1、基因诊断在遗传病监测中的应用 目前发现人类遗传性疾病有 3 000 多种，如果仅依靠以往的染色体分析技术或对基因产物与代谢物的测定，我们只能对其中为数极少的一部分疾病在发病前或产前进行诊断。因为许多基因的表达有时相性和组织特异性（如有些基因在胎儿早期并不表达、苯丙氨酸羟化酶只在肝组织中表达）。用常规的方法采集的胎儿标本或其他人体材料，常常不能测出这些基因的产物或代谢产物。然而，作为构成机体基本单位的细胞，无论其来自何种器官或组织，它们的基因组成却是完全一致的；虽然在某些特异化的组织细胞中某些基因并不表达，但那些基因的突变却存在于一切细胞之中。如果采用基因分析的方法进行监测，在个体发育的任何阶段
2、，以任何一种有核细胞为检材，基因的缺陷都能被监测出来。这就是近十几年来飞速发展的重组 DNA 技术给遗传病的早期（症状前和出生前）诊断带来的福音。重组DNA 技术不仅极大地丰富了我们对人类遗传病分子病理学的知识，而且同时也提供了从 DNA 水平对遗传病进行基因诊断的手段。自从 1978 年发现第一个限制酶切位点多态性并应用于遗传病（镰形细胞贫血）的基因诊断以后，能够进行基因诊断的病种不断增加，方法和途径越来越多。一、基因突变的类型造成基因突变的原因很多，有自发的也有外界理化因素的影响。从 DNA 序列改变的角度来看，不外乎单核苷酸的取代和 DNA 片段的插入或缺失两大类型。所产生的后果取决于突
3、变发生的位置和性质，只要影响了基因表达过程中的任何一个环节，都会导致遗传性疾病。归纳起来如表 1 所示表 1 基因突变及效应一览表 DNA 序列的改变 突变发生的部位 mRNA 水平的表现 基因产物的改变 举 例1.大片段缺失或插入 整个基因 缺如 缺如 地中海盆血基因片段 异常 功能缺陷 DMD、BMD2.少数核苷酸的缺失或插入 外显子与内含子接界 拼接异常 缺如 3 的整数倍 外显子 缩短或延长 异常（氨基酸缺失或插入） Hb Leiden非 3 的整数倍 外显子 缩短或延长 异常（移码突变） 地中海盆血3.单核苷酸取代 启动子 减少 减少 地中海盆血剪接信号 剪接异常 缺如 地中海盆血P
4、olyA 信号 不稳定 减少 地中海盆血密码子 中性突变 正常 密码子 错义突变 氨基酸取代 异常血红蛋白密码子或内含子 剪接异常 缺如或移码突变 地中海盆血密码子 无义突变 肽链提前终止 地中海盆血终止密码 肽链延长，量减少 Hb Canstant spring起始密码 地中海盆血缺如 地中海盆血二、遗传病基因诊断的途径在了解了基因突变的各种类型之后，对应用何种方法来诊断它们便很容易理解了。例如某种遗传病是由于基因缺失造成的，可通过监测受检者是否缺失该基因来直接判断其基因型。如果某遗传病是核苷酸取代造成的点突变，便可以通过监测该突变的方法（ASO 探针或酶切位点监测）来进行诊断。如果致病突变
5、或病因还不清楚，但有相关的基因探针或已知其与某位点的 RFLP 紧密连锁，便可进行家系分析，通过该位点状态的连锁分析进行监测。下面根据不同的情况，举例说明基因诊断中常用的方法。1.直接监测 （1）应用基因探针或 PCR 进行缺失型基因监测 部分 地中海贫血和三分之二以上的杜氏及贝氏进行性肌营养不良（DMD 及 BMD）是整个基因或基因片段的缺失造成的。应用基因探针（基因组 DNA 或 cDNA 探针）进行 Southern 印迹杂交，如果某些杂交片段消失或片段长度改变（不是由于限制酶识别位点的改变造成的 RFLP），即可判定受检者有基因缺失。应用近年来发展起来的 PCR 技术，也可进行缺失基因
6、的监测。根据缺失发生区域的 DNA 序列，合成一对引物进行基因扩增（反应体系中必须包含有另一无关 DNA 片段的扩增引物，作为反应是否成功的内对照），通过凝胶电泳检查，如果没有扩增片段，便说明该基因或该 DNA 片段缺失，对 地中海盆血中的 Hb Bart 水肿胎儿的产前诊断和 DMD/BMD 的产前基因诊断都是应用此法进行。（2）造成特异限制酶切位点改变的突变基因的监测 有时，某些“点”突变（一般为单个核苷酸的取代或少数几个核苷酸的缺失或插入）正好影响了某种限制酶的识别位点（丢失或增加），对这些与基因突变相关的酶切位点的改变，可用来进行突变基因的直接监测。例如 珠蛋白基因密码子 6 处有一
7、Mst的识别位点（CCTGAGG），而在 HbS 病人的 珠蛋白基因，因其密码子 6 由 GAG（谷氨酸）突变为 GTG（缬氨酸），破坏了 Mst的识别序列。使得正常的两个杂交片段（1.15kb,0.2kb）消失，而出现一个异常的 1.35kb(1.15+0.2=1.35)片段。许多实验室应用 -S基因的这个特异标志，直接用 Mst酶解 珠蛋白基因相应区域的 PCR 产物进行 HbS 病的产前基因诊断。（3）突变位点特异性监测ASO 探针斑点杂交 绝大多数“点”突变不改变酶的识别位点，但经 DNA 序列分析明确基因的突变的细节之后，可人工合成针对突变位点的特异寡核苷酸（allele speci
8、fic oligonucleotide,ASO）探针，进行突变基因的直接监测。ASO 探针的长度一般为 19 个碱基，分别与被测定的突变所在区域的正常和异常 DNA 序列互补。在一定的杂交和洗脱条件下，只要有一个碱基不匹配，就不能形成稳定的杂交链，正常探针只能与正常基因序列杂交而不能与突变基因的序列杂交，反之亦然。1983 年 Conner 等首先应用 ASO 探针进行镰形细胞贫血的基因监测，现在已广泛应用于 地中海贫血及其他遗传性疾病的基因诊断。PCR 技术的发明使 ASO 探针的使用更加快速简便。用 PCR 产物进行斑点杂交，不仅降低了同源序列的背景干扰，而且降低了对探针放射强度的要求。可
9、以用非放射性物质进行探针标记，操作安全，并且不受同位素半衰期的限制。目前对 地中海贫血、经典型 PKU 等基因的诊断，都是应用此途径。2.间接分析监测致病基因RFLPs 连锁分析 进行限制酶切片段长度多态性（RFLP）连锁分析，目前还是施行基因诊断的主要手段。对于遗传性疾病，目前了解其病因的只是其中的一小部分。即使对那些已经知道了结构基因的遗传病，由于其致病突变的细节（即核苷酸序列的改变）一时还不了解，还不能合成相应的寡核苷酸探针进行 PCR/ASO 监测。更不用说那些目前连其遗传缺陷的生化机理尚不明确的遗传性疾病了。对于这一类基因缺陷的监测，只能通过间接的途径，即应用 RFLP 连锁分析进行
10、基因诊断。一般说来 RFLP 分析所监测到的 DNA 多态性通常是中性突变，与基因的致病突变之间不存在连锁不平衡性，因此一个多态位点存在与否并不说明基因是否异常。只有在特定的家系中才具有一一对应的关系。多态性位点在基因连锁分析中的应用价值，除了它与致病突变之间连锁的紧密程度以外，还与它的杂合频率有关。连锁越紧密所得结果越可靠；杂合频率越高应用价值越大。我们用多态性信息量（polymorphism information contents,PIC）来衡量，PIC 是指某一家系可以利用 RFLP 作为遗传标志进行基因连锁分析的概率；就整个群体而言，它是指在群体中利用这些 RFLP 进行基因诊断的诊
11、断率。有时单单分析一个多态性位点，还不能将某一家系中的致病基因所在染色体与正常染色体区分开来，必须分析多个位点的状态，综合起来才能获足够的信息。我们将一条染色体上两个或两个以上与致病基因密切连锁的多态性位点状态的组合叫作染色体单倍体型（haplotype）。无论是何种遗传性疾病，只要有与之密切连锁的 RFLP 位点（基因本身或邻近的 DNA 序列），便可应用核心家系成员（先证者及父母）的 DNA 进行 RFLP 分析，确立致病基因所在染色体与 RFLP 位点状态的连锁关系。但只有在那些连锁关系明确、正常与异常染色体能够区别的家系中，才能对家系成员进行症状前或产前基因诊断。（1）应用基因探针进行
12、 RFLPs 分析 应用基因探针（基因组 DNA 或 cDNA 探针）所监测到的 RFLP 位点在基因的内部或基因附近，它与基因突变位点之间连锁非常紧密，通常情况下很少发生重组（除非基因本身非常庞大，如抗肌萎缩蛋白基因，2300kb），因此非常可靠。DNA 序列已经明确的基因内或旁侧序列中的酶切位点的多态性状况还可以用 PCR 方法来监测。PCR 扩增后用相应的限制酶来酶解扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳确定 DNA 片段是否被酶解成小片段；或者将 PCR 扩增产物进行 ASO 斑点杂交判断基因座的状态。用基因探针直接和间接分析法可诊断的遗传病见表 2 和表3。表 2 用 RFLPs 直接分析法可
13、诊断的遗传病（不完全统计） 遗传病 基因探针软骨发育不全 型胶原蛋白肾上腺皮质增生症 类固醇 21 羟化酶淀粉样多发神经病变 前白蛋白抗凝血酶缺乏症 抗凝血酶Ehlers-Danlos 综合征 1(1)胶原蛋白 第 10 因子缺乏症 第 10 因子A 型血友病 第 8 因子及合成寡核苷酸B 型血友病 第 9 因子高胆固醇血症 低密度脂蛋白受体HPRT 缺乏症 HPRT免疫球蛋白 k 链缺乏症 免疫球蛋白 CkLesch-Nyhan 综合征 HPRTMarfan 综合征 微纤维元基因 FN1型成骨不全 原 1（1）胶原蛋白地中海贫血 珠蛋白 珠蛋白合成寡核苷酸抗胰蛋白酶缺乏症 合成寡核苷酸DMD
14、、BMD 抗肌萎缩蛋白基因表 3 用 RELPs 间接分析法可诊断的遗传病(不完全统计) 遗传病 基因探针淀粉样变性 前白蛋白1 抗胰蛋白酶缺乏症 1 抗胰蛋白酶载脂蛋白 C缺乏症 载脂蛋白 C动脉粥样化 载脂蛋白 A型生长激素缺乏症 生长激素A 型血友病 第 8 因子B 型血友病 第 9 因子甲状腺机能低下 甲状腺球蛋白高胆固醇血症 低密度脂蛋白受体基因高脂血症 载脂蛋白 A高甘油三酯血症 载脂蛋白 ALesch-Nyhan 综合征 HPRT苯丙酮尿症 苯丙氨酸羟化酶 地中海贫血 珠蛋白血栓形成 抗凝血酶DMD、BMD PERT87-8 P20（2）应用染色体 DNA 片段作探针进行 RFL
15、Ps 分析 除了基因探针之外，还有一些探针是基因组 DNA 片段。这些从基因组文库中分离获得的 DNA 片段，在确定了其能监测出某些限制酶的 RFLP 后，便可用作探针的候选者。经过染色体定位，大致判定其是否与目前已知的遗传性疾病有连锁关系，然后再通过对此遗传性疾病家系的 RFLP 连锁分析和优势对数计分（Lod score），确定是否密切连锁。如是，便可用作基因分析以至基因诊断的探针，如 -3HVR 序列用于APKD 的基因分析（表 4）。表 4 用 DNA 片段为探针监测的遗传病（不完全统计） 遗传病 基因探针肾上腺白质营养不良（adrenoleukodystrophy） Stl4成人型多
16、囊肾 珠蛋白遗传性肾炎 DXS3DSS1纤维囊性变 LAM4-917脆 X 综合征 第 9 因子5q-综合征 C-fmsBechwith-Wiedmann 综合征 第 11 号染色体 DNA 片段猫叫综合征 第 5 号染色体 DNA 片段成视网膜细胞瘤综合征 第 13 号染色体 DNA 片段Wilms 瘤 第 11 号染色体 DNA 片段Wolf-Hirschhorn 综合征 第 4 号染色体 DNA 片段Huntington 舞蹈病 G8通过 RFLP 连锁分析，还可进行反向遗传学的研究，即寻找那些目前尚未获得的致病基因的 DNA 序列及其基因产物。某些遗传病的致病基因（进而正常基因）就是通
17、过这个途径被揭示出来的，如 DMD/BMD、囊性纤维变。PCR/ASO 分析方法与 RFLP 连锁分析比较，它具有直接、简化、快速、不需家系分析、用材少等优点，更适用于产前基因诊断。但要对一种遗传病的诊断达到如此的地步，要经过一段漫长而曲折的路。对于遗传病的基因分析，总是先从临床家系分析入手，了解它的遗传规律，通过与其他遗传标志的连锁关系或伴随发生的染色体缺陷，进行基因的染色体定位，再从染色体基因图上寻找合适的连锁的 RFLP 探针，进行染色体步行（chromosome walking）或染色体跳跃（chromosome jumping），获得新的连锁更紧密的 RFLP探针，最后获得基因 DN
18、A 片段本身。随后再进行 DNA 或相应的 cDNA 序列分析，明确基因的细微结构及突变基因的致病突变细节，到此才有可能合成相应的 PCR 引物和 ASO 探针（或者监测基因内或近旁的 RFLP位点用的 PCR 引物及探针）。才有可能简化基因分析的程序。三、血友病的产前基因诊断举例血友病是遗传性凝血疾患中最为常见的一种，是由凝血因子的缺陷引起的。为 X-连锁隐性遗传。根据因子缺陷的类型不同，血友病主要有甲、乙两型。甲型血友病系由血浆中凝血因子（F）活性缺陷所致，约占全部遗传性凝血疾病的 75%。乙型血友病是因凝血因子（F）缺陷所致，发病率约为甲型的 20%。也有 F、F同时缺陷的，但不常见，称
19、为甲乙混合型血友病。1.血友病甲的临床表现 血友病甲又称经典型血友病，发病率约为 1/10 000 男性。女性患者极为少见。血友病患者多有家族史，新生突变者大约占 20%30%。甲型血友病临床表现为凝血困难及自发性出血倾向，如频发的关节及软组织出血，以大关节、下肢关节及其附带肌群出血为常见。患者发病早，自儿童期即有表现，出血频度及严重程度与血浆中 F活性水平相平行，50%患者血浆 F活性水平仅为正常人的 1%5%，临床表现较严重。其余患者的 F活性浮动于正常值的 5%20%之间，表现较轻。有些患者，其 F水平可达正常的 25%50%，几乎没有临床症状，只是在外伤或手术时才发现有凝血障碍。这种异
20、质性可能与基因的缺陷类型不同有关。对于血友病的治疗主要靠输血疗法。长期反复的输入全血或凝血因子，经济上是一笔可观的负担；同时输血反应也是不可忽视的副作用，如免疫反应、特别是目前引人注目的血源性病毒感染如 AIDS、乙肝等疾病。此外边远地区有限的医疗条件或突发无援的创伤所造成的对生命的威胁，亦使人们去寻找新的有效途径来施行产前基因诊断，配合选择性人工流产以控制患儿出生。曾经采用血液学和免疫生物学指标进行患者诊断、携带者的检出，及应用胎儿镜采集胎儿血进行 F的分析进行产前诊断。但这些方法或是准确性差或是取血风险大，已经被淘汰。1984 年，国际上首次报告了应用 DNA RFLPs 分析方法进行甲型
21、血友病的基因诊断。此法除可进行胎儿的产前基因诊断外还可进行基因携带者的监测，风险小、准确率高，因此迅速被人们广泛采用。2.凝血因子的基因缺陷 F基因位于 Xq28，在 Deuteran 色盲基因和 G6PD 基因附近。F基因全长约 186kb,由 26 个外显子和 25个内含子组成。其外显子长度从 69bp 到 310bp 不等，内含子长度变化于 207bp32.4kb 之间。F mRNA约长 9kb,cDNA 长 9 009bp,5非翻译区长 150bp，3非翻译区长 1 806bp。产物由 2 351 个氨基酸组成，N 端 19 个氨基酸为信号肽。成熟的 F含 2 332 个氨基酸，分子量
22、为 264 763。分子可分成三个不同的结构域（A，B，C）：A1-A2-B-A3-Cl-C2。因子活化时，B 结构被水解。通过 DNA 序列分析，发现了不同类型的点突变（表 5），这些突变基因的产物可能是不完整的、无活性的或不稳定的 F肽链，因而临床表现为轻重不一。表 5 F基因的点突变类型 mRNA 加工信号突变IVS-2 CT,TCIVS-25 AG无义突变1 941 ArgTerm CGAUGA2 209 ArgTerm GGAUGA2 166 ArgTerm UGA2 307 ArgTerm UGA错义突变291 GluGly GAAGGA2 228 ArgGln CGACAA此外还
23、有些致病基因是基因片段缺失的结果但是大部分甲型血友病基因的突变细节仍不清楚，对这些基因的产前诊断只能靠 RFLPs 连锁分析。3.甲型血友病的产前基因诊断 应用印迹杂交技术进行 RFLPs 连锁分析 在 F基因内及其旁侧有多组 RFLPs 位点可供产前诊断（表 6）。国内沈岩等人应用一系列探针（表 7）对中国人 F基因进行了 RFLPs 分析（表 8），发现了一组新的Stl4/Bct多态性位点，并成功地进行了甲型血友病的产前基因诊断。表 6 F基因内及其旁侧的 RFLPs 限制酶 位点 探针 片段长度（kb）及频率Bcl e18 P114.12 0.88(0.71)/1.77(0.29)Bgl
24、 e26 P1.8 5(0.74)/20(0.26)Hind IVS-19 2.6(0.30)/2.7(0.70)Msp e26 下游 7.5(0.68)/4.3+3.2(0.32)Xba IVS-19 P482.6 4.8(0.59)/9.6(0.41)Bgl DXS15 DX13 2.8(0.5)/5.8(0.5)Taq DXS52 St14-1 6.6(0.005)/5.4,5.2(0.045)4.8(0.12)/4.5(0.36)/4.1,4.0(0.205)3.9(1.105)/3.6(0.005)/3.4(0.155)表 7 进行甲型血友病基因分析所用的探针 质粒名称 抗性 宿主菌
25、 载体 插入位点 插入片段（kb） 探针片段长度（kb）p114.12 Amp JM 101 pUC12 Stu/Sac 0.65 BamH/Sac 0.65p482.6 Amp HB 101 pUC8 EcoR 9.6 EcoR/Sac 1.1St14-1 Amp,Tet HB 101 pBR322 EcoR 3.0 EcoR 3.0DX13 Amp HB 101 pSP64 EcoR 2.2 EcoR 2.214-E18 Amp JM 101 pUC18 Sma/Hinc 0.65/0.8 EcoR/Hind 1.45pY3.4 Amp,Tet HB 101 pBR322 EcoR 3.4
26、 EcoR 3.4表 8 中国人 F基因内及其旁侧 RFLPs 位点 探针 限制酶 RFLPs(kb) PIC外显子 18 p114.12 Bcl 1.2(0.25)/0.9(0.75) 0.38内含子 22 p482.6 Xba 9.6(0.44)/4.8(0.56) 049DXS52 St14-1 Bcl 4.0(0.09)/3.3(0.12)/3.0(0.44)/2.3(0.35) 0.66Taq 6.6(0.01)/5.3(0.12) 4.8(0.17)/4.5(0.06)/4.1,4.0(0.02) 3.9(0.15)/3.3(0.31) 3.0(0.44)/2.3(0.35) 0.
27、81DXS15 DX13 Bgl 5.8(0.19)/2.8(0.8) 0.31在中国人中，F基因内部的 RFLPs 与国外的报道基本一致，而基因外 RFLPs 则有很大差异如白种人中DX13 位点 Bgl的频率为 0.5，而中国人高达 0.81；欧美人群的 St14/Taq片段 4.5kb 和 4.1kb 出现频率较高，而 3.6kb 较低，在中国人中正好相反。说明结构基因内多态性位点具有较高的保守性，而基因外DNA 序列变异较大，存在着群体差异。因此在应用 RFLPs 进行连锁分析时，应注意本民族本地区人群的RFLPs 特点。此外，在进行 RFLPs 连锁分析诊断血友病时，应该遵循以下三点
28、：其一，首先确定携带者的基因型，寻找杂合的 RFLPs 位点。优先选择 PIC 值高的位点进行监测。如Bcl/St14,在中国人群中有较高的应用价值。其二，尽量选择基因内的位点探针，避免因染色体重组造成错误判断。其三，用 Y3.4 探针确定胎儿的性别。应用 PCR 技术监测限制酶多态性位点 在产前诊断中常常碰到 DNA 样品不足的困难，而且还有同位素的限制。用 PCR 技术将包含我们要监测的多态性位点的一段 DNA 片段扩增出来，然后用识别该位点的限制酶来酶解扩增的 DNA 片段，电泳后直接监测多态性位点的状态。在血友病的产前诊断中已经成功地应用了这项技术。常用的两对引物（表 9）扩增的 DN
29、A 片段在 FV基因内，分别包含着限制酶 Xba和 Bcl的识别序列，长 96bp 与 142bp。酶切位点存在时，扩增片段被分解成两个小片段，前者变成 68bp，后者为 99bp，聚丙烯酰胺电泳能鉴别它们。当然我们也可用寡核苷酸探针（表 10）杂交的方法，来监测位点是否存在。表 9 用于甲型血友病产前诊断的 PCR 引物 位 点 引 物 Tm 值（）i22/ba 7.1 5-CACGAGCTCTCCATCTGAACATG 707.10 5-GGGCTGCAGGGGGGGGGGACAACAG 88e18/Bcl 8.1 5-TAAAAGCTTTAAATGGTCTAGGC 608.2 5-TTC
30、GAATTCTGAAATTATCTTGTTC 64Y 染色体 Y1 5-ATGATGGAACGGAAATATG 52Y2 5-AGTAGAATGCAAAGGGGCC 50表 10 监测位点多态性的寡核苷酸探针 位 点 探针序列 Tm（） 洗脱温度（）Xba/i22 7.3 5-GCGCATTTCTAGACTGTTG 56 577.4 5-GCGCATTTCTGGACTGTTG 58 59Bcl/e18 8.3 5-CAATCAGTGATCAAAGCAG 54 548.4 5-CAATCAGTGAACAAAGCAG 54 56在明确了孕妇位点多态性状态以后，就可应用此途径快速 、灵敏、准确地进行产前诊断。若扩增时加入Y 染色体特异的扩增引物，确定胎儿的性别，则更好。
