分子诊断技术之PCR.ppt

1、分子诊断技术之PCR,生物技术教研室：郑 鸣,PCR诊断主要通过引物介导特异性扩增目的基因以检测内源性或外源性目的基因的存在与否，进而对疾病的预防、诊断、和治疗提供信息和决策依据。,一 PCR诊断技术原理,相关实验开展,一 PCR诊断技术原理,二 PCR技术基本知识回顾,PCR技术简史 PCR的原理,PCR技术简史,DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明,PCR技术简史,DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明,引物酶,引物酶,PCR技术简史,DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明,DNA 聚合酶,DNA 聚合酶,PCR技术简史,DNA的复制 核酸体外扩

2、增的设想 聚合酶链反应的发明,PCR技术简史,DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明,Kary B. Mullis,1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 PCR只是一个简单的不起眼玩艺。凯利穆利斯（Kary Mullis) 我不认为PCR能够用两种“革命”(政治革命和科学革命)加以说明。它的发明并没有改变基因操作的本质。有了PCR，我们能在更广的范围内更快、更容易地进行基因操作，学术界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不过是一种新工具。凯利穆利斯（Kary Mu

3、llis),生物样品,DNA片段,基因诊断,基因治疗,基因工程产品,法医学检测,人类学研究,基因组DNA,获取特定DNA片段,扩增特定DNA片段,DNA聚合酶,引物,引物,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,94变性,50-65退火,XX延伸,94,55,37,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,10080604020,72,94,55,PCR循环,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,重复13步

4、2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,PCR的基本原理,模板DNA,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,PCR的基本原理,引物1,引物2,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,PCR的基本原理,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,PCR的基本原理,第1轮结束,第2轮开始,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,PCR的基本原理,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,PC

5、R的基本原理,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物设计,分离核酸,三 PCR反应体系基本组份,目前有两种 Taq DNA聚合酶供应 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶：大肠菌合成 一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为100 ul时） 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少,酶（rTaq）,dNTPs（dATP,dGTP,dCT

6、P,dTTP）,dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系 dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活 dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解 在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ）， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量 dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmo

7、l/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,Mg2+,引物（primer）,引物是PCR特异性反应的关键； PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度； 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。,引物设计是PCR 技术中至关重要的一环，使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带，不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通

8、过计算机软件进行。,引物设计的基本原则,引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体（Dimer）或发夹结构（Hairpin） 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配False Priming)。,引物（primer）,具体因素,引物长度（primer length） 产物长度（product length） 序列Tm 值(melting temperature) 引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用G 值反映) 形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin

9、）的能值 在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition） ,引物（primer）,引物的长度：一般为15-30 bp，常用的是18-24 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，即Taq 酶的最适温度。 引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200 ).而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个. 较长的引物（28-35bp)一般是用来区分同源性较

10、高的模板序列或者使用于产生一些突变位点。,引物（primer）,引物设计的一般原则,引物（primer）,引物设计的一般原则,引物的Tm值引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过46度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.经验公式：Tm=2(A+T)+4(C+G)（primer5.0）Nearest nei:最近邻位（oligo6.0）,引物（primer）,引物设计的一般原则,引物序列的GC含量一般为40-60%，以45-55为宜，过高或过低都不利于引发反应。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的G

11、C含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。如果G-C比例超出，则在引物的5端增加A或T；而如果A-T比例过高，则同样在5端增加G或C。,引物3端的序列要比5端重要引物3端的碱基一般不用A（3端碱基序列最好是G、C、CG、GC），因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5端序列对PCR 影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。,引物（primer）,引物设计的一般原则,引物序列在模板内应当没有相似性较高、尤其是3端相似性较高的序列，

12、否则容易导致错配。引物3端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。,引物（primer）,引物设计的一般原则,可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高。错误引发的引发率一般不要高过100，如此可保证不出非目的产物的假带。但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450 以上，而在错误位点的引发效率为130，并且不好找其他更合适的引物，那么这对引物也是可以接受的。,引物（primer）,引物设计的一般原则

13、,G值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。一般情况下，引物的G值最好呈正弦曲线形状，即5端和中间G值较高，而3端G值相对较低，且不要超过9（G值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。引物的3端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（能值越高越容易结合）,引物（primer）,引物设计的一般原则,引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR 正常反应不能进行。与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3端的连续GGG 或CCC 会导致错误引发。

14、二聚体形成的能值越高越稳定，越不符合要求。与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。虽然有些带有发夹环，其G为3 kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。当然，如果发夹环在5末端对反应就没有多大的影响了。,引物（primer）,引物设计的一般原则,Oligo 6 （引物评价）* Primer Premier （自动搜索）* Vector NTI Suit Dnasis Omiga Dnastar Primer3 （在线服务）*,引物（primer）,引物设计的常用软件,Primer Pr

15、emier 5.0 的使用简介,主要功能: 引物设计 限制性内切酶位点分析 DNA 基元(motif)查找 同源性分析,简并引物设计,根据氨基酸序列来设计引物DNA引物 Premier Primer 5提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择 1、纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear） 2、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion） 3、支原体（Mycoplasma） 4、植物线粒体（Plant Mitochondrion） 5、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion） 6、一般标准（Standard） 7、脊椎动物线粒体（Ve

16、rtebrate Mitochondrion） 8、酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）,Primer Premier 5.0使用介绍(1),Preimer Premier 启动界面,Load sequence,基本信息,Sequence name,Original sequence,Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好,Choose a function,引物设计界面,Sense strand or anti-se

17、nse strand,Useful information of the primer,First you can design the primer manually,引物搜索选项设定,引物类型,搜索模式,5引物位置范围,3引物位置范围,产物大小范围,引物长度,搜索结果,28对引物,引物分值 100分为满分,每对引物的信息,双击选中一对引物,引物信息,回到主窗口,引物及产物信息,是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer,一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏都none，But ,引物编辑,引物编辑,Edi

18、t primer here,Analysis the edit result,Accept the edit result Return to the main window,用primer5.0对引物评价,duplex formation:这是评价引物二聚体形成的，包括自身形成二聚体和引物间二聚体，形成二聚体的能值，引物3端有无配对碱基(最好没有)。 hairpin formation:是看引物自身能否形成发夹结构，主要也是看3端不要形成发夹结构。还要看形成发夹结构的能值，不超过4.5。 false priming site: 如果模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，需要进行错配的分

19、析，看你的引物（尤其3端）是否与特定模板的其他位点结合。 PCR：总结性的显示引物位置，产物大小，Tm值等参数，你可以横向比较一下，,Oligo 6.0 使用说明,主要功能：专门的引物设计和分析软件,Oligo 6.44 启动界面,Open sequence file,3个弹出窗口,Melting temperature,G Internal Stability,Frq为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。,用Oligo 设计引物时的3个标准,Tm 值曲线以选取5到3的下降形状有利于引物引发聚合反应。 Frq 曲线宜选用3端Frq 值

20、相对较低的片段。 G 值在5端和中间值比较高，而在3端相对低。,选中引物,上游引物,下游引物,只是示意图,引物分析,首先检查引物二聚体尤其是3端二聚体形成的可能性。,引物分析,二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。,引物分析,第三项检查为GC 含量，以45-55为宜。 第四False priming 检查,引物分析,Key information of primer,Hairpin,Dimer and cross Dimer,GC%,Total PCR information,Final PCR information,Search for primer

21、using Oligo 6.0,Search primer,利用oligo6.0进行引物评价,duplex formation:这是评价引物二聚体形成的，包括自身形成二聚体和引物间二聚体，主要是看引物3端有无配对碱基(最好没有)。形成的二聚体要看能值，能值越低越好，最好不要超过4.5 hairpin formation:是看引物自身能否形成发夹结构，主要也是看3端不要形成发夹结构。还要看形成发夹结构的能值，不超过4.5。如果引物中加入酶切位点，可能会有发夹结构且能值不会太低，这就需要灵活控制退火温度了。 composition and Tm:分析上下游引物的碱基组成，GC比和Tm值，原则我就不

22、多说了。,false priming site: 如果模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，需要进行错配的分析，看你的引物（尤其3端）是否与特定模板的其他位点结合。一般错配的引发效率以不超过100为好，但并不绝对，如果正确结合位点的引发效率为450以上，而有一个错配的引发效率是120左右的，这个引物也是可以接受地！ PCR：总结性的显示引物位置，产物大小，Tm值等参数，你可以横向比较一下，尤其是给了一个optimal annealing tem还是可以参照一下地。也给了简单的评价供参考。,利用oligo6.0进行引物评价,每条引物的浓度0.1 1umol或10100 pmol，以最低引物

23、量产生所需要的结果为好 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。,引物（primer）,引物浓度,核酸,单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 浓度一般为100ng /100L，模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。,模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。,分离核酸的基本步骤和原则,尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。 条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。 抑制核酸酶。,制备细胞及

24、破碎细胞,消化蛋白质,去除生物大分子,去除不需要的核酸分子,沉淀核酸,去除杂质,基本步骤：,基本原则：,SDS-蛋白酶K法的基本原理,SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（5060）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白酶K降解核蛋白，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿反复抽提除去蛋白质 用无水乙醇沉淀水相中的DNA。,SDS-蛋白酶K法DNA提取缓冲液,动物性材料DNA的分离提纯-SDS-蛋白酶K法,SDS-蛋白酶K法基本流程,动物性材料DNA的分离提纯-SDS-蛋白酶K法,动物性材料DNA的分离提

25、纯-SDS-蛋白酶K法,SDS-蛋白酶K法主要试剂,组织匀浆缓冲液：100mM NaCl 10mM Tris pH8.025mM EDTA pH8.0,消化缓冲液：200mM NaCl 20mM Tris pH8.050mM EDTA pH8.0,TE缓冲液：10mM Tris pH8.01mM EDTA pH8.0,其他试剂：Tris平衡酚:氯仿:异戊醇=25:24:1氯仿：异戊醇=24:1蛋白酶K储存液：20mg/mlRNase 储存液：10mg/mlNaAc (pH5.2)： 3M无水乙醇,动物性材料DNA的分离提纯-SDS-蛋白酶K法,SDS-蛋白酶K法实验步骤,动物性材料DNA的分离

26、提纯-SDS-蛋白酶K法,SDS-蛋白酶K法实验步骤,2 DNA提取 用宽口吸头小心移取上清400ul，注意不要取中间白色层（若上清仍混浊，可再重复38抽提1次）； 向上清中加入1/10体积的NaAc，温和地充分混匀，再向溶液中加入2.5倍体积的无水乙醇，室温放置510min或-20放置30min以上； 室温12000rpm离心58min，弃上清； 向沉淀中加入1ml7075的乙醇，温和地上下颠倒混匀58次； 室温12000rpm离心25min，弃上清； 将离心管轻轻在滤纸上磕几下，以除去残留的液体，短暂离心后用吸头小心取出残留液体,之后将离心管敞口室温放置15min左右或在37放置15min

27、左右至无明显的乙醇气味即可； 向沉淀中加入3050ul的无菌水或TE溶液溶解DNA样品。,动物性材料DNA的分离提纯-SDS-蛋白酶K法,SDS-蛋白酶K法实验步骤,CTAB法原理,CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。,注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。,植

28、物性材料DNA的分离提纯-CTAB法,Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； -巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除,CTAB提取缓冲液的经典配方,植物性材料DNA的分离提纯-CTAB法,PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。,CTAB提取缓冲液的改进配方,植物性材料D

29、NA的分离提纯-CTAB法,CTAB法基本流程,植物性材料DNA的分离提纯-CTAB法,CTAB法主要试剂,植物性材料DNA的分离提纯-CTAB法,CTAB抽提液：3%（W/V) CTAB1.4M NaCl 100mM Tris pH8.020mM EDTA pH8.02%(V/V) -巯基乙醇(用前加入)5%(W/V) PVP40(可以不用),TE缓冲液：10mM Tris pH8.01mM EDTA pH8.0,其他试剂：Tris平衡酚:氯仿:异戊醇=25:24:1氯仿：异戊醇=24:1RNase 储存液：10mg/mlNaAc (pH5.2)： 3M 无水乙醇,CTAB法实验步骤,植物性

30、材料DNA的分离提纯-CTAB法,CTAB法主要试剂,植物性材料DNA的分离提纯-CTAB法,2 DNA提取 用宽口吸头小心移取上清400ul，注意不要取中间白色层（若上清仍混浊，可再重复27抽提1次）； 向上清中加入1/10体积的NaAc，温和地充分混匀，再向溶液中加入2.5倍体积的无水乙醇，室温放置510min或-20放置30min以上； 室温12000rpm离心58min，弃上清； 向75的乙醇，温和地上下颠倒混匀58次； 室温12000rp沉淀中加入1ml70m离心25min，弃上清； 将离心管轻轻在滤纸上磕几下，以除去残留的液体，短暂离心后用吸头小心取出残留液体,之后将离心管敞口室温

31、放置15min左右或在37放置15min左右至无明显的乙醇气味即可； 向沉淀中加入3050ul的无菌水或TE溶液溶解DNA样品。,CTAB法主要试剂,植物性材料DNA的分离提纯-CTAB法,基因组DNA的提取注意事项,基本步骤：,I.材料准备,最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集,材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： 植物材料液氮研磨 动物组织匀浆或液氮研磨 组培细胞蛋白酶K 细菌溶菌酶破壁

32、 酵母破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡,II.破碎细胞或包膜,采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,III.核酸分离、纯化,蛋白质的去除： 酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理,III.核酸分离、纯化,多糖的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖

33、的羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。,III.核酸分离、纯化,多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合,盐离子的去除：70-75的乙醇洗涤,III.核酸分离、纯化,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 沉淀后应用70

34、的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解,IV.核酸的沉淀、溶解,DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质； DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应； DNA中残留有金属离子。,重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前） 重新沉淀DNA，让酒精充分挥发 增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）,问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。,原 因,对 策,基因组DNA的常见问题,材料不新鲜或反复冻融； 未很好抑制

35、内源核酸酶的活性； 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断； 外源核酸酶污染； 反复冻融。,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融； 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液； 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量； 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔； 所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌； 将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融。,问题二：DNA降解。,对 策,原因,基因组DNA的常见问题,实验材料不佳或量少； 破壁或裂解不充分； 沉淀不完全； 洗涤时DNA丢失。,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料； 动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式

36、破壁； 高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）； 低温沉淀，延长沉淀时间； 加辅助物，促进沉淀； 洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒。,问题三：DNA提取量少。,对 策,原因,基因组DNA的常见问题,细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放； 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下因溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离； 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。,RNA的分离提纯-异硫氰酸胍/苯酚法,异硫氰酸胍/苯酚法的基本原理,RNA的分离提纯-异硫氰酸胍/苯酚法,异硫氰酸胍/苯酚法的基本流程,RNA的分离提纯

37、-异硫氰酸胍/苯酚法,异硫氰酸胍/苯酚法主要试剂,细胞裂解液：4M 异硫氰酸胍25mM 柠檬酸钠 pH7.0 0.5% 十二烷基肌氨酸钠0.1mol/L -巯基乙醇(用前加入)其他试剂：水平衡酚:氯仿:异戊醇=25:24:1NaAc (pH4.0)： 2M 0.1%DEPC70-75%乙醇异丙醇RNase-free水,Trizol法提取RNATrizol试剂：购买不同厂家的试剂其他试剂：氯仿0.1%DEPC70-75%乙醇异丙醇RNase-free水,RNA的分离提纯-异硫氰酸胍/苯酚法,异硫氰酸胍/苯酚法实验步骤,1 样品处理：取新鲜组织1-2g，剪碎，置于组织匀浆器中，加入5ml加入预冷的

38、细胞裂解液，充分研磨形成匀浆液，室温放置5min后分装不同的1ml离心管，每管700ul； 2 RNA的抽提 加入2mol醋酸钠（pH4.0）84l，充分混匀。 加入800ul酚：氯仿：异戊醇，充分混匀摇振10s，冰浴10min4，12000r/min离心20min；移取上层水相至另一离心管中，加入等体积的异丙醇，室温静置5min，沉淀RNA；,RNA的分离提纯-异硫氰酸胍/苯酚法,异硫氰酸胍/苯酚法实验步骤,2 RNA的抽提4，12000r/min离心10min.弃上清液，加入70-75%乙醇1ml，洗涤RNA沉淀物；4，10000r/min离心2-5min。 弃上清液，自然干燥，但应避免沉

39、淀完全干燥，否则RNA难以溶解 加入30-50lRNase-free水重悬RNA，或加1ml无水乙醇和1/10体积3M 醋酸钠（pH4.0），-C70保存。,RNA的提取注意事项,基本步骤：,I.材料准备,新鲜，切忌使用反复冻融的材料； 如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于-70或-20保存； 如要多次提取，请分成多份保存； 液氮长期保存，70短期保存。,II.破碎细胞或包膜,根据不同材料选择不同的处理方法： 培养细胞：通常可直接加裂解液裂解 酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁 动植物组织：

40、先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻 样品量适当，保证充分裂解； 为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量。,III.核酸分离、纯化,在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速； 经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成 RNA 降解； 柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分； 沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等； 晾干RNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）； 若长期储存，建议在无水乙醇和1/10体积3M 醋酸钠（pH

41、4.0）溶液中，-70保存。,IV.核酸的沉淀、溶解,样品不新鲜； 裂解不充分； 外源RNase污染。,取新鲜细胞或组织，尽量避免样品反复冻融，尽量在低温条件下处理样品； 检查裂解液的质量是否合格，适当增加裂解液用量，延长裂解时间； 严格处理实验中所需的各种耗材和试剂。,问题一： RNA 的降解 。,原 因,对 策,RNA分离的常见问题,蛋白质污染； 酚类污染； 抽提试剂残留。,不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够； 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底； 重新抽提一次，再沉淀，溶解； 确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇。,问题二：

42、OD260 /OD280 比值偏低。,原 因,对 策,RNA分离的常见问题,RNA降解； 抽提试剂残留； DNA污染。,操作时注意防止RNA降解； 确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇； 使用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提的RNA 。,问题三：下游实验效果不佳。,原 因,对 策,RNA分离的常见问题,四 PCR反应条件设置,温度 时间 循环次数,温度与时间的设置,设置变性-退火-延伸三个温度点。 标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，

43、使引物链沿模板延伸。 对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸。,温度与时间的设置,变性温度与时间,变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因 一般9394lmin足以使模板DNA变性 若低于93则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。 此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。,温度与时间的设置,退火温度与时间,退火温度是影响PCR特异性的较重要因素 变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合

44、机会远远高于模板互补链之间的碰撞 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想,温度与时间的设置,退火温度与时间,经验公式：Tm值（解链温度）=4（G+C）2（A+T） 复性温度=Tm值-（510） 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性 复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合,延伸温度：一般选择在7075之间 常用温度为72 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1K

45、b以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 34kb的靶序列需34min 扩增10Kb需延伸至15min 延伸进间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。,温度与时间的设置,延伸温度与时间,循环次数的设置,决定PCR扩增程度 主要取决于模板DNA的浓度 循环次数：选在3040次之间 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多,四 PCR诊断技术流程,病料总DNA的分离,病料总DNA的电泳检测,配制PCR扩增体系,设置PCR循环参数,进行PCR扩增,PCR产物的电泳检测,病毒感染结果判断,质量高,质量差,有带,无带,阳性,阴性,DNA病毒诊断,RNA病毒诊断,五 PCR诊断

46、技术流程,病料总RNA的分离,病料总RNA的电泳检测,配制PCR扩增体系,质量高,质量差,配制反转录反应体系,反转录合成cDNA,设置PCR循环参数,进行PCR扩增,PCR产物的电泳检测,病毒感染结果判断,有带,无带,阳性,阴性,实验一：耗材的准备及试剂的配制（全班分4大组）,实验耗材：,实验试剂：,NaCl: 3M 50ml/班 Tris: 1M(pH8.0) 50ml/班EDTA: 0.5M(pH8.0) 50ml/班NaAc: 3M(pH5.2) 50ml/班CTAB抽提液（未加-ME）: 20ml/组匀浆缓冲液： 20ml/组消化缓冲液： 20ml/组TE 缓冲液： 8ml/组SDS: 10% 8ml/组Tris平衡酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）： 50ml/组氯仿：异戊醇(24:1): 50ml/组75%乙醇： 50ml/组无水乙醇： 30ml/组 试剂标签：名称、浓度、pH、班级、组别、日期。,移液器吸头：1ml 4盒/班200ul 4盒/班10ul 4盒/班离心管： 1.5ml 4烧杯（200ml）/班,