1、植 保 研 究 技 术,主讲教师:吴 彩 兰,一、植保研究技术教学内容,第一部分 植病研究前的准备 第二部分 真菌病害研究技术 第三部分 细菌病害研究技术 第四部分 病毒病害研究技术 第五部分 线虫病害研究技术 第六部分 资料的收集和数据的处理 课程总学时24，其中理论授课10学时，实验14学时,病害调查方法 标本采集、制作方法 培养基制作、灭菌方法、 （徒手、石蜡）玻片制作和显微镜检测、 病原菌分离培养方法 真菌、细菌孢子记数法、测量法 病原物接种方法、柯赫氏证病法血清学技术 文献检索 数据统计分析法、图表制作法、论文写作技巧等。,实验内容包括：,二、教学目的,植病研究法是一门着重说明原理，
2、然后介绍一些具体方法的课程，也可以说是一本植病研究者完全的“工作手册”。通过该课程的学习，掌握植物病害研究过程中的一些基本方法和技巧，其以培养学生的实践能力为本位，与理论教学相互配合，使所学的专业知识进一步系统化，融会贯通。学会如何解决农业生产中遇到的实际问题。,三、 教学要求:,1熟悉植物病害的基本调查方法。 2了解植物病害标本制作及保存的基本技术。 3掌握植物病原物（真菌、细菌、线虫等）分离、培养的基本原理及技术。 4掌握资料的收集和数据处理的方法,四、考试内容:,选题范围：（可灵活掌握） 假如你在田间发现了一种危害严重的细菌性病害，为详细搞清引起该病害的病原种群，请你写出一份研究该病的具
3、体实施方案。 请你叙述真菌病害、细菌病害和病毒病害三者在研究过程的中的相似和不同处。至少通过列举3例加以详细说明。 如何准确诊断一种植物病害，你能设计出几种好办法，请详细列举。 假如你在田间发现了一种危害严重的真菌性病害，为了能准确诊断该病，请你写出一份研究该病的详细实施方案。 请写一份对某种病毒病的研究具体方案。,五、考试方式：,考试成绩由论文成绩和实验、平时成绩构成。其中论文成绩占40%，实验、平时成绩60%。要求论文页面整齐、字迹清晰；字数不得少于3000字。论文条理清楚，方法得当，要有较强的逻辑性，同时应理论结合实例答题，忌废话连篇；涉及文献应注释。数据准确，分析合理。,完成教学的保证
4、（师生的合作与努力）,注意课堂纪律和实验室纪律 认真听讲，做好笔记 随时提问，以求随学随吸收、消化 认真实验，注意实践教学 主动涉猎相关文献。,如何学好这门课：,建立兴趣、自信、勤奋、健康 学好其他相关课程：普病,第一章 植物病理学研究的计划,植物病理学的主要内容有症状学，病因学，诊断学，病原物的致病性和致病力的分化，寄主植物抗病性，植物群体发病的流行学分析，植物个体发病分析的植物病理生理学，植物病害的控制以及较近发展的分了植物病期学等方而。症状学主要是描述植物病害的外部症状，典型的和非典型症状，有些病害还有内部症状如有些植物病毒病的内部症状、症状对于病害的识别和初步诊断是很有意义的。,病因学
5、主要是研究病害发生的原因。植物侵染性病害发生的原因是由病原物，寄主植物和环境条件三方面因素决定的，即所谓病害三角。病害是否发生和发生的轻重，决定于上述三方面的因素，因此一种病害要从这三方面的因素的分析作出诊断。至于病原物的鉴定只是诊断的一个方面，即所谓“狭意的诊断”。,根据以上对植物病理学研究各方面的简短介绍。可以进一步探讨。研究计划，也就是研究什么，如何研究和何时结束。有人用“W”起头的三句话来表示。即：What to do ? Which way to go? When to stop? 也是同样的意思。研究什么是最重要的问题，应该慎重考虑确定。 当前和当地的生产上的重要问题，应该是研究的
6、主要对象。当前的病害应该是包括当地已经大量发生的和当前只是少量发生的而可能继续扩大的危险性病害。当地的范围可大可小。地区、省、大区到全国，都可属于当地的范围。植物病理学本身是基础学科，但它研究中得到的成果，主要是为病害的控制提供信息。因此，解决与生产中有关的问题将是植物病理学研究的主要内容。,研究途径是指如何进行研究，则不外乎到生产第一线的调查研究和室内研究，两者相辅相成。生产第一线的试验和调查研究，为室内研究提供课题和材料室内研究的结果也得到生产第一线验证。很难设想没有生产第一线提供的材料，可以在室内进行有价值的工作。设备和经费也是要考虑的问题。,研究进展到一定的程度，基本达到预期目的，可及
7、时整理和总结。对事物的认识由浅入深，由表及里的过程，不可能一次完成，从阶段性总结就可以分析哪些问题已经解决，哪些还有不妥之处，哪些还需要改进和进一步研究。总结中发现已经完成的部分，应及时报道和发表。同时将原始的试验记录、调查材料、图片等材料整理成册，作为技术档案保存，便于本人和后人查阅。,第二章 植物病害文献,研究一种病害或者其中某一方面的问题，收集国内外有关文献和资料，了解这方面工作的基础和进展，可以作为今后工作的参考和避免不必要的重复。文献是以往工作的总结，对于我们来说是间接知识。但是一切工作都要自己做过是不可能的，除去强调亲自实践的重要性外，也要善于吸取前人和别人的实践经验。当然，文献仅
8、供“参考”，实际问题的解决，还要结合具体情况。第一节 文献收集提纲系统地收集文献，可以节省时间，又不至于遗漏重要的著作。事前可以先订一个收集提纲，如：病名、寄主、历史、分布、经济上的重要性、症状、病原物、侵染过程、病害循环、生态关系、寄主的抗病性、病害的控制。,第二节 文献的来源 文献的收集，一般是以查阅“文献摘要”着手。第三节 文献的记载,第三章 植物病害的调查,植物病害的分布和为害、发生时期和症状的变化，以及栽培和环境条件对植物病害发生的影响，品种在生产中的表现，防治效果等，都要通过调查才能掌握。 无论是哪一种调查，目的确定后，所用的方式和方法要符合调查的要求。因此调查前要作充分的准备，调
9、查后对掌握的材料要分析研究。许多问题不是通过一次调查就能作出结论的。调查工作经常会发生以下这些情况：没有代表性，有些调查工作是地点没有选好，调查结果不能反映当地的真实情况；资料不完全，事前没有具体规定所要收集的资料，事后发现已经太迟；发病程度记载不一致，是最常发生的问题，以致各方面的资料不能分析和比较；损失估计错误，这方面可发生的偏差更大，有的是由于估计没有根据，有的是由于主观片面将损失估计过高。,第一节 调查的类别,病害调查有一般调查、重点调查和调查研究，它们之间的界限不是绝对的，区分的意义在于明确调查目的和采取的方法。1.一般调查当一个地区有关病害发生情况的资料很少，可先进行一般调查。一般
10、调查的面要广，并且要有代表性。调查的病害种类很多，对发病率的计算并不要求十分精确。植物检疫性病害调查的性质与其相似，但目标更加明确，任务是了解这些病害是否发生和发生的地区。对一般发病情况的调查，为了节约人力和物力，调查次数可以少一些。如小麦病害调查的适当时期，叶枯病是在抽穗前，条锈病是在抽穗期，叶锈病可以迟一些，秆锈病、赤霉病、腥黑穗病和线虫病等可以迟到完熟期。如果一次要调查几种作物或几种病害的发生情况，可以选一个比较适中的时期。一般性病害调查，主要是了解病害的分布和发病程度。,大麦病害调查记载 调查地点调查日期 调查人,2.重点调查,经过一般调查发现的重要病害，可作为重点调查的对象，深入了解
11、它的分布、发病率、损失、环境影响和防治效果等。重点调查的次数要多一些，发病率的计算也要求比较准确。比较深入的重点调查，可以参考“作物病害调查记载”方式。,第二节 发病程度,发病程度包括发病率和严重度，发病率一般是指发病田块、植株或器官等发病的百分率，而严重度是指田块植株或器官等的受害程度。1记载方法病害的种类很多，为害的情况不一，发病程度的记载方法比较复杂。以下几点可供选择和设计时参考：要简单明了而相当准确，只求精确而过于复杂是不适用的，并且有时是不必要的；要客观和具体，使各人在不同的地点和时期，用该方法记载得到的结果，可以相互比较；一种病害为害的方式可以是多方面的，要兼顾到各种为害方式；发病
12、率固然不能表示损失的大小，但是能指出其间一定的关系最好。,（1）直接计数法这是比较简单的方法，就是计算发病田块、植株或器官的数目，从调查的总数，求得发病的百分率。直接计数法的优点是根据发病或不发病计数，有明确的标准，记载比较一致；缺点是不能反映受害的严重度，因此只适用于植株或器官受害程度大致相仿的病害例如，棉花枯萎病的记载，可以数田间的发病株数，求得发病的百分率，由于病株发病轻重的程度不同，比较精确的调查一般还是采取分级计数的方法,（2）分级计数法病害发生的轻重，对植物的影响不同。直接计数就不能反映发病程度的差异，要用分级以后再计数的方法。分级的标准要明确和具体，要大家都能了解。有些分级法，如
13、分为“轻”、“重”、“很重”，或者用“+”、“+”、“+”、“+-+”等符号表示轻重，而不加以说明是没有意义的。分级标准可用文字、绘图或照相等方法表明。根据病害的性质，可以按叶片、果实、植株或田块分级。以下列举几个典型，说明分级标准的用法。,1 分级用文字叙述乌铃薯晚疫病发病率的一种记载标准，是按田块的发病率分为9级。发病率是指叶片绿色部分面积减少（破坏）的百分率（表3-1）。 调查时，记载每级的发病田块数，计算田块的平均发病率。文字叙述的标准，如能配合有照相或绘图，则更加清楚。,2 分级用图或照相表示,这标准用于麦类秆锈病的记载，比较简单而明确，所以被广泛采用。调查时，在田间随机采集一定数目
14、的麦叶，分别和标准对比，决定各个叶片的发病率，然后再求得平均数。,分级计数记载，如每一级都是用百分率表示的，很容易计算它的平均白分率。例如麦感染锈病后，五张叶片的发病率，按照标准记载是100%，55%，65%，40%和25%，均发病率就是（100+65+65+40+25）%559。分级计数法的级别，有的不是根据百分率分级的，得到的结果是每一级中有多少个体。针对这种情况，往往是计算感染指数来表示发病程度，即每一级用一代表数值，然后按以下公式计算：,其值在0100之间,（3）感染指数,例如，番茄早疫病(Alternaria solani)的病株，可根据发病程度分为五级，每一级用数值代表(表3-2)
15、。发病最重的感染指数是100，完全无病是0，所以这数值就能表示发病的轻重。,感染指数是将发病率和严重度两者合在一起，用一个数值来代表发病程度，对调查和实验结果的分析是有利的。在比较防治效果和研究环境条件对病害的影响等方面，常常采用这一计算方法。此外，感染指数含有发生量和严重度两方面的因素，有时看不出是发生量不同，还是严重度不同。例如，可以有两种不同的情况，一种情况是发病个体虽少，但是发病很重；另一种情况是发病个体很多，但是发病很轻。它们的感染指数可以相同，但是病害发生的情况显然不同。总之，感染指数是表示发病程度的一种方式。,2.取样方法,病害调查的取样方法，影响着结果的准确性。各种病害的取样方
16、法不同，同时还要看调查的性质和要求准确的程度，原则是可靠而又可行。（1）样本数目样本的数目要看病害的性质和环境条件。空气传播而分布均匀的病害如麦类锈病等，样本数目可以少一些。土壤传染的病害样本要多，如地形、土壤和耕作条件的差别较大，取样更要多一些。一般的方法是一块田随机调查四五个点，在一个地区调查十块田。取样不一定要太多，重要的是有代表性。,（2）取样地点避免在田边取样，田边植株往往不能代表一般发病情况，应离开田边五步到十步（田小的可以近些），在四五处随机取样，或者从田块四角两根交叉线的交叉点和交叉点至每一角的中间四个点，共五个点取样。植株较大的条播作物如棉花等，可以在田间随机选若干行进行调查
17、。在一个区内调查，要随机选田，避免专门选择重病田，可规定每隔一定距离调查一次。,（3）样本类别样本可以整株作为计算单位。枝干病害要看发病情况，主干发病而影响全株生机的，应以植株计算；发病而不影响全株生机的，可以计算有多少枝干发病，或者以整株作单位，但分级后计数。叶片病害的取样比较复杂，大致有以下三种方法：田里随机采取叶片若干，分别记载，求得平均发病率；从植株的一定部位采取叶片，以此叶片代表植株的平均发病率；记载植株上每张叶片（必要时也可采下）的发病率，求得平均数。第一种方法比较省时省事，用得最多；第二、三两种方法只适合于植株叶片较少的作物。,（4）样本要小而可靠麦类黑粉病的调查，可以在田间每一
18、点观察二三百穗或秆，或者观察一定的面积(0.45M2）或行长（(1.67m左右），求得发病率。植株较大的作物，行长和面积要大一些。果实病害要观察一二百个，全株性病害观察一二百株，叶片病害则由分布情形决定，分布很不均匀的病害，每一样本要有20张叶片左右。（5）取样时间调查取样的适当时期，一般是在田间发病最盛期。谷粒病害和果实腐烂病等，可在收获后取样。,第四章 植物病害和菌类标本的采集和制作,第一节 标本的采集病害标本采集的用具有标本夹、标本箱、刀、剪、锄、锯、小玻瓶、标本纸、纸袋、标签和记录本等。病害标本主要是有病的根、茎、叶和果实等，好的标本要有各受害部位在不同时期的典型症状，真菌病害则上面有
19、子实体更好。寄主的鉴定很重要，许多病害标本，尤其是锈菌和黑粉菌，不知道寄主是很难鉴定的。对于不熟悉的寄主，最好能采得花、芽和果实等，有助于鉴定。每种标本采集的件数不能太少，在制作和鉴定过程中常有损坏，多余的标本还可以交流。一般口十斑病标本，最少采十几张叶片。,采到的标本，如果干燥后容易卷缩的（如稻叶），最好是随采随压。其他不致损坏的标本，可以暂时放在标本箱中，带回压制和整理。败坏的果实，先用纸分别包裹，然后放在标本箱中，以免损坏及沾污。黑粉病标本，要放在纸袋中或用纸包好，避免饱子混杂而影响鉴定。柔软肉质菌类的采集，用篮或筐，并分别用纸包裹，以免损坏和沾污。标本务求完整，有些覃类的基部结构，对鉴
20、定是很重要的，采集时应特别注意。肉质覃类不容易保存，采到后要当天观察，及时绘成彩色图，彩色照相更好。,采集要有记载，主要内容是寄主名称、采集日期和地点、采集人姓名、主要发生情况和必要的生态因子。覃类多生在林间土面，要记下土壤性质和林木种类。菌类标本采集记录的一种形式如下：菌类采集记录地点：日期： 年月 日 产地和环境 海拔 寄主:通称学名 受害部位（根、茎、叶、花等）标本性质 （寄生或腐生）普遍性采集人 采集号数 定名人标本号数附注： ,第二节 标本的制作,一般都用干燥法或浸渍法保存，要求是能尽量保持原来的性状。1.标本干燥制作法干燥法比较简单而经济，标本可以长期保存，所以应用广泛。茎和叶可压
21、在吸水的标本纸中，用标本夹夹紧，日晒任其干燥。可在50的烘箱中放二三天，使它很快干燥。标本干燥愈快，愈能保持原有的色泽。夏季的温度和湿度高，标本容易发霉变色，标本纸的更换要勤。通常前三四天每天换纸一二次，以后每二三天换一次，至完全干燥为止。为了加快干燥，有些标本可以夹在吸水纸中用熨斗烫，使它快速干燥而保持原来的色泽。幼嫩多汁的标本如花和小苗等，可夹在两层脱脂棉中压制，水分过高的可在30-45之间加温烘干。,2.浸渍标本制作,浸渍法多半用于教学和示范用。腐烂的水果、肉质子囊菌和担子菌的子实体等浸渍液种类很多有纯防腐的，也有专为保持标本原来色泽的。标本浸渍保存，占的面积大，保存时间又有限，所以很少
22、用于保存大量的标本。浸渍法多半用于保存教学和示范用的标本。,第五章 培养基的制作,第一节 微生物的营养,根据获得碳源的方式，微生物可以分为：,自养营养 (autotropic)：能利用二氧化碳，不需要有机物质作为来源, 微生物具有特殊的色素，能够进行光合作用，可以利用光能 将二氧化碳合成含碳素的有机化合物； 微生物没有能营光合作用的特殊色素，不能进行光合作用，是利用其他无机化合物氧化时所产生的能量来合成有机碳素化合物，如硫细菌、铁细菌和土壤中的硝化细菌。,寄生微生物：能够从活的植物组织上获得养分(biotrophic)， 腐生微生物：只能利用死的有机质(necrotrophic),异养营养 (
23、heterotrophic)：植物病原微生物都是异养营养微生物，异养微生物,寄生和腐生之间没有绝对的界限，寄生性的微生物也有一定的腐生能力，如在植物上寄生的病原菌，大都可以在人工培养基上培养。,（1)碳素来源：异养微生物可以利用的有机碳素化合物很多，以碳水化合物最好，氨基酸和蛋白质次之，油脂类较差；碳水化合物中，单糖比多糖好，己糖比戊糖好。培养微生物一般都是首先试用葡萄糖作为碳源。葡萄糖虽然不一定是最适当的碳源，但几乎所有的微生物都利用葡萄糖。蔗糖也是常用的碳源，效果有时还超过葡萄糖。麦芽糖、甘露糖等则较差,(2)氮素来源：异养微生物对氮素的要求是多样的。大部分微生物都能利用无机和有机的氮。根
24、据对不同氮源利用的能力，真菌（细菌）大致可以分为气态氮固定类、硝态氮类、铵态氮类和有机氮类。,真菌对各种氮源的利用,(3)矿物质营养：除去碳源和氮源外，微生物还需要K、P、S、Mg等矿物质和许多微量元素。微生物需要的矿物质常用硫酸镁（供给Mg及S）磷酸钾（供给K及P），因此这两种盐常用于配制组合培养基。,生长物质与一般营养物质和微量元素的性质不同，主要区别如下 生长物质是有机物质；微生物需要生长物质是由于它丧失了合成这种生长物质的能力生长物质的用量是很少的，主要起着催化作用； 生长物质的作用是专化的。微生物需要的生长物质有维生素B1、B2、生物素、烟酸、泛酸吡咯醇、对氨基苯甲酸等，大半都属于维
25、生素B型复体。,(4)生长物质：有些微生物即使供给了适当的碳源、氮源和矿物质养料,其他条件也都适宜，有时仍不能生长或不能正常地生长和发育，就要供给适当的生长物质或维生素。这种现象最早在酵母菌上发现,以后其他微生物也发现类似的情况。,第二节 培养基的成分和种类,根据配制材料和成分，培养基可以分为三类：,天然培养基：动植物的组织、厩肥、土壤和土壤浸出液等配制成的培养基。其成分复杂，几乎无法完全了解，但是一般微生物在这种培养基上的生长和发育都很好。其配制也比较方便, 所以使用很广。半组合培养基：是由成分未知的天然物质和成分已知的物质配成, 如马铃薯蔗糖培养液中的蔗糖是已知的成分，马铃薯则是成分未知的
26、天然物质。马铃薯的成分因品种、成熟程度和栽培条件而不同，所以每次配成的培养液成分不可能是相同的。组合培养基：是成分和浓度完全已知的培养基，是由成分已知的化学药品配成。如 Richard溶液。琼胶是成分不固定的天然物质，组合培养液中加入了琼胶就只能作为半组合培养基。,第三节 培养基的理化性状,1 固体和液体培养基培养液中加适当的凝固剂，就成为固体培养基。凝固剂有琼胶、明胶和硅胶，常用的是琼胶。琼胶：凝固点较高，含氮量低，凝固后可以再熔化，使用比较方便。琼胶含氮量低，只有极个别的微生物能分解。 明胶：熔点很低，温度稍高即熔化，不适于较高温度下培养的微生物。 明胶含氮量很高，超过琼胶几十倍，许多微生
27、物都能利用和分解一般只用于配制鉴别性培养基，测定一种植物病原细菌液化明胶的能力。 硅胶：它是无机化合物，不含微生物可利用的物质，所以硅胶培养基用于特殊营养生理的研究，主要用于分离和培养对有机物质敏感的自养性细菌如硝化细菌等。,第四节 常用培养基的配制,1马铃薯葡萄糖琼胶培养基(简称PDA)这是使用最多的培养基，主要用于真菌的分离和培养,马铃薯 200g 葡萄糖(或蔗糖) 1020g 琼胶 17-20g 水 1000ml,将洗净后去皮的马铃薯切碎，加水1000ml煮沸半小时，用纱布滤去马铃薯，加水补足1000ml，然后加糖和琼胶，加热使琼胶完全熔化后，趁热用纱布过滤。而后分装试管，加棉花塞后灭菌
28、。作平板培养的每管约10ml，作斜面培养的则每管约5ml。还可以分装在三角瓶中灭菌。,培养基中的葡萄糖，改用蔗糖的效果并不差，不加糖分则生长较差。培养基中也可以不加琼胶，配成培养液使用。 PDA往往略带酸性。培养真菌就无需调节酸度，培养细菌则调节到中性反应。酸度可以在加琼胶熔化前、后调节均琼胶对酸度的影响不大,2. 肉汁冻培养基(NA):主要用于细菌的分离和培养。,牛肉浸膏 3g 蛋白胨 510g水 1000ml pH7.0,肉汁冻培养液，每1000ml加琼胶17-20g，即配成固体培养基。肉汁冻培养液中蛋白胨的用量是每1000ml加10g，也可以减少到5g减少用量，缓冲容虽有所降低，但并不影
29、响一般微生物的生长。无论是用新鲜牛肉或牛肉浸膏配制肉汁冻培养基，不一定要加糖 培养植物病原细菌，加糖有利于它们的生长，一般可加葡萄糖或蔗糖10g。蛋白胨和牛肉浸膏是配制培养基的重要材料。酵母膏有时用来代替牛肉浸膏，并且还在其他培养基中使用。,3燕麦片琼胶培养基培养真菌(和放线菌)，可以促使某些真菌形成孢子和子实体，也适用于保存腐霉属(Pythium)和疫霉属(Phytophthora)真菌的菌种。燕麦片 30g 琼胶 17-20g水 1000ml 燕麦片加水1000ml，在沸水浴上加热1h，纱布过滤后加水补足1000ml，加琼胶熔化后分装灭菌。琼胶用量增加到30g，培养基不容易干燥，可用于较长
30、时期的培养，对促进孢子的产生是有利的。,第五节 培养基的保藏,配成的培养基应该注明培养基的种类和配制的日期。培养基在贮存的过程中会丧失水分，贮放时间太长还可能发生其他变化。培养基在冰箱中(24)保存的时间可以长一些，由于条件的限制，很少是这样做的。一般都是放在清洁的玻璃橱内，尽量避免灰尘的沾染。培养基保存的时间的长短，很难作明确的规定，一般以不超过6个月为宜。最合理的办法还是根据需要的量配制，不然多余的培养基不但贮存困难，而且培养基还可能发生一些有害的变化。根据植物病原细菌分离的经验，最好是用新鲜配制的培养基。,第六节 选择性培养基,当有大量其他微生物混杂的情况下，要分离某种类型的或某种特定的
31、微生物，虽然可以用稀释分离法使它们分开来，但有时还很难得到预期的效果；有必要采用对所要分离的微生物有利，而对其他混杂的微生物生长不利的选择性培养基。根据专化程度，选择性培养基分为一般选择性培养基特殊选择性培养基,1一般选择性培养基,只对微生物大类，如对真菌、细菌或者革兰氏染色反应不同的细菌有选择性。而不是对某些特定的微生物有选择性，一般选择性培养基的配制，多半是采取调节培养基的酸度和加适当的抑制性物质等方法。,在分离真菌时，在琼胶培养基中加乳酸或孟加拉红使它的反应呈酸性以抑制细菌生长，这就是一种比较简单的一般选择性培养基。为了抑制真菌和革兰氏反应阳性细菌的生长，培养基中可以加结晶紫和孔雀石青等
32、染料；为了抑制某些革兰氏反应阴性细菌的生长，则加牛胆酸钠和重铬酸钾等。,2特殊选择性培养基,是为分离某些或某一种特定的微生物用的培养基,特殊选择性培养基的设计需考虑以下几方面： 改变碳源和氮源。选用特定微生物所能利用(不一定最好的)，而其他微生物不能利用的碳源或氮源。如分离豆科植物根瘤菌往往以甘露蜜醇作碳源，分离土壤自生固氮菌则培养基中不加任何氮源； 利用抗菌素和其他抑制性物质。由于抗菌素的发展，目前已经有许多作用较专化的抗菌素，抗菌素的单用或混用已经广泛用于配制选择性培养基； 利用微生物对化学物质浓度的耐性，如对食盐溶液浓度的抗性等； 改变培养基的表面张力和氧化还原性状； 培养基中加染料或指
33、示剂等，使菌落和培养基表现特定的颜色。,以玉米蔫萎病细菌(Erwinia stewartii)的分离为例，说明一种选择性培养基的设计过程和各种成分的作用,甘油 30ml (对其他微生物不是良好的碳源) 柠檬酸铁铵 10.0g (氮源，增加氧化还原电位) 氯化钠 15.0g (耐盐的能力) 牛磺胆酸钠 3.0g (降低表面张力，抑制部分革兰氏反应阳性和阴性的细菌) 氯化钙 0.0lg (矿物质营养)硫酸镁0.1g(矿物质营养) 琼胶 17.0g 蒸馏水 加到最后的容量是1000ml,这种培养基有良好的选择性，能够用来从土壤中分离得到玉米蔫萎病细菌。进一步研究发现,在上述培养基中再加制霉素(200
34、单位m1)或放线菌酮(20单位m1)，可以抑制真菌的生长。如在培养基中再加0.02%的苯胺黑，玉米蔫萎病细菌吸收这种黑色素，菌落呈紫黑色。可以与其他杂菌区别,培养基酸度调节到pH7,第七章 灭 菌,微生物学上，灭菌和消毒的含义是不同的。 灭菌：是指用物理或化学的方法，完全除去或者杀死器物表面和内部的一切微生物。 消毒：是指消灭或减少病原微生物以防治侵染，而不是消灭所有的微生物。消毒还有其它作用，如进行分离工作时，植物组织往往要经过表面消毒，目的是消灭组织表面的杂菌而保存组织内的病原菌。,第一节：灭菌的原理和方法,灭菌方法,热力灭菌 过滤灭菌 化学灭菌 辐射灭菌,热力灭菌：,干热灭菌：温度一般在
35、160180间，不宜超过180，常用的温度是165。其应用很有限，高温处理易于破损的和含水的物品，都不能干热灭菌。移殖环接菌、烘箱加热等。湿热灭菌：主要指高压蒸汽灭菌，其效率比干热灭菌高。例如，培养皿用干热灭菌要在160处理1h，湿热灭菌则只要在121处理20min。,湿热灭菌的作用是湿热的渗透力较强，易使蛋白质的凝固。加压的作用是提高蒸汽的温度，灭菌器内的压力增高, 水的沸点和蒸汽的温度也增高。灭菌时的排气非常重要，假如空气没有完全排除，压力表上指出的数值包括空气的压力。为了避免由于空气排除不完全而出现差错，保证完全灭菌，有的高压灭菌器上还有温度计，可以看到达到要求的温度。,高压灭菌器的用法
36、和注意事项如下：检查灭菌器中存水的量。加水到指定的标度； 需要灭菌的器物放在灭菌器内。将盖密闭，打开气门； 加热。等空气完全排除后（蒸汽从气门有力的冲出），关闭气门； 当压力上升到所需要的的指标后，开始计算灭菌的时间，灭菌过程中保持压力不变； 达到需要灭菌的时间，停止加热，稍微打开气门，排除蒸汽使压力慢慢下降； 当压力降到内外相等时，才能打开高压灭菌器的盖。,高压灭菌器的使用，最重要的是注意排气，灭菌前要完全排除容器内的空气。灭菌后，排气的快慢要适当，排得太快，灭菌器中的培养基会沸腾而冲脱或沾湿棉花塞。排得太慢，培养基受高温处理的时间长，对有些培养基是不利的,2.过滤灭菌:液体如含有易被高温处
37、理破坏的物质，可用细菌不能通过的细菌 滤器过滤，得到无菌的滤液。细菌滤器可由瓷质、硅藻土、石棉或玻璃制成。,3辐射灭菌辐射对微生物的影响，因剂量而不同。剂量高的，可以杀死微生 物,所以辐射也用来灭菌和消毒。辐射灭菌的机制，可能是影响细胞的脱氧核糖核酸；或者是破坏细胞的酶系统。,紫外线辐射：其能量和穿透力都很低，几乎不能穿透固体物质，对液体的穿透力也很差。紫外线杀菌取有效的波长在240-280nm，一般紫外线灯管的波长是253.7nm。紫外线辐线由于能量和穿透力都较低，所以主要用于一定范围内空气的灭菌。,第二节 各种材料的灭菌处理,1玻璃器皿的灭菌,以干热在烘箱中加热至160-170处理1h或1
38、50处理2h, 或用高压灭菌器在121处理20min左右进行灭菌，但以连续用同一方法灭菌为好，否则玻璃容易破裂或模糊。,干热灭菌时温度过高，超过180时，棉花和纸张会烤焦，棉花塞变为褐色和分泌油脂，而纸张则容易破碎。器皿放入烘箱以前必须完全干燥，以免引起玻璃的破碎或其中有些成分的分解。灭菌时要使温度慢慢上升，灭菌后待温度逐渐下降到60以下才能打开箱门,避免玻璃器皿因突然冷缩而破碎。,临时需用或加热易于损坏的玻璃器皿灭菌，可用浓铬酸洗涤液、0.1%的升汞溶液、5%的福尔马林或70%的酒精等药剂。药剂灭菌后的器皿，要用灭菌水洗涤几次后再用。,2培养基的灭菌,培养基灭菌一般都是用加压蒸汽(121，2
39、0min)，试管或其他器皿中盛培养基的量太多，有时灭菌不易完全。如果器皿中所盛的培养基的量超过1000ml，同时灭菌前培养基已经冷却凝固，必须延长灭菌的时间到30-45min。在灭菌后放气时，培养基的温度下降要比灭菌器慢，如放气稍快，培养基盛得太满，则会因沸腾而沾湿棉花塞,3土壤的灭菌,土壤是比较难灭菌的。薄层的土壤要在150-170的烘箱内灭菌几小时。如果是用加压蒸汽，121要2h，134.5要1h。经过高温处理的土壤，物理的和化学的性状也有一定的改变。装在小钵内的土壤，还可用间歇灭菌法，连续5d，每天2h。,土壤中的病原生物对高温的抵抗力并不很强，许多土壤灭菌实际上是巴斯德灭菌法(75处理
40、30min或80处理15min)只杀死其中的病原生物，土壤中还残留部分其他微生物。因此，部分灭菌的温度就不需要超过100，潮湿的土壤70条件下处理1h就够了。防治植物病害的土壤热力灭菌，都是采用巴斯德灭菌法。,土壤的化学灭菌，除去用福尔马林处理外，氧化丙烯等熏蒸的方法亦能用于少量土壤的灭菌,4刀、剪、铗等的灭菌,分离和培养时用的工具如刀、剪、铗等，可在酒精中浸过后，再通过火焰将酒精烧去，重复3次就能灭菌。刀剪等都要擦净后再灭菌，避免直接在火上烧，不然会损坏锋口。如果需用大量的刀剪，可用纸包裹或盛于铁盒内在140的烘箱内处理2小时，或用布包好后放在高压灭菌器内灭菌。,第五节 灭菌对培养基的影响,
41、培养基经过灭菌以后会发生许多变化，而这些变化往往是不利的，在进行精密的营养实验时尤其值得注意。 1、酸度的变化。灭菌前调节了pH，灭菌后有时必须再加测定。2、碳水化合物的水解。许多物质在灭菌时受到破坏，双糖类以及复杂的碳水化合物都容易水解，在酸性反应下更容易发生水解，必要时应考虑或其他方法灭菌。,3、葡萄糖发生的反应。葡萄糖可能与磷酸盐起作用产生一种抑制性物质，或者是葡萄糖和磷酸盐与培养基中的氮源起作用，是氮源转变为不能利用状态，因此，在培养某些微生物时，葡萄糖要分别灭菌。 4、沉淀物的产生。产生沉淀也是灭菌常有的问题，灭菌过度更容易发生沉淀。含磷酸盐的培养基容易发生沉淀。为了避免沉淀的产生，可将磷酸盐分别灭菌，冷却后加入。事实上，对于一般培养工作，少量沉淀的影响并不大。最后应该指出，酸度太高时（pH低于3-4)，琼胶在高温下会水解，培养基冷却后就不能再凝固。因此，配制酸度高的培养基，应该先灭菌，在凝固前再将适量经过灭菌的酸加在培养基中。碱性太强的培养基，灭菌后也容易破坏，如碱性较强的马铃薯琼胶培养基，灭菌后可变为褐色或黑褐色。,
