1、第三章真菌感染实验诊断,第一节 真菌的基本特性真菌是一大类具有典型细胞核，不含叶绿素，不分根、茎叶的真核细胞型微生物。,一、真菌的形态特性,（一）单细胞真菌呈圆形，如酵母菌。（二）多细胞真菌由菌丝和孢子组成，称丝状菌或霉菌。,菌丝和孢子的形态因菌而异，是鉴定 真菌的重要依据。孢子又分为多种， 如叶状孢子、分生孢子和孢子囊孢子 等。,二、真菌菌落特性,真菌培养要求不高，常用沙氏 (Sabouraud)培养基(含1蛋白胨、 4葡萄糖或麦芽糖、2琼脂)培养， 适宜温度2228，但深部真菌为 37。形成三种菌落，菌落形态是 鉴别真菌的重要依据。,1酵母型菌落 是单细胞真菌的菌落，形态与细菌菌落相似，较
2、大，表面光滑湿润柔软、边缘整齐，如新生隐球菌。,2. 类酵母型菌落 如白假丝酵母菌，形成假菌丝，伸人培养基中。,3霉菌型菌落 是多细胞真菌的菌落。菌落呈棉絮状、绒毛状，并产生不同的色素，如皮肤癣菌。,第二节 标本采集及检验程序,一、临床标本的采集(一)临床标本类别1皮肤的角质性物质：毛发、指(趾)甲、皮屑等。,2各种分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、粪便、尿液等。,3血液和体液：体液包括胸水、腹水、脑脊液、淋巴穿刺液等。 4脓汁及渗出物。,(二)采集标本注意事项,1.采集的标本要适宜 不同真菌感染应采取不同的临床标本。怀疑为浅部真菌感染如体癣，应刮取病变边缘的痂、皮屑，发癣应取病发。深部
3、真菌感染应取血液、脑脊液、脓汁等。,2在用药前采集标本 一般真菌标本须在用药前采集，对已用药者则需停药一段时间后再采集标本。,3采集的标本量要足 血液和脑脊液标本5ml，胸腔液20ml，皮屑标本两块，活体组织两份 (一份送病理科检查，一份作镜检和培养)。,4严格无菌操作 并进行消毒处理， 尤其是采集血液和脑脊液标本，要避免污染杂菌。 5采集标本立即送检 深部真菌标本最长不得超过2h。,第三节 真菌检验,一、标本直接检查(一)显微镜检查直接镜检对真菌病的诊断较细菌更为重要。许多真菌标本不需染色即可直接镜检，如癣病标本多用KOH湿片检查法，即取病发或病损部位皮屑、甲屑置于载玻片上，加1滴10-20
4、 KOH液，然后加盖玻片并微微加热，使标本组织溶解透明，在显微镜下可观察到真菌的孢子和菌丝。,直接镜检的意义,直接镜检阳性表示： 有诊断意义，如浅部真菌病等； 看到的就是真菌的形态，可确定某些致病性真菌的属或种, 如假丝酵母菌的厚膜孢子等；,判断某些真菌种的致病性等,如皮肤癣菌、曲霉等。,直接镜检也有局限性： 阴性结果不能排除真菌感染； 有假阳性结果。因此，对直接镜检可疑结果应作复查或用其他检验方法鉴定。,(二)抗原检测,常用的方法有胶乳凝集试验、 ELISA、半定量放射免疫法。 均应设对照，防止发生假阳 性和假阴性。,用胶乳凝集试验检测标本中的白 假丝酵母菌甘露聚糖抗原。用胶乳凝集试验和EL
5、ISA检测血 清和脑脊液中的隐球菌多糖荚膜抗 原，在治疗前检测非常敏感特异。,用半定量放射免疫法检测血清、尿液和脑脊液中荚膜组织胞浆菌循环多糖抗原，可快速诊断。,二、真菌的分离培养,真菌培养是目前鉴定真菌的惟一 方法。培养真菌的温度为28， 但深部真菌为37。菌落是鉴 别真菌的方法。注意以下几点：,菌落性质：酵母菌还是霉菌； 菌落大小，病原性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大；,菌落颜色 病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深； 致病性真菌菌落下沉，有时使培养基开裂；污染性真菌菌落不下沉,很少引起开裂。,三、真菌的生化反应,用于主要深部感染真菌如假丝酵 母菌、隐球菌等。 1.糖(醇)类发酵试验 37
6、孵育，观察糖发酵情况。,2.同化碳源试验 含菌生理盐水与已融化的固体同化碳源培养基(45)混合，然后在培养基上分别加糖，置25孵育观察结果。若24h后无变化可重复加糖。如能同化周围有生长圈，否则无生长。,3.同化氮源试验 同化碳源试验相同，但需用无氮源的培养基，不要加糖类，而加入硝酸钾。,四、动物实验,实验的目的是分离病原性真菌、确定真菌菌种的致病性、研究药物对真菌的作用等。如假丝酵母菌接种家兔或小白鼠，肾脏明显肿胀，肾皮质部位有白色脓疡。,五、核酸检测,医学真菌的鉴定手段引入了分子生 物学的鉴定方法，从核酸碱基G+Cmol分析、限制性片段长度多态 性(RFLP)、Southern印迹分析到脉
7、 冲场凝胶电泳(PFGE)、PCR指纹、 随机扩增多态性DNA(RAPD)以及DNA 特殊片段测序等。,（一)G+Cmol分类鉴定法,常用热变性温度法。原理是DNA加热变性使碱 基氢键被打开，双链螺旋变成单链，导致核 苷酸碱基在260nm紫外吸收明显增加，完全 变成单链后，紫外吸收增加停止。紫外吸收 增加的中点值温度为热变性温度（Tm）。 若真菌DNA中G+C碱基对含量多，Tm值就高。 可直接反映G +C碱基对的绝对含量。 计算公式为：G+Cmol=(Tm-53.9)2.44,(二)真菌核型的脉冲电泳分析,脉冲凝胶电泳技术(PFGE)解决 了真菌大分子DNA的分离技术难题。,原理：PFGE有两
8、个方向的电场在设 定的脉冲时间里交替变换，使大分 子DNA在移动中不断改变自己的形状 及迁移方向，从而绕过细小的凝胶 孔隙而得以分离。较大的DNA分子泳 动慢些，较小的快些，有许多因素影 响电泳带型，分离真菌等大分子量的 DNA宜用较低电压和较长脉冲时间。,用PFGE分析真菌核型，可直接比较 其遗传背景,从电泳核型差异中进行 分类鉴定,又能取得基因结构的基本 数据，构建出大尺度物理图谱。,(三)随机扩增多态性 DNA(RAPD)分析,RAPD分析是一种利用随机合成的单个 寡核苷酸引物，通过PCR扩增靶细胞 DNA，扩增产物凝胶电泳，分析DNA 片段大小和数量的多态性，从而比 较靶基因差异的一种
9、技术。由于病 原性真菌基因组庞大，RAPD分析适 用于真菌的鉴定与分类。,六、真菌毒素的检测,真菌产生有毒的代谢产物，可引起急 慢性真菌中毒症，引起消化道中毒症 状，而且可进入人体内引起病变，如 引起肝脏损伤的黄曲霉毒素、杂色曲 霉毒素；引起肾脏损害的桔青霉素； 引起中枢神经系统损害的黄绿青霉素 等。甚至有的毒素具有致癌性，如黄 曲霉毒素与肝癌发生有关。,检测真菌毒素有许多方法，如检测 黄曲霉毒素有生物学方法和ELISA法 等。生物学方法主要用于检测真菌 毒素的毒性，如用鸡胚、小白鼠作 毒性试验，观察动物中毒死亡或出 现肿瘤。ELISA法操作简便，并具有 安全快速高效、费用低，适用于大 批量标本的筛选。,
