1、? 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/ 楚雄师范学院学报2008年第12期 浅议植物组织培养技术在药用植物生产上的应用3张良彪 罗春梅云南省楚雄 农业学校云南楚雄675000摘 要:本文结合药用植物的生产状况概述了植物组织培养技 术在药用植物的种质资源保存、品种选育、快速繁殖与脱毒苗生产、次生代 谢 物生产等方面的应用。关键词: 植物组织培养药用植物中图分类号:Q94311 文献标识码 :A 文章编号:1671-7406200812-0056-04 中
2、国是药用植物资源最丰富的国家之一。据记载我国可供药用的植物有5000多种其中较常用的有500多种需要量大、主要依靠人工栽培的有250多种。由于长期以来盲目采挖严重破坏了生态环境人工栽培品种又面临品种退化、农药和重金属污染以及种子带病、繁殖和栽培技术落后等原因严重影响了药材品质有许多重要的药用植物的天然生产量极少故供应已十分困难如天麻、杜仲、贝母等。有100多种中药已被国家列为濒危、稀有植物如海南大枫子、药用野稻、 见血封喉等1。由于植物组织培养具有研究材料来源单一遗传背景一致经济方便、效率高条件可控误差小生长周期短、重复性强和可周年试验或生长等优点。在药用植物日渐减少的情况下人们逐渐把注意力转
3、向植物组织培养技术。我国的药用植物组织培养的研究是在20世纪70年代以后迅猛发展起来的。目前药用植物组织培养主要应用在快速繁殖、无病毒苗生产、选育新品种、种 质资源保存和次生代 谢物的生产几个领域。 1 药用植物快速繁殖在人工栽培药用植物中有不少名 贵药用植物如人参、黄连、黑节草等生产周期很长如果常规方法育种或育苗则需要花费很长时间另一些药用植物则繁殖系数小耗种量大严重影响了发展速度并增加了生产成本如贝母、番红花等还有一些药用植物如地黄、太子参等由于病毒为害而退化严重影响了产量和品质一些进口南药因种苗奇缺而影响扩大生产如乳香等。而药用植物生产需求大量规格统一、性状优良的苗木这一目标可以通过组织
4、培养手段实现。利用组织培养法每年可繁殖出几万至数百万倍的小幼苗如苦丁茶每株试管苗每次继代培养繁殖5倍按平均每40天切割继代一次计算每年可继代9次每株苗理论上可繁殖出将近200万株苗。因此组织培养对于因病毒病害严重影响产量和质量的药用植物、靠有性繁殖提供种子而种子发育不完善或种子成本高的药用植物、靠无性繁殖提供“ 种子”而无性繁殖系数低且种子需求量大的药用植物、濒危或濒危药用植物的引种驯化以保护植物资源等具有重要的科研和生产意义。目前通过组织培养成功的药用植物至少有200种。培养的药用植物从常见的到珍稀濒危植物、民族植物如云南黑节草、延龄草、高山 红景天藏药川西獐芽菜、莪术、水母雪 莲、星花乡线
5、菊、溪黄草、玉叶金花、辽东葱木等。从生产常用药的植物到具有抗癌、抗病毒等有效成分的植物如红豆杉、艾黄杨、狼毒、大戟属、长春花、米仔兰、狗牙花和香榧等。培养用的材料也有提高。开始以草本、木本或藤本植物的根、茎、叶、花、胚、果实、种子、髓、花药等组织或器官进行培养发展到从器官诱导到愈伤组织、细胞培养再发展为用冠瘿组织、毛状根进行培养2。植物组织培养技术不断提高从固体、液体静态、 悬浮培养到深层大罐发酵、液体 连续培养和细胞固定化培养等。最近人们对植物组织培养电刺激效应进行了探讨应用诱导剂、稀土和体外胁迫等对植物组织培养产生药物成份进行了研究。在组织培养过程中也建立了一些相应的技术如放射免疫测定法、
6、复制平板技术、微滴试验、 荧光显微镜术和高效液相?65?第二十三卷第十二期 楚 雄 师 范 学 院 学 报 Vol123 No112 2008年12月 JOURNALOFCHUXIONGNORMALUNIVERSITY Dec12008 3收稿日期:2008-10-14 作者简介 :张良彪1971男云南牟定人讲师主要从事药用植物的教学与研究。? 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/ 楚雄师范学院学 报2008年第12期 色谱法对筛选和获得高产细胞株非常重
7、要。目前药用植物种苗的快速繁殖途径主要有以下两种:111 无性植株的再生无性植株的再生是植物通过组织培养和遗传工程进行品种改良的一个先决条件也是实现获得大量人工种苗的重要途径。目前我国药用植物用组织培养技术繁殖的无性系可概括为以下几个方面:1 带节茎段扦插快繁即由带节茎段在无菌条件下扦插可以进行快速无性繁殖如黄芩、罗布麻、款冬等2器官发生细胞或愈伤组织培养通过不定芽形成植株如枸杞、雪莲花、西洋参、延胡索、毛地黄、丹参、黄连、川白芷、栝楼、中麻黄、西红花、枳壳、长 春花等已通过这种方式建立了无性繁殖系得到了人工种苗3类胚体途径细胞或愈伤组织通过胚状体途径即经过球形胚期、心形胚期、鱼雷胚期、子叶胚
8、期 经成熟胚的类 胚体上还能继续不断地形成新的胚状体如西洋参、人参、甘草、三七、黄连、刺五加等4原球茎细胞或组织培养经过原球茎途径分化形成植株如铁皮石斛、百合等3。 112 胚的离体培养获得人工种苗胚培养可以克服有性杂交中的胚乳败育、早期胚败育和珠心胚干扰等获得杂种苗此项技术已进入实用阶段西洋参、红花、枳壳、长春花、鼓槌石斛、银杏等植物的胚培养已获成功。王丽4等对香雪兰离体胚培养研究表明离体胚培养不仅可打破种子的休眠而且可以解决远缘杂种不能正常发育的难题。李志良5对中国红豆杉和短叶红豆杉的离体胚培养特性进行了研究发现适宜的条件下两种胚萌发率与成苗情况没有明显的差异离体胚培养是实现大规模种植的一
9、条快捷途径。 2 药用植物无病毒苗的生产1952年Morel 和Martin首次证实通过茎尖分生组织的离体培养可以获得无病毒的大丽菊植株证实了组织培养技术对于植物脱病毒的优异作用。采用茎尖培养脱毒的原理是:在感染病毒植物体内病毒分布并不均等。在生 长点病毒含量最低侵染的病毒使寄主代谢异常因此造成植物生长的抑制或形成畸变产生皱缩、花叶、杂斑等到许多症状导致产量大幅度下降以及花变小色泽暗淡产量少等品种退化的现象。如唐菖蒲、百合、地黄、太子参等都存在这样的问题。采用茎尖培养去病毒后植株生长势强抗逆能力提高品质和产量均明显增强。例如唐菖蒲侵染了黄瓜花叶病毒CMV后植物叶面形成斑纹而黄色花叶病毒BYMV
10、则使侵染后的植物花 带斑点并扭曲畸变。王慧芳61991报道将带有CMV和BYMV病毒的唐菖蒲球茎切取茎尖015mm经愈伤组织的培养脱分化分化出根、芽后获得完整植株经鉴定成株不带CMV和BYMV病毒。据研究资料表明去病毒苗的比例高低取决于病毒种类、植物种类及操作技术。例如百合经处理后去病毒的百合比例为1625唐菖蒲花瓣组织培养去烟草花叶病毒的比例为30507。 3 药用植物新品种的培育植物 组织培养技术已成为培育新种质的新手段之一。在药用植物上研究和应用的方向主要有三个方面。311 单倍体和多倍体培养单倍体经染色体加倍后成为纯系使突变性状易于表现出来。而且基因重新组合对于药用植物而言可以通过酶的
11、作用影响到一系列蛋白质合成及其各种性状通常具有较高含量的药用成分同时增强了植株的生态适应性及对逆境的抗耐性。因此单倍体和多倍体培养技术对于品种选育、改良及遗传分析有重要意义。攀映汉8对宁夏枸杞含单核晚期花粉的花药培养得到来自花粉的单倍体植株。曹有龙31等用枸杞花粉愈伤组织悬浮培养产生胚状体也获得了单倍体植株。而以宁夏枸杞未授粉的子房为材料可获得四倍体和非整倍体植株其中诱导出的同源四倍体枸杞表现出花和果实大、种子少的特点充分显示出其潜在价值。高山林9等研究多倍体性状与药材质量发现不同类型丹参多倍体根中丹参酮的含量不同丛根类型的丹参多倍体品系不仅产量增加而且丹参酮含量平均比对照增加79这样使多倍体
12、巨大性和药用成分含量两个方面得以较理想的组合和统一。目前利用单倍体和多倍体培养技术培育得到新品种的药用植物有党参、黄芪、丹参、枸杞、薄荷等10其中部分品种已产生了可观的经济效益。312 原生质体培养与融合原生质体培养和植株再生技 术是药用植物生物工程的基础通过原生质体培养筛选高产细胞系、细胞杂交、以原生质体作为受体系统的基因转化技术都依赖于植物原生质体的培养、融合和植株再生技术。自从植物原生质体培养技术产生以来许多经济植物特别是重要农作物如水稻、小麦、玉米、甘蔗、大豆等的原生质体培养工作已广泛开展并取得了相当大的进展11但原生质体培养在药用植物上的应用相对滞后。从目前的研究进展来看枸杞、峨参、
13、决明、防风、人参、龙胆、绞股蓝、川芎、前胡等已实现了以原生质体培养获得愈伤组织或再生植株。刘宝 12等用黄花烟草叶片愈伤组织和宁夏枸杞下胚轴愈伤组织培养分离获得原生质体并进行融合实现了远缘遗传物质交流获得杂种小苗。这为探索通过原生质体融合技术将枸杞中决定药用成分的基因转移到重要经济作物烟草中奠定了基础。?75?张良彪 罗春梅:浅议植物组织培养技术在药用植物生产上的 应用? 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/ 楚雄师范学院学报2008年第12期 313
14、基因工程中转化体系的建立基因工程是利用重组DNA技术在体外通过人工剪切和拼接等方法对生物基因进行改造和重新组合导入受体细胞进行无性繁殖使重组基因在受体细胞中表达生产所需要的基因产物。植物转基因的方法主要有农杆菌介导转移法、基因枪法、花粉管通道法等前两种方法需要通过组织培养再生植株我国学者多采用农杆菌介导基因转移法。据报道迄今所获得的200种转基因植株中80以上是利用根癌农杆菌转化系统产生的13。在组织培养和转化体系建立的基础上通过转基因技术引入控制某种性状的基因对药用植物进行有效的遗传转化从而达到提高有效成分含量、增强植株抗性和品质、抗除草剂等目的。邱璐等14对灯盏花遗传转化中的组织培养受体系
15、统进行试验研究发现使用75g/ml的chl氯霉素作为土壤 农杆菌转化培养的选择压力使用50g/ml的Gent庆大霉素作为转基因植株的选择压力使用300g/ml的cef头孢 霉素作为土壤农杆菌转基因的抑菌抗生素对灯盏花遗传转化效果最佳。在转化体系建立的 辖岷贤寥琅司 榈嫉幕 蜃 品型 竦米 虻普祷趸壑械?5 已成功地将外源卡那霉素抗性基因通过根癌农杆菌介导的基因转移技术导入了宁夏枸杞的幼茎外植体所获得的再生植株经胭脂碱检测、NPT-II活性测定及Southem分子 杂交证明外源基因NPT-II及胭脂碱合成酶基因已整合到枸杞细胞的核基因组上并能在植株水平上表达出相应的性状。目前我国已在甘草、丹参、
16、黄芪、表蒿、红豆杉等多种植物药材中建立了农杆菌介导的遗传转化一些相关的关键基因已克隆通过基因工程操作可使这些基因过度表达就有望增加有效成分的含量16。 4 药用植物的离体种质保存植物种质资源是物种进化、遗传研究及植物育种的物质基础也是人类生存与持续发展的基本条件。目前全世界面临着环境污染和热带森林资源的破坏平均每天有2种植物从地球上消失这是全人类物种财富的损失17。而在生物科学迅速发展的今天拥有种质资源的多少以及对其研究的深度和广度对于未来生物科学的研究和生产起着极其重要的作用。因此许多国家目前都有专门搜集保存资源的种子库但保存种质资源占地多维持费十分高昂。现在可借助试管来保存它们。 试管保存
17、就是在人为控制条件下利用组织培养技术保存种质资源。与传统的保存植物种质资源的方法种子库相比采用植物细胞、组织或器官能最大限度地抑制生理代谢强度降低劣变发生频率达到长期保存种质的目的。实验证明植物组织甚至细胞可以在4 低温或在液氮的低温中贮存几个月或几年不丧失其活力这为保持植物资源和对植物材料运输提供了方便18越来越多的种质资源和生物制品可在离体条件下运输由于没有昆虫、细菌和真菌感染因而在许多口岸获得免检19。史永忠20等研究铁皮石斛种质资源的低温保存时发现其试管苗能在4黑暗条件下连续 保存12个月并能正常生长。 陈品良21等用杜仲的花粉在液氮-196 中保存实现 了花粉粒的萌发。李明军 22等
18、用怀山药的无菌苗进行离体诱导形成微型块茎发现微型块茎是怀山药离体繁殖和种质保存的又一途径这将有助于种质资源的保存和交流。目前离体种质保存虽已进入了较长时间的研究但因其本身的局限性或技术上的不成熟而在实际应用中受到极大限制。相对而言超低温保存却显示了其广阔前景但长期使用冻存材料可使其再生能力衰退、组织培养后代遗传稳定性等仍未解决的问题还有待于进一步研究。 5 药用植物次生代谢物的生产在植物组织培养研究中发现培养细胞中含有各种特殊的代谢产物、药用成分和各种香精等。其中有些是微生物有些是人工所不能合成的物质有些是整体植物中含量甚微或整株植物十分缺乏而培养细胞中的含量却很高如人参皂苷在组织培养中含量占
19、干重的27全株中只有415紫草素在细胞培养物中占有2而全株只有115。因此以培养细胞生产这些有用成分已受到生物学、医学及商业界人士的极大关注。通过愈伤组织或悬浮细胞的大量培养从细胞或培养基直接提取药物或通过生物转化、酶促反应生产药物。据不完全统计目前通过各种培养物中产生的药用成分已有600多种其中40多种化合物在数量上超过或等于原植物中的含量23。从细胞培养物中分离得到的有用物质有:酶类淀粉酶、淀粉酶、蛋白水解 酶、过氧化氢酶、酸性磷酸化脂、糖苷酶、IAA氧化酶、细胞色素氧化 酶等甾体地奥甙元、育努皂甙元等萜类角鲨烯、羊毛甾醇、环阿屯醇、人参三醇、人参二醇、油烷酸、人参甙等生物碱麻黄碱、利血平
20、、吲哚生物碱、麦角碱等苷类人参皂苷、三七皂苷、甘草甜苷、薯蓣皂苷等、色素大黄素、紫苏宁、 红花素、蒽 醌、紫草素等等2425。1964年罗士韦首先成功地进行了人参的组织培养随后我国和其他国家的一些学者将人参的组织培养过渡到工业化生产。目前我国学者已建立了三七、三分三、人参、西洋参、紫草、长春花、丹参、 红豆杉等十几种药用植物的液体培养系统经过对培养基和培养条件的操作已使有用成分达到或超过原植株。并实现了人参10L体积的大规模培养对其培养细胞?85?楚雄师范学院学报 2008年第12期? 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing
21、 House. All rights reserved. http:/ 楚雄师范学院学报2008年第12期 进行化学成分和药理活性比较分析表明与种植人参无明显差异并已作为美容保健品投放市场这是我国药用植物生物技术产品商品化的第一个范例26。参考文献:1 许继宏马玉芳陈锐平等1药用植物组织培养技术M1北京:中国农业科学技术出版社200412:1312薛淮等1中国药用植物组织培养研究进展J1植物杂志12002113梁文裕曹雯王俊等 1生物技术在我国药用植物研究中的应用J1宁夏农学院学报2003244:929514范玉清任国华1国内外植物组织培养进展概况J1普东南师范专科学校学报 200241915
22、李志良1中国红豆杉和短叶红豆杉的胚胎培养J1植物资源与环境学报2001101:626316王慧芳1唐菖蒲脱毒技术研究初报J1西北园艺19911:101117高尚士1花卉病毒病的检疫及其消除方法J1植物检疫19946:34018樊映汉臧淑英赵敬等1两种枸杞植物花药培养单倍体的诱导A1白寿宁1宁夏枸杞研究C1银川:宁夏人民出版社1998616219曹有龙贾勇炯陈放等1枸杞花药愈伤组织悬浮培养条件下胚状体发生与植株再生J1云南植物研究1999213:346350110高山林朱丹妮蔡朝辉等1丹参多倍体性状和 药材质量的关系J1植物资源与环境199652:14111彭卫欣谢晓亮1药用植物多倍体育种研究
23、进展J1 河北农业科学2002964750112夏镇澳1植物原生质体培养研究进展J1植物生理学通讯19892:16113刘宝陶文静张忠恒等1黄花烟草和枸杞属 间原生质体融合再生杂种小苗J1实验生物学报1995283:31932214邱璐瞿礼嘉罗春梅等1灯盏花遗传转化中组织培养受体系统的研究J1楚雄师范学院学报2004193:9195115王慧中黄发灿李安生等1枸杞转基因植株的再生J1生物工程学报199173:230223116赵广荣向志军元英进等1中药现代化研究的生物技术J1中草药2001533:481484117郭绍霞1观赏植物试管快繁的现状和展望J1莱阳农学院学报2001183:18118
24、6118刘克抑1植物细胞、组织和器官培养冷冻贮藏技术的发展J1农业科技情 报19914:9 12119蔡新声1台湾植物组织培养研究现状J1植物生理学通讯1994306:473476120史永忠潘瑞炽王小青等1铁皮石斛种质资源的低温保存J1应用与环境学 报200064:326 330121陈品良贺善安金炜1杜仲、秤锤树花粉的超低温贮藏研究J1植物学报1990324:188 191122李明军刘萍张嘉宝1怀山药微型块茎的离体诱导J1植物生理学通讯2000361:41 42123刘蜀宝王建设1生物技术促进中药现代化J1怀 化医专学报200431:99 101124王纪华赵冬梅1药用植物组织培养和细胞
25、培养生产药物及色素研究进展J1特产研究119911:2829125李冬杰魏景芳刘淑清等1药用植物 细胞悬浮培养研究进展J1 河北林业科技200384:2223126胡之璧刘涤1生物技术在中 药现代化中的地位和作用J1世界科学技术1中药现代化199811:231责任编辑 徐成东ApplicationofPlantTissueCultureTechniquesonMedicinalPantsProductionZHANGLiang-biaoLUOChun-meiChuxiongAgriculturalSchoolofYunnanProvinceChuxiong675000ChinaAbstract
26、:Accordingtothesituationonmedicinalplantproductiontheapplicationofgermplasmconservationbreedingrapidpropagationandvirus-freeseedlingproductionandsecondarymetab2oliteproductionofplanttissueculturetechniqueonmedicinalplantproductionweresummarized.Keywords:planttissueculturemedicinalplant?95?张良彪 罗春梅:浅 议植物组织培养技术在药 用植物生产上的应用
