1、消毒与灭菌效果的评价方法与标准中华人民共和国国家标准消毒与灭菌效果的评价方法与标准第一篇 压力蒸汽灭菌效果评价方法与标准1 主题内容与适用范围本方法规定了压力蒸汽灭菌技术标准及其评价灭菌效果的检测方法。本方法适用于对压力蒸汽灭菌设备灭菌效果的评价。2 试剂本标准所用试剂，凡未说明规格者，均为分析纯（AR） ，水为蒸馏水。2.1 蛋白胨2.2 葡萄糖2.3 溴甲酚紫酒精：取溴甲酚紫 2.0g，溶于 100mL95%乙醇中。2.4 溴甲酚紫蛋白胨水培养基配制：蛋白胨 10.0g，葡萄糖5.0g，溶于 100mL蒸馏水中，调 pH值至 7.07.2，然后再加 2%溴甲酚紫酒精溶液 0.6mL，摇匀后
2、，按 5mL/管，分装包口，置压力蒸汽灭菌器中，于 115灭菌 40min后备用。3 指示菌嗜热脂肪杆菌芽胞（ATCC7593 或 SSI K31）菌片，含菌量为51055106cfu/片，121下，杀灭 90%微生物所需时间 D121值为 1.31.9min，杀灭时间（KT 值）为19min，存活时间（ST 值）为3.9min。4 化学指示剂需用卫生部批准的化学指示剂。5 技术要求压力蒸汽灭菌器 压力,Mpa/cm2 温度, 灭菌时间,min下排气式 0.070 115 400.105 121 30预真空式 0.210 134 466 检测方法6.1 生物学指标（用作压力蒸汽灭菌效果的依据）
3、 。6.1.1 将嗜热脂肪杆菌芽胞菌片两个分别放入灭菌小纸袋内，置于标准试验包中心部位。6.1.2 灭菌柜室内，上、中层中央和排气口处各放置一个标准试验包（由 3件平纹长袖手术衣，4 块小手术巾，2 块中手术巾，1 块手术巾，30 块 10cm10cm、8 层纱布敷料包裹成25cm30cm30cm大小） 。手提压力蒸汽灭菌试管内（试管口用灭菌牛皮纸包封） ，将盒平放手提压力蒸汽灭菌器底部。6.1.3 经一个灭菌周期后，在无菌条件下，取出标准试验包或通气贮物盒中的指示菌片，投入溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基中，56培养 48h，观察培养基颜色变化。6.2 化学指标在物品包外用化学指示胶带，可作为物
4、品是否经过灭菌的处理标志。在物品包内中心部位用化学指示剂，可作为物品是否灭菌的参考标志。7 结果判定及评价7.1 同次检测中，标准试验包或通气贮物盒内，每个指标菌片接种的溴甲酚紫蛋白胨水培养基全部不变色，判定为灭菌合格。指示菌片之一接种的溴甲酚紫蛋白胨水培养基由紫色变为黄色时，判定为灭菌不合格。7.2 化学指示剂的颜色变为与灭菌合格准色相同时，或熔化时作为灭菌合格的参考标准。第二章 紫外线表面消毒效果评价方法与标准8 主题内容与适用范围本方法规定了物体表面消毒用紫外线的波长、强度及评价其消毒效果的物理学指标和生物学检测方法。本方法适用于紫外线直接照射到的物体表面消毒效果评价。9 指示菌9.1
5、大肠杆菌（8099 或 ATCC25922） 。9.2 枯草杆菌黑色变种芽胞（ATCC9372） 。10 物理学指标10.1 在电压 220V时，普通 30W直管型紫外线灯，在室温为2025的使用情况下，253.7nm 紫外线辐射强度（垂直 1m处）应70W/cm2。10.2 在电压 220V时，高强度紫外线灯，在室温为 2025的使用情况下，253.7nm 紫外线辐射强度（垂直 1m处）应200W/cm2。10.3 照射剂量按式（1）计算：剂量（Ws/cm2）= 强度(W/cm2)时间（s） （1）11 物理学检测方法11.1 物理学检测方法11.1.1 灯管的紫外线强度(W/cm2)用中心
6、波长为 253.7nm的紫外线强度测定仪（标定有效期内） ，在灯管垂直位置 1m测定。11.1.2 在实际应用中消毒表面的照射强度应以灯管与消毒对象的实际距离测定。11.1.3 表面消毒接受的照射剂量，应达杀灭目标微生物所需。对大肠杆菌，照射剂量应达到 20，000W/cm2，对枯草杆菌黑色变种芽胞应达到 100000W/cm2。11.2 生物学检测方法11.2.1 采用载体定量消毒试验。载体制备按本标准附录 C进行。11.2.2 开启紫外线灯 5min后，将 8个染菌玻片平放于灭菌器皿中，水平放于适当距离照射，于 4个不同间隔时间各取出 2个染菌玻片，分别投入 2个盛有 5mL洗脱液（1%吐
7、温 80，1%蛋白胨生理盐水）试管中，振打 80次。11.2.3 经适当稀释后，取 0.5mL洗脱液，作平板倾注，每个染菌玻片接种两个，放 37培养 48h作活菌计数。11.2.4 阳性对照，除不作照射处理外，取 2个染菌玻片分别投入2个盛有 5mL洗脱液中振打 80次，余按 4.2.3进行。11.2.5 计算杀灭率12 判定标准12.1 对指示菌杀灭菌99.9%判为消毒合格。12.2 达物理学检测标准时，作为消毒合格的参考标准。第三篇 液体消毒剂消毒效果评价方法与标准13 主题内容与适用范围本方法具体规定消毒剂消毒效果生物学检测方法及其评价标准。本方法适用于消毒剂对各种物体的消毒效果评价。1
8、4 理化指标将消毒剂置 202水浴中，测定在使用浓度下杀灭指示微生物达互消毒或灭菌所需的最短时间（min） 。15 指示微生物15.1 细菌15.1.1 细菌繁殖体：金黄色葡萄球菌（ATCC 6538） 、大肠杆菌(8099或 ATCC 25922)。15.1.2 细菌芽胞：枯草杆菌黑色变种芽胞（ATCC 9732） 。15.2 真菌：白色念珠菌（ATCC 10231） 。15.3 乙型肝炎表面抗原：纯化抗原（1.0mg/mL） 。16 检测方法16.1 中和试验（见附录 A） 。16.2 消毒剂定性消毒试验（见附录 B） 。16.3 消毒剂定量消毒试验（见附录 C） 。16.4 消毒剂杀菌能
9、量试验（见附录 D） 。16.5 乙型肝炎表面抗原（HBsAg）抗原性破坏试验（见附录 E） 。17 消毒效果评价标准17.1 对细菌和真菌的杀灭率99.9%，对 HBsAg，将检测方法灵敏度 104倍或 5104倍（载体试验）的 HBsAg抗原性破坏，可判为消毒合格。17.2 对枯草杆菌黑色变种芽胞全部杀灭，可判为灭菌合格。17.3 在实际应用中消毒效果评价以有机物保护试验的最低浓度和最短时间为该消毒剂达到实用消毒所需的浓度和时间。附录 A中和剂中和效果试验（补充件）A1 内容提要为了准确评价消毒剂对微生物的杀灭作用，消毒试验中要求选择适当中和剂。所选中和剂不仅能及时中止消毒剂的杀微生物作用
10、，且中和剂本身及其与消毒剂的反应产物（下称中和产物）尚需对微生物无抑制或杀灭作用，对培养基本不良影响。A2 培养基和试剂A2.1 营养琼脂培养基成分：蛋白胨 10.00g牛肉膏 3.00g氯化钠 5.00g琼 脂 15.00g蒸馏水 1000.00mL制法：除琼脂外，其他成分溶解于蒸馏水中，调 pH至7.27.4，加入琼脂后加热溶解，过滤分装，经 121、压力蒸汽作用 30min，灭菌后备用。A2.2 0.03mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.27.6，下称 PBS） 。成分：磷酸氢二纳 2.84g磷酸二氢钾 1.36g蒸馏水 1000.00mL制法：将磷酸氢二钠与磷酸二氢钾溶解于蒸馏于水中，p
11、H 值为7.27.4，分装，经 121、30min 压力蒸汽灭菌后备用。A3 器材A3.1 锥形烧瓶A3.2 子平皿（直径 9cm） 。A3.3 量筒。A3.4 精密 pH试纸。A3.5 无菌试管。A3.6 无菌刻度吸管（1.0,5.0,10.mL)。A3.7 恒温培养箱。A3.8 冰箱。A3.9 菌落计数器。A3.10 酒精灯。A4 中和剂（注明生产厂家，批号）A5 操作方法A5.1 用 PBS将指示菌制成 51055105cfu/mL悬液。A5.2 将消毒剂用灭菌蒸馏水配制成 3种不同浓度，在不加中和剂的情况下，测知该消毒剂 10min抑杀指示菌 99.9%以上的最低有效浓度。A5.3 取
12、消毒剂 10min抑杀指示菌的最低有效浓度与待选择中和剂进行试验，选出中和剂种类并依据等当量中和原则，调整中和剂浓度，选出试验浓度的消毒剂使用中和剂和浓度。A5.4 中和剂选择试验时，先将消毒剂 1.0mL与中和剂溶液 9.0mL混合，制成中和产物溶液，再按表 A1分组进行。表 A1 中和剂选择试验组号 0.5mL菌液加于： 混匀作用 10min 取 0.5mL混匀液加入：(加入后总量为 5mL)作用 10min后，取原液或稀释液 0.5mL接种平板（2 个/样本）：1 消毒剂 4.5mL PBS4.5mL 原液，102 消毒剂 4.5mL 中和剂 4.5mL原液，103 中和产物 4.5mL
13、 PBS4.5mL 100，10004 PBS4.5mL PBS4.5mL 100，10005 中和剂 4.5mL PBS4.5mL 100，10006 PBS5.0mL 原液然后，倾注平板置 37培养 48h，计数菌落数，按衡释倍数计算出回收菌数(cfu/mL)。A6 中和试验结果报告方法（如表 A2）表 A2中和试验结果举例中和剂 各组回收菌落数，cfu/mL 3、4、5 组间误差率,%1 2 3 4 5 61%卵磷脂1%卵磷脂0.1%吐温 801%吐温 800.5%硫代硫酸钠 0 708 4.67106 4.83106 4.11106 0 794 5.81106 5.89106 5.78
14、106 0 194 3.31106 5.31106 5.21106 0 132 3.20106 5.03106 5.18106 6.270.7218.1718.94 3、4、5 组间误差率计算公式A7 判定标准A7.1 3、4、5 组菌数相似，其误差率10%。A7.2 6 组无菌生长。A7.3 2 组菌数明显少于 3、4、5 组。A7.4 1 组不长菌或明显少于 2组。符合上述标准的中和剂表明可消除消毒剂对指示菌的作用，中和剂及其与消毒剂的中和产物对指示菌无毒害，判定为该消毒剂的中和剂。A8 消毒试验用中和剂浓度的选择按 A5.4步骤进行，按 A7.17.4的标准判定。附录 B消毒剂定性消毒试
15、验（补充件）B1 内容提要定性消毒试验是测定受消毒因子作用后的样本有无细菌生长的试验方法。用于对消毒因子灭菌效果的鉴定和消毒剂杀灭菌效果的初步评价。B2 培养基与试剂B2.1 普通肉汤培养基B2.1.1 成份：蛋白胨 10.00g氯化钠 5.00g肉浸液 1000.00mLB2.1.2 制法：取蛋白胨、氯化钠加入肉浸液内，微温溶解，调节pH至弱碱性，煮沸、滤清，调节 pH使灭菌后为 7.27.4，压力蒸汽灭菌备用。B2.2 试剂B2.2.1 稀释液：含 1%蛋白胨的 0.03mol/L PBS （pH 7.27.4） 。B2.2.2 灭菌蒸馏水。B2.2.3 中和剂：按本标准附录 A选择。B3 器材B3.1 灭菌刻度
