实验步骤：a) 石蜡切片脱蜡至水：（染色前应置 60 1 hr ）i. 二甲苯 I、II ，各 10 minii. 梯度酒精：100%, 2 min; 95%, 2 min; 80%, 2 min; 70%, 2 miniii. 蒸馏水洗： 5 min，2 次（置于摇床）b) 过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H 2O2，室温 10 min（避光）c) 蒸馏水洗：5 min，2 次（置于摇床）d) 抗原修复：根

48、据待检测的抗原，选择适当的方法i. 抗原修复液（10mM pH 6.0 枸橼酸钠缓冲液）的配制储备液的配制： A 液：枸橼酸三钠 -2H2O 29.41g + 蒸馏水 1000ml B 液：枸橼酸 21g + 蒸馏水 1000ml 工作液的配制：A 液 82ml + B 液 18ml + 蒸馏水 900ml ii. 抗原修复的方法：（1） 高压锅处理技术：枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH6.0 ） ，淹没切片，高压锅内煮沸，上汽 3 min 后缓慢冷却（2） 微波处理技术：切片置于塑料切片架中，放入塑料或耐温玻璃容器内，枸橼酸钠缓冲液淹没切片，选择中高或高档，5 min ；取出并补充已预热的华

49、中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文17枸橼酸钠缓冲液；再选择中高或高档，5 mine) PBS：5 min ，2 次（置于摇床） f) 正常血清封闭：取出切片，擦净切片背面水分及组织周围的水分（保持组织呈湿润状态），滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37，15 ming) 正常血清配制 (按试剂盒规定浓度配制 )h) 滴加一抗：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加一抗，37 2 hr 或 4冰箱过夜i) PBS：5 min ，2 次（置于摇床）j) 滴加生物素化的二抗，37，40 mink) PBS：5 min ，2 次（置于摇床）l) 滴加 SAB 复合物，37，40 min m) PBS：5 min ，2 次（置于摇