1、常用的基因突变和多态分析技术,各种检测突变方法的相对灵明度,基因突变与检测方法的选用,基因异常 方 法 探针、引物或限制酶基因缺失 Southern杂交 缺失基因的探针PCR分析 引物包括缺失或在缺失部位内 点突变 RFLP分析 突变导致其切点消失的限制酶ASO杂交 正常和异常的ASO探针PCR分析 引物包括突变部位（RFLP,SSCP) 基因已知但异常不明 基因内或旁侧序列 基因内或旁侧序列探针或引物多态性（RFLP,AMP-FLP)连锁分析 基因未知 与疾病连锁的多态性， 与疾病连锁的多态位点探如AMP-FLP连锁分析 针或引物RFLP位点单体型连锁分析,等位基因特异的寡核苷酸探针诊断,当
2、基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成标记32P的等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide, ASO）来进行诊断。探针通常为20个碱基左右的核苷酸包括了突变位点在内。用于探测点突变时一般需要合成两种探针，一种与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与正常基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交。这样，使当地调整杂交条件，使只有探针与待测DNA完全一致时才能稳定地杂交结合。就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来。,Add radio-labeled normal DNA pr
3、obes,Amplify DNA and hybridize to membranes,Allele Specific Oligonucleotide (ASO) Hybridization,Add known mutant DNA probes,Patients,#1,#2,#3,#1,#2,#3,10kb,4kb,BamH,BamH,5,3,5,3(),5,3(-),/ /- /- -/- -/-,14kb,10kb,地贫基因缺失的诊断 左图示16染色体上携带有数目不同的基因，箭头示BamHI的切点；由图为用基因探针杂交的结果。,缺失的检测,外显子 bp N P,Pm 535,3 4104
4、3 357,50 27113 238,6 20247 181,60 13952 113,DMD基因缺失的多重PCR诊断。共采用9对引物，可见患者(P)有电泳带的缺失。Pm为启动子,荧光原位杂交（FISH）,基因组探针的分离,利用原位杂交的方法进行基因定位,IVS-,IVS-, ,Mst部位 1.15kb,1.15kb,1.35kb,正常1.15kb,镰变1.35kb,正常 镰状性状 镰状贫血,1.15kb,1.35kb,镰状贫血的基因诊断,Linkage Analysis,Looks for pattern of DNA markers near gene of interest that s
5、egregate with disease Requires DNA analysis of multiple family members,1, 2,3, 4,1, 3,1, 4,2, 3,2, 4,1 2 3 4,1,2,1,2,3,4,5,kb,5.7,3.4,2.3,成人型多囊肾病的连锁分析,单链构象多态性诊断法,单链构象多态性（single strand conformation polymorphism, SSCP）是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异。这种差异将是相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同，从而可用于靶序列DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或插入的检测。用
6、SSCP法检测基因的点突变时，通常在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增，然后将扩增产物用甲酰胺等变性，并在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而可据之作出诊断。 PCR-SSCP法具有能快速、灵敏地检测有无突变或多态性的优点，但如与阐明突变的碱基性质，则需作进一步的序列分析。,Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP),DNA,Gel,Normal,Mutated,mutation,DNA is denatured into single strands Single strands fold; shape is altered by mutations Mobility of mutant and normal strands differ in gel,Protein Truncation Assay （蛋白质截短检测）,DNA transcribed to mRNA RNA translated to protein Protein run on gel Truncated protein has different mobility in gel,DNA,mRNA,Protein,Gel,Normal,Mutated,mutation,
