mRNA的出口因素GLE和肌醇hexakisphosphate规范翻译的不同阶段.doc

1、mRNA 的出口因素 GLE 1 和肌醇 hexakisphosphate 规范翻译的不同阶段蒂莫西 A.博尔格， 1 人 Andrew W. Folkmann ，伊丽莎白研究陈德良 1 ，1 和 Susan R. Wente 1，*1 465 21 大道南，纳什维尔范德比尔特大学医学中心， U 型 3209 MRBIII ，细胞和发育生物学，TN 37232-8240 ， USA*通讯作者： susan.wente vanderbilt.edu作者 10.1016/j.cell.2008.06.027概要需要适当的基因表达信使 RNA（mRNA ）的出口和翻译。然而，功能这些连续 的步骤之间

2、的联系没有得到充分的定义。 Gle1 是必不可少的，保守的表达出口的因素，其出口功能依赖小分子肌醇hexakisphosphate（IP6 ） 。在这里，我们表明，无论是 Gle1IP6 的都需要高效的翻译终止在酿酒酵母和交互 Gle1 终止的因素。此外， Gle1 有一个保守的起始因子与物理协会显示 eIF3 ， gle1 突变体的遗传相互作用与 eIF3 突变 nip1 - 1 。引人注目的是， gle1 突变 体在启动的缺陷，而株缺乏 IP6 不。我们建议 Gle1 职能，连同 IP6 和DEAD 盒蛋白 Dbp5 来调节终止。然而， Gle1 还独立调解萌生。因此，具有独特的优势Gle

3、1 协调 mRNA 的出口和翻译机制。这些结果直接影响模型 Gle1 在病理生理功能的扰动.引言寿命期间需要一系列分子事件真核细胞的信使核糖核酸（mRNA） ，包括转录，加工，出口，翻译和退化。完成所有基因的表达，这些步骤的基础和具体的质量预测控制机制来控制每个（摩尔，2005 年） 。迄今为止，已记录功能连 接转录，核加工，出口（荻原野岛， 2007 年） 。例如，招聘的 mRNA 出口因素加上适当的转录和剪接（科勒和伤害， 2007年） 。 mRNA 的出口和翻译之间的联系也存在（ Culjkovic 等，2006 ;总值等，2007 ;金等， 2003 ; Rosenwald 等，199

4、5 ） ;然而，分子机制不足明确界定。据推测，这种联系允许高效蜂窝同时多层次的基因表达调控。真核翻译是一个保守的机制四个主要阶段：起始，伸长率，终止和回收（审查，卡普和洛尔施， 2004 年） 。启动，涉及翻译主管 核糖体的装配表达，取决于刺激的真核起始因子（EIFS）核糖体的装载。其中之一， eIF3 ，有 6 至 13 亚基（酿酒酵母和人类中，分别）和按职能40S 亚基上的刺激复合物 的形成（形成 43S preinitiation 复杂） ，招收的 mRNA ，并促进启动现场扫描（ Hinnebusch 2006 年） 。有趣的是， eIF3 也调节终止后核糖体的解离和回收（ Pisar

5、ev 等，2007 ） 。正确的翻译终止是同样基因表达的关键。主要是受终止释放因子（ eRFs ） 1 和 3（ Sup45 和Sup35 ，分别在酵母） （卡普洛尔施， 2004 年） 。终止密码子是公认的eRF1 /Sup45 ，刺激核糖体肽基转移酶活性释放完成的多 肽。这项活动是增强 eRF3 ，虽然 eRF3也结合的 poly（A ）结合蛋白（ PABP/Pab1 ） ，并有可能在核糖体回收的作用（星野等， 1999） 。然而，一个 mRNA翻译之前，必须退出核通过核孔复合物（ NPC ） 。初步 mRNA的出口步骤需要认识到主管出口 mRNA -蛋白质复合物（ mRNP ）运输因素

6、Mex67 （脊椎动物TAP/NXF1 ） （ Gruter等，1998 ;片平等，1999 ; Segref等。1997 年） 。后 Mex67依赖目标是在全国人民代表大会，有几个其他因素是必要的适当的出口。 Gle1 是必不可少的出口因子基因在酵母和人类细胞（墨菲 Wente ， 1996 年;沃特金斯等， 1998） 。 Gle1联营公司与在酵母和 hCG1 全 国人大通过 nucleoporin - 42 （ Nup42 ）和 NUP155 在人体细胞（ Kendirgi 等，2005 ;墨菲和 Wente ， 1996 年 Rayala 等; ， 2004 年） 。在与小 Gle1

7、刺激分子的肌醇 hexakisphosphate （ IP6） ，RNA 依赖的ATP 酶活性的 Dbp5 （城堡罗马等，2006 ; Weirich 等，2006） 。 Dbp5 是一 个必不可少的成员 DEAD盒解旋酶家族，与细胞质全国人大绑定网站在酵母中是并列 Gle1 - Nup42 在Nup159复杂（霍奇等人， 1999 年，施密特等人， 1999 年。 Snay 霍奇等， 1998） 。 Gle1/IP6-activated Dbp5 转换为一个 Dbp5ADP 状态触发 mRNP重塑，取代蛋白质以促进出口的方向性（陈等，2007） 。此前的研究表明出口之间的耦合转换机制。脊椎动

8、物 TAP/NXF1 促进RNA 的翻译窝藏病毒构交通元素（ CTE ） （ Jin 等，2003 ） 。证据还表明，帽结合蛋白 eIF4E 的调节出口的一个子集细胞周期相关的 mRNA （ Culjkovic 等，2006 ; Rosenwald 等， 1995） 。有趣的是，最近的一份报告揭示了一种新的（ Gross 等人，2007 年） Dbp5 的功能，在翻译终止。因此，我们推测 Gle1 可能也有一个翻译的作用通过 Dbp5 激活。虽然丰富的核Gle1RIM ， Gle1 还发现，在细胞质中（德尔 Priore 等。1996 年，沃特金斯等，1998 ） ，支持存在 Gle1 。池的

9、翻译机器。Gle1 细胞功能的划分是特别重要的报 道在人类之间的基因突变的因果联系 GLE1 和人类运动神经元退化严重的形式（ Nousiainen 等， 2008） 。在这里，我们显示， Gle1 有遗传与转换因素和扮演的角色物理相互作用终止和启动。令人惊讶的是， IP6 的生产只需要翻译终止。这表明，Gle1 翻译 中扮演了两个独立的角色，在终止通过 Dbp5 IP6 的依赖激活启动这是IP6 的和 Dbp5 独立。这项工作揭示了广泛的 mRNA 的出口，翻译和分子之间的联系提供了一个关键基因表达的协同调控机制步骤。结果Gle1 戏剧翻译中的作用为了调查是否Gle1 翻译功能，我们采用酿酒

10、 酵母模型系统，并分析了面板在翻译的存在生长缺陷的突变株抑制剂放线菌酮和巴龙霉素（图 1A） 。以前这些抑制剂已经用于识别突变体在不同的翻译方面的缺陷（格林伯格等，1998 ;总值等， 2007; Wakem 和谢尔曼， 1990 年）一般翻译扰动，并允许快速评 估。两个 gle1温度敏感突变株（ gle1 2 和 gle1 - 4）增长同样野生型对照菌株在23丰富的媒体。然而，在 23 ，都显着降低放线菌酮和巴龙霉素的存在增长（图 1A） 。作为对照，窝藏株野生型GLE1 表达质粒被救出的放线菌酮敏感生长缺陷（图 1B） 。更重要的是，窝藏突变株在其他基因 mRNA 的出口需要通过NPC的

11、rat7 - 1 （ nup159 ） ， nup42D没有增长的抑制下这些条件（图 1A） 。值得注意的是， Nup159和 Nup42全国人民代表大会分别 Dbp5 和 Gle1 （ Hodge 的对接网站等， 1999 年，墨菲和 Wente ， 1996 年，施密特等人， 1999 ） ，rat7 - 1 突变体（ nup159 ）有严重的 mRNA 的出口缺陷（ Gorsch等， 1995） 。这表明，在过敏 gle1 突变体的翻译抑制不是归因于一般缺陷mRNA 的出口。如果 Gle1涉及翻译，我们推测，这可能是与核 糖体相关联。蔗糖密度分馏与野生型菌株的裂解物和样品进行了分析Gle

12、1 免疫。多数 Gle1被发现最轻（ nonribosome ）馏分;一个 Gle1显著部分是在较重的核糖体 分数，特别是上世纪80 年代的一小部分（图 1C ， 6 车道） 。这表明功能， Gle1 可能与核糖体相关联复合物。图 1 。在翻译 Gle1 的作用（一）文化 gle1 - 2 ， gle1 - 4 ， rat7 - 1 （ nup159 ） ， nup42D ， gfd1D ，与野生型（WT ）的菌株，发现 5 倍系列稀释 YPD 单独或 YPD 含0.1 mg / ml 的放线菌酮或 0.4毫克/毫升巴龙霉素，然后孵育 2 天23（二） gle1 - 4 的文化和野生型菌株转化

13、空 URA3 /岑质粒（ pURA3 ）或GLE1/URA3/CEN （ pGLE1 ）质粒遭受检举（一）市建局或无酮 的选择性媒体。（三）在 23 生长的野生型 菌株的裂解液蔗糖密度分馏immunoblotted 与 A - Gle1 和 A - Rps6 （核糖体控制蛋白质） 。核糖体分布测定 OD254 。Gle1 互动与终止因子 Sup45接下来我们用遗传和生化实验，以测试是否 Gle1 起着翻译终止的作用。首先， gle1 sup45 双突变株合成健身缺陷测试高 温（图 2A） 。在 30 ，一个 semipermissive gle1 - 4 株，生长温度增长的 gle1 4 su

14、p45 - 2 双突变体抑制相比，无论是单突变。其次，进行免疫共沉淀实验测试 Gle1 物理协 会终止因素。使用 Sup45 和 Sup35 株抗原表位标签一个串联亲和纯化（TAP）的序列，我们孤立的复合物从细胞裂解物和 immunoblotted （图 2B ，顶面板） 。大量的内源性Gle1 水平分别 coimmunoprecipitated Sup45 的抽头。在隔离检测最小 Gle1从控制裂解物缺乏自来水标签蛋白。 “Gle1 ： Sup45 ，抽头的相互作用是由核糖核酸酶治疗没有改变，表示，该协会是不通过介导 RNA （数据未显示） 。虽然大大降低， Gle1 也 coimmunop

15、recipitated 与 Sup35 - TAP （图 2B ，底部面板） 。为了调查是否Gle1 和 Sup45 直接绑定在体外，可溶性结合实验用细菌表达Gle1 和 GST 标签 Sup45 。相比一个控制仅与 GST 的测定，纯化的水平显着高于 Gle1 势必 GST - Sup45 （图 2C） 。此外， Gle1 仍然 会核糖核酸酶处理后的 GST - Sup45 （数据未显示） 。 Dbp5也赞同 Sup45 （ Gross 等人，2007 年） 。因此我们得出结论， Gle1 Dbp5 都是物理连接翻译终止复杂。图 2 。 GLE 1 终止因素相互作用（一） 文化 gle1 -

16、 4 ， SUP 1-4， 45-2 ， GLE sup45 - 2 ，和野生型对照株（WT ）的连续稀释， YPD 发现，在 23 或者 30 孵育 2-3 天;（二） Immunoprecipitations SUP35 - TAP 裂解物，SUP45 抽头，和野生型（WT ）的酵母菌株。裂解液（10 ）的输入和总 immunblotted 与A - Gle1 或 A -鼠 IgG 免疫（知识产权）检测的 TAP标签蛋白（ ProtA ） 。（三） 可溶性结合实验与 GST - Sup45 或GST 细菌裂解液和重组的 纯化 Gle1 。 Gle1 输入（10 ）和约束样品 immunob

17、lotted与 GST 或 A - Gle1 。Gle1 都需要高效的翻译终止为了进一步研究 Gle1 在终端功能要求 ，我们进行了两个独立的检测终止效率。首先，我们用 ADE2 - 1 窝藏基因的 菌株赭石义突 变，呈红色，由于缺乏 ADE2 酶的功能。废话密码子通读，结果终止缺陷，产生功能 ADE2 蛋白并减少红色色素沉 着（考克斯， 1965 年） 。殖民地的一个野生型对照菌株红色，而 temperaturesensitivesup45 - 2 突变呈粉红色（图3A） 。与之形成鲜明对比的是，gle1 - 2 sup45 - 2 和 gle1 - 4 sup45 - 2 双突变菌落是白色

18、的。这表明在更严重的终止缺陷比各自单突变株的双突变。值得注意的是，这种效果是在允许的温度观察 gle1 突变体（ 23 ） 。我们还完成了一项实验，利用一个串联B -半乳糖苷酶/相隔很短的连接器序列的荧光素酶报告（斯塔尔等人， 1995 年） 。三个相关质粒为基础的记者如图 3B 所示：一帧中插入一个终止密码子到连接区域（ TMV ） ，缺乏终止密码子的控制（TQ ） ，以及从 HIV - 1 病毒的茎环 已插入控制连 接器（1789 年） 。这些质粒转化控制和 gle1 突变株，并通读效率被确定在 23 到 bgalactosidase 荧光素酶的比例比较天晴控制和其 他两个活动之间质粒产生

19、的相对水平的异常终止通读。大致与先前的结果一致（斯塔尔等。1995 年） ，野生型菌株显示， 27 读通过与 TMV 的构造（图 3C） 。引人注目的是 ，在两个通读 gle1 - 2和 gle1 - 4 株，大幅增加至 71和 73 。的影响，具体到正常终止，因为读通过的干循环的效率不会改变（图 3C） 。与其他相似的结果终止密码子序列（数据未显示） 。一个rat7 - 1 （ nup159 ）应变显示最小 变化（34） ，这表明，一般的扰动 mRNA 的出口没有影响翻译终止。另一种表达出口的突变株， nab2 - DN ，也没有明显的缺陷在通读效率（图 S1A 网上） 。缺陷也明显较 少（

20、36）在 rat8 - 2 （ dbp5 ）在 gle1 突变体在23 ，和别人比突变以前报道在通读的温和增长（从 16 至 25 ）rat8 - 2（ dbp5 ）突变后，在简短的脉冲的限制性温度（ Gross 等人，2007 年） 。我们的结论是，分歧反映突变的突变体之间的 rat8 - 2 （ dbp5 ）和 gle1 特异性和突出 gle1 突变缺陷的鲁棒性。有趣的是， GLE1 过度表达部分获救通读缺陷的一个 sup35 - 21 终止突变（图 S1B ） 。两者合计，这些数据表明Gle1 需要高效的翻译终止。接下来，我们分析功能直接后果终止。协会的 Sup35 与终止（ eRF3

21、）复杂的是关键的一步，在终止和其他证明 Dbp5是需要 Sup35 纳入到终止复合物（ Gross 等人，2007 年） 。蔗糖密度分馏控制裂解物和gle1 - 4 株含有 Sup35 TAP -标签（图 3 四） 。在野生型样品，显著水平 Sup35 cofractionated 挖掘与核糖体（ 80S 和多体，确定由 OD254 ） 。光密度分析结果显示，约 47 Sup35 ，抽头核糖体相关的野生型裂解物。然而，水平核糖体相关的Sup35 点显着下降裂解液从 gle1 - 4 突变的细胞，尤其是在后来的多核糖，分数（比较 gle1 - 4 与野生型的车道 7-12 ） ，和大多数的 Su

22、p35 - TAP 转移到低密度分数（巷 2 ） 。定量分析表明，核糖体水平相关 gle1 - 4 样品 Sup35 TAP （26）下降近一半，在野生型。在 gle1 - 4 突变， Sup45Dbp5 ，和 gle1G384R 没有表现出核糖体显著下跌协会（图 S1C ） 。我们得出的结论是 Gle1促进核糖体协会在终止 Sup35 。图 3。 Gle1 都需要高效的翻译终止（一）文化 gle1 - 2 ， sup45 - 2 ， gle1 2 sup45 gle1 - 4 sup45 - 2 ，和野生型对照（WT）的连续稀释和0.25 YPD 发现。板孵育被评定为 4 天，在 23 ，和

23、殖民地色彩。（二）串联 b-galactosidase/luciferase 记者构造表明：天晴（对照组）缺乏一个终止 密码子在链接，烟草花叶病毒插入一个终止密码子帧到连接的地区， 1789 插入从 HIV - 1 的茎环到连接器。（三） gle1 - 2 gle1 - 4， rat8 - 2 （ dbp5 ） ， rat7 - 1 （ nup159 ） ，与野生型对照（ WT ）株转化与串联记者构造，和荧光素酶和B -半乳糖苷酶检测。活动正常化细胞数，比率和荧光素酶 B -半乳糖苷酶的活性进行了测定。通读活动是烟草花叶病毒的百分比或 1789 记者表示天晴控制每一 株相比， N = 3A “

24、 5 个独立的实验。误差棒代表扫描电镜的上方和下方的平均1 。 * P 0.01 。（四）裂解液 SUP35 -抽头 gle1 - 4 SUP35 -抽头株生长在23_C蔗糖密度分馏，用鼠标 immunoblottedIgG 的检测 Sup35 ，抽头。核糖体分布测定 OD254 ，和杂交，通过光密度分析分配核糖体协会百分比（ N = 4 ） 。扫描电镜的上 方和下方的平 均错误 1 。 P 0.05。图 4。 Gle1 保守与 eIF3 亚基相互作用（一）表达 hGle1 - GFP 和 eIF3f - HA 的质粒共转染 HeLa细胞，并 immunoprecipitations A -绿

25、色荧光蛋白抗体。与绿色荧光蛋白或细胞裂解液（ 5）和免疫 immunoblotted 一个“房委会” 。（二） Immunoprecipitations PRT1 - TAP 裂解物， NIP1 水龙头，野生型（WT ）的酵母菌株。裂解液（10 ）的输入和总免疫（IP）的人 immunoblotted 与鼠 IgG （塔标签蛋白质 ProtA ）或 Gle1 。（三）重组纯化 Gle1 细菌裂解 液孵育 GSTPrt1Nip1 ， -Rpg1/Tif32 ， Tif34 ，或- Tif35 ，并结合蛋白进行分离 A - Gle1 免疫。对照组，裂解物孵育无Gle1 。核糖核酸酶 A治疗与Gle

26、1/GST-Prt1 样品进行。总的约束，并输入（ 5）与 A - GST 或 A - Gle1 immunoblotted 。（四）各自的 gle1 和 nip1文化单，双突变株与野生型（WT ）的连续稀释和YPD 发现。板在 23 ， 30或 37孵育 3 天Gle1 互动与启动因子 eIF3虽然一致 Dbp5 相互作用，该协会 Gle1 与翻译终止复杂耐人寻味的在我们之前发现一个酵母双杂交之间的相互作用人类Gle1 （ hGle1 ）和 F 亚基（ P47 /S5 / 3 的翻译起始因子eIF3 ） （ Rayala等，2004） 。为了进一步研究这个人类细胞中的相互作用，我们转质粒表达

27、绿色荧光蛋白标记 hGle1 和 HA -标签 eIF3fHeLa 细胞。与抗 GFP 抗体的Immunoprecipitations 总细胞裂解物（图 4A） 。免疫印迹分析表明， eIF3f - HA 是专门coisolated hGle1 - GFP 。这一结果证实hGle1 与交互 eIF3亚基。由于人类 eIF3f 亚基在酿酒酵母中是不守恒（ Hinnebusch 2006 年） ，我们进行了immunoprecipitations 从酵母菌株表达不同版本的 TAP 标签 酵母 eIF3亚基。内源性 Gle1是 coimmunoprecipitatedPRT1 - TAP （ eIF

28、3b ） （图 4B） 。我们没有始终如一与其他eIF3 亚基检测 Gle1 显著 coisolation测试（ Nip1/eIF3c ， Rpg1/eIF3a ，并 Tif34/eIF3i ） ，虽然这可能反映了紧缩的实验条件（图 4B 和数据未显示） 。值得注意的是，我们没有检测到 Dbp5 中的 PRT1 自来水或 Nip1 - TAP 复合物（数据未所示） 。我们的结论是Gle1 身体联营公司 eIF3 亚基，并从这些相互作用是保守酵母到人类。为了测试 Gle1 和 eIF3 之间的直接物理相互作用，我们进行了体外结合实验。裂解液是由细菌每五个核心GST 标签的融合表达酵母 eIF3

29、亚基（ PRT1 ， Nip1 ， Tif32/Rpg1 ， Tif34 和 Tif35 ）培养与重组纯化 Gle1 。 Immunoprecipitations 抗 Gle1 抗体，并GSTtagged eIF3 亚基免疫印迹检测。至于如图 4C所示， GST - PRT1 coisolated 与 Gle1 ，并核糖核酸酶处理后，该协会是维持。 GSTTif35 ，这是一个 subcomplex PRT1 （潘等组成部分。2001 年） ，也必将 Gle1 。其他三个亚基没有专门绑定 Gle1 。因此， Gle1物理与 eIF3 ，与 PRT1 和Tif35 两个潜在的具有约束力的表面 。

30、为了测试 Gle1 和 eIF3 之间的功能联系，我们产生 gle1 nip1 双突变株，并检测在不同的温度范围内生长。在 23 ，无差异，观察单和双突变体之间的增 长进行了比较（图 4D ） 。然而，合成健身缺陷检测在 30 ，其中 gle1 - 2 nip1 - 1 和 gle1 - 4 nip1 - 1 株有抑制细菌的生长的单突变体相比。相比之下，没有合成的生长缺陷，观察 rat8 - 2（ dbp5 ） nip1 - 1 或 rat7 - 1 （ nup159 ） nip1 - 1 双突变（图 S2A 数据未显示） 。互动的特殊性，进一步表明没有合成的生长缺陷，观察 gle1 PRT1

31、 - 1 或 gle1 rpg1 - 1 双突变（数据未显示） 。因此，物理和遗传相互作用被发现Gle1 和 eIF3 之间，以及这些功能似乎是独立的Dbp5 。Gle1 在翻译起始的功能为了解决 Gle1 需要启动的假设，我们首先分析 了 monosome 多核糖含量不同的突变株，用蔗糖密度沉淀。在允许的温度（ 23 ） ，从 gle1 - 4 突变的细胞的多核糖配置文件是从野生型细胞（图 5A 及 5C ）类似。然而，后温度变化至 37 ，显示 gle1 - 4 细胞显着升高 monosome 高峰期，减少了多体（图 5D） 。此配置文件表示，在翻译起始的缺陷，因为它是类似的启动因素，包括

32、 nip1 （格林伯格等人， 1998 年。 Nielsenet 人，2004 年）的有缺陷的菌株。有趣的是，在 37的多核糖轮廓rat8 - 2 （ dbp5 ）也暗示启动缺陷（图 S2B ） （ Gross 等人， 2007 年） 。作为对照，我们证实 gle1 - 4 缺陷 GLE1 表达质粒（图 5G 和 5H ）救出。重要的是，在图 5E ，应变缺乏 GLE2 （ gle2D ）所示，另一种表达出口的因素（ Murphyet 人， 1996 年） 。编码，在 monosome 没有显著的扰动：在 37 ，除了多核糖比例，显示一个 nup116D 应变与减少 monosomes 和多体

33、（ Figure5F ）不同的配置文件。这可能是由于核糖体亚基出口减少在核质贩运 37 nup116D细胞彗星的总块（舞台齐默尔曼等，2000 年 Wente 和布洛贝尔， 1993 年） 。因为 gle1 - 4 核糖体的姿态是有别于 gle2D 和 nup116D概况，我们认为 gle1 - 4 缺陷的原因不是在mRNA 的出口块。 “gle1 - 4 突变的细胞改变配置文件支持 Gle1翻译起始的作用。图 5。包庇 gle1等位基因突变的菌株多核糖简介缺陷多核糖型材所产生的细胞裂解液 7 “ 47 的蔗糖密度梯度离心和 OD254分馏梯度分析。 （一） monosome （ 80S ）和

34、多核糖峰标记。野生型细胞培养生长在 23 （一）或转移到为 75 分钟（二）收获前 37 彗星。生长在23 （三）文化的 gle1 - 4 ，或转移到 37 （四）收获前 75 分钟的彗星。 mRNA 的出口突变体 gle2D （E）和 nup116D （六）被转移到收获前 75 分钟 37 比特彗星。请注意，monosome 和多核糖峰 nup116D 应变减少。 gle1 - 4 和野生型（ WT）的控制株窝藏一个 URA3/CEN 或 GLE1/URA3/CEN 质粒转移到收获前 60 分钟（ GA “J ） 37 彗星。图 6。 GCN4 激活缺陷检测 gle1 突变体野生型（WT ）

35、的， gle1 - 2 - 4 gle1 ， rat7 - 1 （ nup159 ） ，并 rat8 - 2 （ dbp5 ）株转化与 GCN4 - lacZ 报告质粒。文化是生长在浦“ ，他的选择性培养基在 23 2 小时或 30比特彗星。 3 aminotriazole （ 3AT ）增加。增长在 23或 30过夜后， B -半乳糖苷酶的活性进行检测。动表示为 B -半乳糖苷酶的单位（ 1 单位水解 1毫摩尔的邻硝基酚- BD -半乳糖苷（ ONPG ）每分钟每单元基板） 。误差棒代表扫描电镜的上方和下方的平均1 。下表总结了每 个在每个临时应变倍激活（ AT 3AT 分为 3 ） 。 *

36、 P 0.05为在 23与 30倍的激活（ N = 3A “ 5 个独立的实验） 。Gle1 和 eIF3 之间的遗传和物理链路的基础上，我们测试 gle1 突变体是否有 GCN4调控的缺陷。 GCN4 表达，生物合成途径的活化剂，是受平移的控制（检讨，看到 Hinnebusch 2005 年） 。 GCN4 mRNA 的翻译通常是 derepressed 氨基酸饥饿通过 eIF2a 磷酸化状态的改变。然而，这种调节是由受损，如起始因子 eIF3 （例如， Nielsen 等，2004 年） ，并启动突变株的缺陷，往往表现出要么构镇压或 derepression GCN4 表达（ GCN 或G

37、CD 的表型，分别） 。我们要研究 GCN4 表达，利用这 50 GCN4 地区的非编码链接到lacZ 的记者。潜伏期 3 aminotriazole （ 3AT ） ，组氨酸合成途径抑制剂，与野生型应变控制类似的程度上激活了在23或 30 （图 6） B -半乳糖苷酶的活性。相比之下，同时 gle1 - 2 和 gle1 - 4 株在 3AT处理的样品在23的高活性在 30 semipermissive 的温度急剧减少的激活与这表明 gle1 突变体有一个 GCN 的表型，并在激活的急剧减少与翻译起始 Gle1的作用是一致的。另一方面，在 rat7 - 1 株（ nup159 ） ，激活仍然

38、在 30观察，然而，到 23相比小幅下降，在 rat7 - 1 （ nup159 ）活动的基础水平株也下降， 3AT 诱导倍，仅略有改变（图 6） 。 rat7 - 1 （ nup159 ） 3AT 激活突变体中也保持着高达 34 （数据未显示）。总体而言，与 rat7 - 1 （ nup159 ）应变的结果在 记者表达的出口缺陷完全一致。冷敏感突变株mRNA 的出口， nab2 DN （ Marfatia 等， 2003） ，也没有显示任何 GCN4激活（图 S2C 公司）随温度变化的的变化。此外， sup45 - 2 终止突变呈温和 GCD 表型与 3AT （图 S2D ）的情况下显著活动

39、，表明 gle1突变表型是由于终止缺陷。有趣的是， rat8 - 2 （ dbp5 ）突变株显示在 一个 semipermisssive 温度（图 6） ，在活动的大幅减少。这可能表明一个 GCN 缺陷;然而，类似 rat7 - 1 （ nup159 ）突变，变化不大倍 rat8 - 2 （ dbp5 ）突变。这些结果与缺乏的遗传和生化连接到翻译起始功能为 Dbp5 一致。我们得出结论，如果 Dbp5次在启动的作用，这种作用是从Gle1 不同。IP6 的生产调节终止，但不启动在核出口， IP6 的结合Gle1 促进Dbp5 共活化作用（城堡罗马等， 2006 年。 Weirich 等，2006

40、 ） 。 。 IP6 的生成由磷脂酶 C -依赖途径和两个肌醇激酶（纽约等， 1999）的协调活动。 Ipk2 是一个双功能的转换肌醇 1,4,5 三磷酸肌醇激酶1,3,4,5,6 pentakisphosphate （ IP5 ） ，肌醇，而特定激酶， Ipk1 2 介导的 IP6 的生产IP5 （纽约等， 1999） 。此外， IP6 的激酶（ VIP1 和 Kcs1 ）负责生成不同的高阶pyrophosphorylated inositols （ Mulugu等人， 2007 年 ; Saiardi 等， 1999） 。在翻译这些可溶性 inositides的角色没有以前的报告。我们发现

41、， ipk1D 应变翻译抑制剂放线菌酮（图 7A）过敏。此外， ipk1D sup45 - 2 双突变株的产生，并显示在所有具有杀伤力的温度在 34 （图 7B）合成生长缺陷。 ipk1D sup45 - 2 株也呈上升终止读通过，升高 ADE2 - 1 株（数据未显示） ADE2 生产检测的基础上。此外，像 gle1 突变株， ipk1D 株站得高读通过串联记者吸附试验（图 7C ）的活动（69） 。重要的是， ipk2D 应变也增加了终止通读。相比之下，正常或仅轻度增高读通过活动观察 vip1D 和 kcs1D 株，分别。这些数据强烈牵连在翻译终止 Ipk1 IP6 的生产。因为 IP6

42、的直接结合 Gle1 （城堡，罗马等，2006 年。 Weirich 等， 2006） ，我们假设IP6 的可能也萌生了发挥作用。然而，从 ipk1D应变裂解液中 的多核糖剖面显示，在 23或后转移到 37 （图 7D 和数据未显示）没有重大的缺陷。相比之下 gle1 突变体， ipk1D 应变也显示没有 激活在任何温 度测试（图 7E ） GCN4 lacZ 报告的扰动。最后，没有合成的遗传相互作用观察 ipk1D nip1 - 1 双突变（数据未显示） 。因此， Ipk1 是不需要启动和启动功能的 Gle1 是不依赖 于 IP6 的生产。讨论在这里，我们报告 Gle1 ，一个善意的表达出口

43、的因素，也有一个翻译的作用。引人注目的是， Gle1 需要翻译起始和终 止。终止，我们文件 Gle1 和 Sup45/eRF1 终止因子（图2） ，从 gle1 突变体（图 3D）在 Sup35/eRF3 招聘扰动功能相关的遗传和物理之间的相互作用。我们进一步表明， Ipk1 ，特别 IP6 的生产，也与翻译终止。 Gle1 和 IP6 平行Dbp5 最近在翻译终止（ Gross 等人，2007 年）报道的这些要求。因此，我们预测，在终止 Gle1/IP6 作用是通过激活的 Dbp5 。然而，我们也发现， Gle1 影响翻译起始。有 Gle1和亚基起始因子eIF3 （图 4） ，以及在 gle

44、1 突变体（图 5 和 6 ）翻译起始缺陷之间的遗传和物理相互作用。与此形成鲜明对比的是， IP6 的是不涉及在启动，任何 Dbp5启动的作用是截然不同的 Gle1 。有趣的是，这里使用的 gle1 突变等位基因温度敏感方面发起的缺陷，而终止的缺陷表现在允许的温度。因之进一步的建议， Gle1 展品显着不同的功能在启动和终止。我们得出结论，在翻译的终止和启动 Gle1 的角色是分开 Gle1 启动功能，是独立的 Dbp5 和 IP6的。我们进一步推测，在翻译 Gle1 和 IP6 的角色是其在 mRNA 出口的功能无关。具体来说，在 gle1 和ipk1 突变体的翻译缺陷是由于间接的影响 of

45、mRNAexport 缺陷。有四个鲜明的证据支持这一结论的。第一，其他的 mRNA 出口突变株，如 rat7 - 1 （ nup159 ） ，没有相同的表型（图 1，3 和 6） （总值等， 2007） 。 gle1 - 2， gle1 - 4 ， rat7 - 1 （ nup159 ） ，和 rat8 - 2 株（ dbp5 ）有轻微表达出口的缺陷，更严重的缺陷，在 23 37 （ Gorsch等，1995 ;墨菲和 Wente ，1996 年; Snay 霍奇等人，1998 年） 。此外，这些突变体在相同的途径出口的 mRNA （城堡，罗马等，2006 ;霍奇等人， 1999 年） 。因为

46、它们共享mRNA 的出口类似的缺陷，不同的翻译表型很可能在不同的翻译功能缺陷的结果。我们的数据显示终止，但还没有启动缺陷在 ipk1Dstrains 支持 gle1 突变表型的特异性。第二，至少在某些检测， gle1 和 ipk1 突变表型没有预期的结果 mRNA的出口限制的突变。例如，在通读法（图 3C 和 7C ） ，只表达出口的扰动应减少活动，或有没有影响（因为细胞质 LAC - Z 和荧光素酶 报告的 mRNA 的水平减少出口将减少同样） 。相反，在gle1 和 ipk1 突变体，我们观察到在通读的急剧增加。第三，如果在重塑 themRNPduring出口的缺陷是负责翻译的扰动，然后

47、gle1 ， ipk1 和 dbp5 突变体的表型应该是相同的。然而，它们是不同的，突出表现缺乏ipk1D 突变启动缺陷。最后， Gle1 是完全牵连在翻译通过其特定的物理作用在体内和体外（图 2B，2C， 4A - 4C ）的翻译因素。 Gle1 启动和终止因素的相互作用提供了一个直接连接两个转换步骤。往的研究表明，人类和酵母 Gle1 部分本地化的细胞质（德尔 Priore 等，1996; 。沃特金斯等人，1998 年）和 hGle1细胞核与细胞质之间的穿梭巴士（ Kendirgi 等，2003 ） 。这本地化额外Gle1 在全国人民代表大 会以外的其他网站的功能是一致的。此外， hGle

48、1 存在两种异构体， A 和 B ，除了在极端的羧基末端（ Kendirgi 等， 2003）几乎相同。有趣的是，而 hGle1B 定位于核 RIM ， hGle1A不，和它的主要功能可以在细胞质中。然而，由于替代酵母Gle1 亚型尚未见报道，在酿酒酵母中 的出口和翻译功能，大概是由相同的Gle1 蛋白。图 7。 IP6 的调控终止，但不启动（一）被发现的 5 倍系列稀释 YPD 单独或 YPD 含 0.1 毫克/毫升放线菌酮ipk1D 和野生型（WT）的菌株培养。板在 23孵育 2 天（二） ipk1D sup45 - 2 - 2 sup45 ， ipk1D ，和野生型（WT）的菌株文化系列

49、稀释， YPD 发现，在 23 ， 30 ， 34 C ， 37孵育 2 天（三）通读检测 ipk1D ， ipk2D ， vip1D ， kcs1D ，和野生型（ WT）的控制株 b-galactosidase/luciferase 串联记者。被确定为图 3C 通读效率。 N = 4A “ 6 个独立的实验。（四） ipk1D 多核糖配置文件 生成，如图 5 。收获前 75 分钟到 37 彗星细胞转移。（五） GCN4 活化分析与 ipk1D 野生型（ WT）的控制与 GCN4 - lacZ 报告，如图 6 株。误差棒代表扫描电镜的上方和下方的平均1 。我们建议， Gle1 多个步骤来弥合夫 妇 mRNA 的出口和翻译是一个关键因素。首先，作为mRNP通过核孔通过， RNA 结合蛋白组成，是一种机制，需要 Gle1/IP6 Dbp5 ATP 酶（城堡，罗马等， 2006 年激活改造;陈等，2007 ; Weirich 等， 2006） 。这是可能 Gle1 结合在此期间全国易位步骤的 mRNP ，整个翻译。然而，鉴于预测低的酵母 Gle1细胞的丰度（ Ghaemmaghami等。 2003 年） ，瞬态和/或监管的互动