1、三萜皂苷类成分质量分析研究,一三萜皂苷的研究概况,三萜皂甙是由六个异戊二烯以头尾相接或尾尾相接而组成，一般由含30个碳原子。按其皂甙元，可将三萜皂甙分为五环三萜(pentacylic triterpennoids)和四环三萜(tetracylic triterpennoids)两大类。五环三萜皂甙数目较多，又可分为七种类型：齐墩果烷(oleanane)型、羽扇豆烷(ursane)型、木栓烷(lupane)型、异B-香树脂醇(iso-B-amyrin)型、羊齿烷(fernane)和异羊齿烷(isofernane)型、何帕烷(hopane)和异何帕烷(isohopane)型。四环三萜皂甙除含有C3
2、0外，也有C31或C32的衍生物，主要有四种类型：达玛烷(dammarane)型、羊毛脂烷(lanostane)型、大戟烷(euphane)型、葫芦烷(cucurbitane)型。,三萜皂甙在植物界有较广泛的分布，据报道在104科1730种植物中，含有皂甙的植物就约有79 科860 种，其中含有三萜皂甙的植物就约有627 种。三萜皂甙在双子叶植物中分布较为普遍，较多种的科有五加科、伞形科、夹竹桃科、菊科、石竹科、葫芦科、大戟科、豆科、桃金娘科、远志科、毛莨科、蔷嶶科、茜草科等；单子叶植物含三萜皂甙的植物较少见，仅见于禾本科的少数属；裸子植物及低等植物中也较少含有这类皂甙；另外在海洋生物如海参、
3、海星、海盘车等中亦有存在。,许多常见中药中含三萜皂甙，如人参、三七、甘草、西洋参、地榆、款冬花、酸枣仁、紫菀、桔梗、柴胡、远志、黄芪、威灵仙、商陆、白头翁等。皂甙类成分具多种生理活性，如刺激黏膜，已往常用作祛痰药，如桔梗、远志、紫菀中的皂甙等。经研究发现三萜皂甙还具有促进核酸蛋白质合成和胆固醇脂代谢、抗炎、抗菌、抑制肿瘤、抗溃疡、兴奋或抑制中枢神经、抑制胃液分泌以及杀死精子、软体动物等作用。,目前对天然药物的抗衰老作用，多从其对免疫功能、神经系统、内分泌系统、物质代谢、抗衰老自由基、延长细胞和动物的寿命、抗肿瘤、强壮、延长生长期等方面的作用来评价。而不少皂甙具有上述作用，特别是三萜皂甙的活性更
4、显著。如人参、西洋参、三七和绞股蓝等是常见具抗衰老作用的天然药物。它们均富含三萜类达玛烷型皂甙。,达玛烷型皂甙除了上述活性外，在血压、血糖等项指标上，还具有明显的双向调节作用。这一种特性对抗衰老药物来说颇为有益的，它可使发病失去某种平衡的机体恢复新的动态平衡，所以这类成分的研究倍受关注。另外报道在约6科28种植物含有达玛烷型皂甙，从中寻找出有效的抗衰老药物是完全可能的。,二三萜皂苷抗衰老作用,A. 人参皂苷 1. 有网状内皮系统吞噬功能激活效果；对特异性和非特异性免疫功能有刺激作用。 2. 可提高小鼠对常压、低压缺氧的耐力，并可延长常温、高温负荷下游泳时间。 3. 有中枢兴奋作用，能激发人学习
5、和记忆能力，增减智力和操作能力。 4. 具有兴奋垂体-肾上腺皮质功能的作用,5. 有性腺激素样作用；有雄性激素样作用，能使小鼠精囊腺增重。 6. 能促进DNA、RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，使白蛋白和丙种球蛋白的含量增加。 7. 对肾上腺素高血糖的抑制作用较强。并显示对动物血糖水平有双向调节作用。 8. 可明显抑制中、老年大、小鼠的脂质过氧化作用。可延长细胞生长天数。,B. 三七皂苷,1. 可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数。 2. 对未成年小鼠体重增加有明显促进作用；可增强小鼠耐高、低温能力。 3. 能显著降低老年大鼠脑组织脂褐质及血清过氧化脂质总含量。 4. 有雄性激素样作用，能
6、使小鼠精囊腺增重。 5. 有促进小鼠肝、肾DNA及血清蛋白质合成的作用。 6. 可明显抑制中、老年大、小鼠的脂质过氧化作用。 7. 总皂苷抗血栓。,C. 西洋参皂苷,1. 能降低ACTH引起的小鼠胸腺及脾脏的萎缩。2. 可增强机体对缺氧的耐受力，延长小鼠负重游泳时间。,D 绞股蓝皂苷,1. 能明显提高小鼠游泳的体力和耐力，并咳提高常压缺氧的耐受力。 2. 能促进小鼠生长发育，增强小鼠耐高温、抗疲劳的作用。 3. 能预防地塞米松引起的肾上腺皮质激素、血浆皮质醇减少。 4. 可预防地塞米松引起的胸腺萎缩。 5. 对喂高蔗糖、高脂的大鼠所致的高脂血症有效。 6. 能增加自由基损伤模型大鼠和老年大鼠红
7、细胞中SOD的活力。 7. 对肝、子宫、肺等癌细胞增生的抑制率为20%-80%；对S180有明显的抑制作用。,E 黄芪皂苷,1. 黄芪甲苷有促进B细胞增生、分化和浆细胞抗体合成作用。2. 黄芪甲苷、绵毛黄芪苷均可对抗CCl4所致的小鼠死亡；使小鼠红细胞内SOD活性升高。,三. 三萜皂苷的主要含量分析方法,中药及其制剂中三萜皂苷的含量分析可分为:总皂苷测定皂苷元测定单体皂苷测定,总皂苷测定：1. 提取：一般需要适当的溶剂提取。由于皂苷在极性溶剂中溶解度较大，提取溶剂可为各种浓度的甲醇、乙醇和异丙醇、丁醇、戊醇。2. 精制：水饱和的正丁醇萃取；大孔树脂处理后溶剂洗脱。3. 测定：最常用的方法为比色
8、法，也有用重量法的。,皂苷元测定：提取：1先用上述方法得到总皂苷，再加酸（如硫酸、盐酸）加热水解，得皂苷元。 2将样品先行水解，再用有机溶剂从水解的混合液中提取皂苷元。测定：主要有薄层色谱法、高效液相色谱法和比色法。单体皂苷测定：主要为薄层色谱法和高效液相色谱法。,(一) 比色法,皂苷类成分多无色，且常无紫外吸收。 含量测定时常需显色，产生颜色-于可见光区比色测定在紫外光区产生吸收-用紫外分光光度法测定。 皂苷类成分的颜色反应的专属性虽较差，但反应比较灵敏，方法简便，易行。,常用的显色剂有：浓硫酸高氯酸硫酸-醋酐、硫酸-醋酐-冰醋酸或硫酸-冰醋酸芳香醛-硫酸或芳香醛-高氯酸其它试剂：对-二甲氨
9、基苯甲醛，亚甲蓝等,(二) 薄层色谱法,1. 薄层条件 (1) 吸附剂：硅胶，氧化铝 (2) 展开剂：皂苷；皂苷元 (3) 显色剂：25%磷钼酸乙醇溶液硫酸：甲醇（1：1）氯磺酸：醋酸（1：2）碘蒸气,2. 含量测定方法： (1) 薄层-比色法人参皂苷元的薄层-比色法测定标准曲线：对照品为人参皂苷元（人参二醇、人参三醇、齐墩果酸），加5%香草醛-冰醋酸、高氯酸；再加醋酸，在560nm测定，做三条标准曲线样品测定：硅胶G，条状点样；氯仿-甲醇-水(60:42:11碘蒸气显色；刮取斑点范围硅胶，显色测定。测定三组皂苷的吸收度，分别于标准曲线中查得相应数值，乘以2.5、1.77与2.1倍，计算各组皂
10、苷含量,(2) 薄层扫描法A.人参单体皂苷薄层扫描法测定 样品制备：甲醇，冷浸-热回流 对照：人参皂苷Ro、Rb1、Rb2、RC、Rd、Re、Rg1、Rg2 扫描条件：s=525nm，R=760nm；投射法线性 样品测定：GF254板，显色剂为10%硫酸，115，10min氯仿-甲醇-水（13:7:2）测定Ro、Rb1、Rg1、Rg2正丁醇-醋酸乙酯-水（4:1:1）测定Rb2、RC、Rd、Re,B.三七中皂苷薄层扫描法测定对照品：三七皂苷C1、D1、D2、E 扫描条件：s=525nm，R=700nm；反射法线性 样品测定：硅胶G板，显色剂为碳酸氢钠-无水乙醇展开剂为1，2-二氯乙烷-正丁醇-
11、甲醇-水（30:40:15:25，下层）,(三) 高效液相色谱法,关键问题是测定条件和流动相的选择。 1. 测定条件选择 多无共轭体系（少数除外），通常利用末端吸收作为测定波长。 也可用示差折光检测器； 新近用蒸发光散射检测器（Evaporative light scattering detector，ELSD）,蒸发光散射检测器（ELSD）是一种通用型检测器，流动相由热气流使之热气化喷雾，再进入加热管，溶剂在此挥发。所得分析检测的物质颗粒通过一狭窄光束散射光，由光电倍增管收集。ELSD的响应取决于被分析物质颗粒的数量和大小。由于ELSD仅对不挥发被分析物质产生响应，即使是在梯度洗脱时也能提供
12、平稳的基线。 ELSD已成功用于皂甙、生物碱、萜类内酯、氨基酸和糖类等分析。是分析无紫外吸收及紫外吸收弱成分的有力工具。,2. 流动相的选择皂苷类成分多用反相色谱柱。常用流动相有乙腈、甲醇、纯水等。 对溶剂要求较高，最好是色谱醇。,四. 三萜皂苷的质量分析研究,(一) 三七中三萜皂苷的定量分析 三七为五加科植物三七Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen的干燥根。功能散瘀止血，消肿定痛。 现代药理研究证明，三七中皂甙类成分为其活性成分。为了更好地对三七药材进行质量评价和制定更完善的控制指标，采用HPLC-ELSD对其主要皂甙人参皂甙Rg1、三七皂甙R1进行了含量测
13、定，并用紫外分光光度法测定了总皂甙的含量。,三七中皂甙类成分的含量测定可采用HPLC-UV及HPLC-RI法。前者用紫外检测器=203nm检测，因三七中皂甙类成分紫外吸收较差，受试剂影响很大，基线漂移大，使分析很难进行。后者用示差检测器，则灵敏度低，稳定性和选择性均较差。本文用ELSD检测器测定三七中主要皂甙人参皂甙Rg1的含量，因ELSD检测器为质量型检测器，且不受外部环境的干扰，试剂在检测器中全部蒸发，不干扰检测，灵敏度及稳定性均符合含量测定的要求。,A三七中总皂苷的含量测定,1供试品溶液的制备：取本品粉末约0.5g，精密称定，置索氏提取器中，加乙醚80ml，置水浴上提取2h，弃去乙醚液，
14、再加甲醇80ml提取4h，甲醇提取液蒸干，残渣加水15ml使溶解，水溶液置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取5次，每次15ml，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，定溶至50ml，作为供试品溶液。对照品溶液为人参皂甙Rg1（5mg/100ml）。,2紫外吸收光谱：仪器为岛津UV-2501pc紫外分光光度计；供试品紫外吸收曲线及最大吸收波长268nm与人参皂甙Rg1标准品完全一致,3标准曲线制备：分别精密吸取对照品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml置10ml量瓶中，置水浴中挥尽溶剂，取出，加浓硫酸0.6ml，摇匀，置80水浴中加热1h，取出，置冰浴中加95%乙醇至刻度，摇匀，在268
15、nm波长处测定吸收度。 以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。经回归统计，得标准曲线方程：A=39.6856C+0.0148，r=0.9996。 浓度在5.04-25.20g/ml范围内，与吸收度呈线性关系。,4方法学考察：回收率试验回收率为101.15%，RSD=1.44%；稳定性试验RSD为1.35%，总皂甙在3h内稳定；精密度试验RSD为1.23%；重现性试验RSD为2.56%。,表1 三七中总皂甙的含量测定序号 产地 总皂甙（%） RSD（%）1 云南文山（40头） 7.25 1.572 云南文山（90头） 6.81 3.023 云南文山（270头） 6.70 2.704 广西
16、靖西（40头） 6.44 2.025 广西靖西（60头） 5.58 1.816 西安（60头） 9.08 1.347 杭州（80头） 7.80 2.56,BHPLC-ELSD测定三七中 三七皂甙R1、人参皂甙Rg1的含量,1色谱条件：日本岛津LC-10A；法国SEDEX55型蒸发激光散射检测器（ELSD）；杭州英谱HS色谱数据工作站。色谱柱日本岛津Shim-packCLC-ODS柱（6.0mm150mm）；流动相乙腈-水（30：70）；柱温45；流速0.5ml/min；ELSD 检测器漂移管温度90；载气压力0.20mPa。在此条件下，样品中三七皂甙R1、人参皂甙Rg1与其他相关峰均能达到基线
17、分离。 2样品制备：同紫外分光光度法项下。,3标准曲线制备：分别精密吸取对照品溶液（三七皂甙R1、人参皂甙Rg1的1mg/ml 甲醇）1，2，3，4，5，6l，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积的自然对数为纵坐标，以浓度的自然对数为横坐标，绘制标准曲线， 三七皂甙R1回归方程为Y=10.677+1.584X，r=0.9998； 人参皂甙Rg1回归方程为Y=11.322+1.503X，r=0.9996。,4方法学考察： 三七皂甙R1回收率试验回收率为101.57%，RSD=1.98%；精密度试验RSD为1.72%；重现性试验RSD为2.01%。 人参皂甙Rg1回收率试验回收率为100.50%，R
18、SD=1.82%；精密度试验RSD为1.26%；重现性试验RSD为2.78%。,表2 样品中三七皂甙R1、人参皂甙Rg1含量序号 产地 三七皂甙R1 RSD 人参皂甙Rg1 RSD（%） （%） （%） （%）1 云南文山（40头） 0.99 1.78 3.04 1.662 云南文山（90头） 1.00 2.53 2.79 2.603 云南文山（270头） 0.80 0.96 2.93 2.214 广西靖西（40头） 1.11 1.71 2.47 1.915 广西靖西（60头） 0.96 0.53 2.14 2.086 西安（60头） 1.11 2.31 3.94 1.897 杭州（80头）
19、0.70 2.76 2.34 2.28,(二) 高效液相色谱蒸发激光散射检测器分析西洋参中的人参皂甙,西洋参为五加科植物西洋参（Panax quinquefolium L.）的干燥根。功能补肺阴、清火、养胃生津。西洋参含多种人参皂甙类成分。HPLC-UV法，用紫外检测器=203nm检测，因西洋参中皂甙类成分紫外吸收较差，受试剂影响较大，基线漂移大，使分析很难进行。为了更好地对西洋参药材进行质量评价和制定更完善的控制指标，采用HPLC-ELSD法测定西洋参中主要活性成分人参皂甙Rg1、Re、Rd、Rb2和Rb1的含量。,1仪器与试药： 日本岛津LC-10A高效液相色谱仪；法国SEDEX55型蒸发
20、激光散射检测器（ELSD）；杭州英谱HS色谱数据工作站。人参皂甙Rg1、Re、Rd、Rb2和Rb1对照品（中国药品生物制品检定所）。乙腈为色谱纯；异丙醇为分析纯。,2. 色谱条件: 色谱柱为德国默克LichrosorbNH2(250mm 4mm id.10m)；梯度洗脱进行分离，流动相（A）乙腈-水-异丙醇（80：20：15），（B）水按下列次序：0-20min，0%B；20-30min，线性梯度0%B至10%B；30-45min10%B。柱温25；流速1.0ml/min；ELSD检测器漂移管温度95；载气压力为0.20mPa。在此条件下，样品中人参皂甙Rg1、Re、Rd、Rb2和Rb1与其他
21、相关峰均能达到基线分离。,3供试品溶液制备：取样品粉末0.5g，精密称定，加乙醚50ml，置水浴上加热回流2h，滤过，弃去滤液，残渣加甲醇50ml，置水浴上加热2h，滤过，滤液蒸干，残渣加水25ml使溶解，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取5次，每次15ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗3次，每次15ml，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。,4. 标准曲线制备：分别精密吸取对照品溶液(人参皂甙Rg1、Re、Rd、Rb2、Rb1 1mg/ml甲醇的混合溶液。1，2，3，4，5，6l，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积的自然对数为纵坐标，以浓
22、度的自然对数为横坐标，绘制标准曲线。结果见表3。,Table3 Regression equations and correlation coefficients for ginsenosidesCompound Regression Correlation No. equation coefficient Rg1 Y=12.892+1.667X 0.9999 Re Y=13.039+1.162X 0.9995 Rd Y=12.519+1.165X 0.9995 Rb2 Y=12.352+1.291X 0.9999 Rb1 Y=13.391+1.286X 0.9998,Table4. Cont
23、ents of ginsenosides in the Radix of Panax quingquefolium Locality content(%)(n=3)Rg1 Re Rd Rb2 Rb1 Wisconsin,USA(1) 0.163 1.006 0.257 0.091 1.247 Wisconsin,USA(2) 0.140 1.111 0.239 0.084 1.385 Wisconsin,USA(3) 0.084 0.931 0.197 0.360 1.291 Wisconsin,USA(4) 0.105 1.601 0.441 0.222 4.042 Hebei Pingqu
24、an 0.456 1.625 0.697 0.161 1.722 Hebei Zanhuang 0.658 0.115 0.701 0.132 1.761 Beijing Huairou 0.126 1.128 0.412 0.185 3.420 Jilin Fusong 0.160 0.415 0.105 0.075 0.966 Liaoniang 0.411 1.651 0.482 0.125 1.704,(三) HPLC-ELSD法测定黄芪及其制剂中黄芪皂苷的含量,黄芪为我国常用中药之一，我国药典中收载的含黄芪的中成药有20种。目前关于黄芪皂苷的含量测定多采用比色法、薄层扫描法、HPLC
25、-UV法、HPLC-示差折光检测器法，但由于黄芪皂苷的多样性，且仅在200nm左右有微弱吸收，因而干扰大，灵敏度低。ELSD为通用型质量检测器，对无紫外吸收的皂苷类化合物灵敏度高，结果可靠，可作为药材及其制剂品质评价的依据。黄芪甲苷常作为指标性成分用于黄芪的质量监控，在预处理过程中通常以氨试液洗涤，所得结果远大于未用氨试液处理者，但其余皂苷不易检测，本文在不以氨试液处理的前提下，对其中黄芪皂苷（即黄芪甲苷）、的含量进行了测定。,1仪器与试药：Shimadzu LC-6A高效液相色谱仪；法国SEDEX55型蒸发光散射检测器；HS色谱数据工作站VER3.51(杭州英谱科技开发有限公司)；黄芪甲苷对
26、照品（中国药品生物制品检定所）；黄芪皂苷、对照品由江苏药物所曹正中研究员惠赠；黄芪饮片购自南京药业股份有限公司，产地山西；黄芪注射液（成都地奥九泓制药厂，批号0002038）；黄芪样品由本校植物资源与环境教研室与标本馆提供。,2色谱柱条件：shim-pack ODS柱(150mm6mm）；流动相：乙腈:水（36:64）；流速：0.8ml/min；柱压：50kg/m2；进样量：10l；ELSD参数：漂移管温度为90，氮气流速1.5bar。,3样品溶液的制备：黄芪药材粉碎为粗粉，精密称取约2g，以甲醇80ml索氏提取完全，减压回收至干，残渣以约10ml水溶解，置分液漏斗中，以水饱和的正丁醇萃取4次
27、，每次20ml，合并正丁醇萃取液，以正丁醇饱和的水洗涤2次，每次20ml，弃去水层，萃取液水浴蒸干，以甲醇定容为5ml，过微孔滤膜，作为样品溶液。注射液样品溶液制备：精密吸取注射液10ml，余按样品制备项下“置分液漏斗”操作。,4线性关系： 精密称取黄芪皂苷、对照品，加甲醇制成分别为0.1984mg/ml,0.0804mg/ml,0.1384mg/ml的混合对照品溶液，精密吸取混合对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，以甲醇定容到1ml容量瓶中，进样10l，以对照品峰面积的常用对数值为纵坐标，以进样量（mg）的常用对数值为横坐标，,得回归方程分别为 Y=9.2809+1
28、.2077X r=0.9990； 线性范围为：0.1984-1.984g Y=8.7056+1.0672X r=0.9991； 线性范围为：0.0804-0.804g Y=7.8645+0.8853X r=0.9992； 线性范围为：0.1384-1.384g,表5：黄芪中黄芪皂苷、含量测定样品产地 含量（%） 黄芪内蒙满洲里 0.04094 0.006704 未检出 黄芪黑龙江 0.01091 0.008415 未检出 蒙古黄芪山西浑源 0.008182 0.001742 0.01362 蒙古黄芪内蒙包头 0.002149 0.003720 未检出 膜荚黄芪山西浑源 0.03425 0.00
29、4200 0.01233黄芪饮片山西 0.009321 0.008591 0.005581黄芪注射液成都 0.004225 0.0002608 未检出,6讨论：我国药典采用薄层扫描法对黄芪甲苷进行测定，前处理以氨试液洗涤，含量远高于未用氨试液处理者。有文献报道，黄芪中5种黄芪皂苷以黄芪皂苷为基本母核，其糖链上连结有1-3个乙酰基，用碱处理时，乙酰基易脱落成为黄芪皂苷。本文对以氨试液处理与未经氨试液处理时的黄芪图谱与含量进行比较，表明后者黄芪皂苷的种类多于前者，由于缺少对照品，有2个主要皂苷未能定量，不能说前者皂苷含量与后者苷具等量关系，但验证了文献说法。黄芪中有效成分为总皂苷，将其转化为单一成分进行定量，既能对药材的综合品质进行评价，又能快速、简便操作，因此是可行的。,
