1、毕赤酵母表达系统Mut+和 Muts毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶AOX1 及 AOX2，细胞中大多数的醇氧化酶是 AOX1 基因产物，甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的 30%以上。AOX1 基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长(去抑制) 时，仍不足以使 AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是 AOX1 基因可辨表达水平所必需的。AOX1 基因已被分离，含 AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目
2、的基因的表达。AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。在YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖) 培养基中，不论是 Mut+还是 Muts 其在对数期增殖一倍的时间大约为 2h。Mut+和 Muts 菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+ 在对数期增殖一倍的时间大约为 4 至 6 个小时，Muts 在对数期增殖一倍的时间大约为 18 个小时。菌株 GS115、X-33、KM71 和 SMD1168 的区别 GS115、KM71 和 SMD1168
3、 等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。GS115、KM71、SMD1168 在组氨酸脱氢酶位点(His4) 有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于 10-8。GS115表型为 Mut+，重组表达载体转化 GS115 后，长出的转化子可能是 Mut+，也可能是 Muts(载体取代 AXO1 基因)，可以在 MM 和 MD 培养基上鉴定表型。SMD1168 和 GS115 类似
4、，但 SMD1168 基因组中的 Pep4 基因发生突变，是蛋白酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用。其中 X-33 由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而 X33 与GS115 一样都是属于 MUT表现型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响，KM71 的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因(arg4)有突变，在不含精氨酸的培养基中不能生长。用野生型 ARG4 基因 (约 2kb)插入到克隆的野生型 AOX1 基因的 BamHI(AOX1 基因 15/16 密码子)及 SalI(AOX1 基因227/228 密码子)位点，取
5、代了 AOX1 基因 16-227 密码子，此结构转化至 KM71 亲本菌(arg4his4)中，分离产生KM71 MutsArg+His-菌株，Arg+转化子遗传分析显示野生型 AOX1 被 aox1:ARG4 结构所取代，所以 KM71 所有转化子都是 Muts 表型。AOX1 位点没有被完全缺失，理论上可用你的目的结构通过基因取代方法替换aox1:ARG4 结构，这样重组菌株的表型是 His+MutsArg-，这意味着重组菌株生长时需精氨酸。但仅添加精氨酸并不能完全缓和 arg4 突变的影响，arg4 菌株在含精氨酸的最小培养基中不能很好地生长。因此不推荐在 KM71中通过取代 aox1
6、:ARG4 结构来获得 His转化子。一般来说，如果是胞内表达，应尽量用 Muts 细胞，这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量相对较多，使下游纯化更易进行。而对于分泌蛋白的表达，无论是甲醇利用慢(Muts)还是甲醇利用快(Mut+)的细胞都可应用。基因重组Pichia. pastoris 酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达，包括启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等。细菌内同源重组被认为是重组质粒构建过程的难点，因为未线性化的环状质粒之间发生同源重组的几率非常低，所以重组转移载体必须用特定的限
7、制性内切酶进行线性化处理。这种处理的目的是防止随机插入重组时质粒在功能区断开，造成目的基因表达失活，让同源重组以指定的方式发生。表达载体主要分为以下几类：(1)胞内表达载体主要有 pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10，pGAPZ、pGAPZa(Invitrogen)等。该类载体可以将目的基因表达在胞内，可以避免毕赤酵母的糖基化，主要适合于那些不能被糖基化相关基因的表达；(2)分泌型表达载体主要有pPIC9、pHIL-S1、pPICZ 、 pYAM75P 等。由于毕赤酵母本身的泌内源蛋白非常少，将外源蛋白分泌到胞外，非常有利于目的蛋白质的纯化及积累。常用的分泌的信
8、号序列主要是由 89 个氨基酸组成的 交配因子(-factor)的引导；(3)多拷贝插入表达载体如 pPIC9K，pPIC3.5K 。在某些情况下，毕赤酵母中重组基因多拷贝整合可增加所需蛋白的表达量。该载体均可用于在体内(pPIC3.5K, pPIC9K)或体外(pAO815)产生并分离多拷贝插入，同时可检测增加重组基因的拷贝数是否增加蛋白表达量。体内整合可通过高遗传霉素抗性筛选可能的多拷贝插入，而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。在 GS115 中筛选 His+Mut+转化子 ：用 SalI 或 StuI 线性化质粒转化 GS115 后，大多在 His4 位点上发生重组，大多数转化子
9、是 Mut+表型；然而由于质粒含有 AOX1 基因序列，有可能在 AOX1 位点发生重组，破坏野生型 AOX1 基因，产生 His+Muts 转化子，则需要在 MD 及 MM 平板上检测可证实 His+ Mut+转化子。毕赤酵母表达常用培养基10YNB (13.4%的无氨基酸酵母氮源 )，134 g YNB 固体溶于 1L 蒸馏水，过滤灭菌，4保存。YPD 完全培养基：酵母提取物 10 g/L，蛋白胨 20 g/L，葡萄糖 20 g/L(固体培养基含 1.5%琼脂) 。转化培养基 RDB：每 100mL 加入山梨醇 18 g (186 g/L)，琼脂糖 2g (20g/L) 121灭菌 20
10、分钟，然后待温度降至60以后在超净台上加入 10YNB 10mL(13.4 g/L)，10葡萄糖 10mL(20 g/L)，500生物素 0.2mL(410-4g/L)，100AA 1mL。混匀，倒平板(灭菌时只加入 80ml 水即可)。选择培养基 MD(最小葡萄糖 )：配 100mL，向 80mL 水中加入琼脂糖 2g(20 g/L)121灭菌 20 分钟，待温度降至60以后在超净台上加入 10YNB 10mL(13.4 g/L)，10葡萄糖 10mL(20 g/L)，500生物素 0.2mL(410-4g/L)。选择培养基 MM(最小甲醇)：配 100mL，向 90mL 水中加入琼脂糖 2
11、g(20 g/L) 121灭菌 20 分钟，待温度降至60以后在超净台上加入 10YNB 10mL(13.4 g/L)，500生物素 0.2mL(410-4g/L)，0.5mL 甲醇(0.5%) 。诱导表达培养基 BMGY：配 1L，酵母提取物 10 g/L，蛋白胨 20 g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加水至890mL，121 灭菌 20 分钟，然后待温度降至 60以后在超净台上加入 10YNB 100mL(13.4 g/L)，500生物素1mL(410-4g/L)，甘油 10mL。诱导表达培养基 BMMY：酵母提取物 10g/L，蛋白胨 20 g/L，3g/L
12、 K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加水至895mL，121 灭菌 20 分钟，然后待温度降至 60以后在超净台上加入 100YNB 100mL(13.4 g/L)，500生物素 1mL(410-4g/L)，甲醇 5mL。BMGY/BMMY 含酵母浸出物及蛋白胨，可稳定分泌蛋白，阻止或减少分泌蛋白的分解。如果目的蛋白对中性PH 蛋白酶敏感的话，可在无缓冲培养基(MGY、MM)中表达。如果没有证据证明你的分泌蛋白对中性 PH 值蛋白酶敏感，建议开始表达时用 BMMY。如果表达蛋白降解了，尝试在无缓冲培养基中进行表达。如果以上条件仍不能有效防止蛋白降解，可将基因转入 SMD1168 中，该菌株表型是 his4pep4，缺失了蛋白酶，转化与表达程序与 GS115 相同，也可用于大规模发酵。线性化酶切位点 插入事件 GS115 表型 KM71 表型SalI 或 StuI 插入 his4 His+Mut+ His+MutsSacI 插入 5AOX1 His+Mut+ His+MutsBglII 取代 AOX1 His+Muts His+Muts(不推荐)用考马斯亮蓝 G-250 测蛋白含量
