1、2015年版,诺如病毒 标本处理和实验室检测 技术方案,目录,前言,诺如病毒完整的检测及分型流程包括标本前处理、RNA 提取、Real-time RT-PCR 检测、传统RT-PCR 检测、测序和基因分型6 个步骤。Real-time RT-PCR 方法灵敏度和准确度高，是检测诺如病毒的金标准。用传统RT-PCR 可对Real-time RT-PCR 阳性标本的PCR 产物进行测序，通过序列分析确定诺如病毒的基因群和基因型。在发生聚集或暴发时，ELISA 方法可作为辅助的手段快速检测诺如病毒抗原。食品、水、环境涂抹样检测方法的灵敏度不稳定，仅作为参考方法。,1 标本前处理,1 标本前处理,1.
2、1 粪便、呕吐物 1.1.1 设备和材料微量移液器、无菌过滤器、漩涡振荡器、微量离心机、1.5ml 无菌离心管、磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）10mM pH7.0-7.4。 1.1.2 操作方法 （1）离心管每管分装0.5mlPBS。用一次性移液管（或无菌棒）添加豌豆大小的粪便（约0.1 克），稀释成约10至20（重量/体积）的粪便悬浮液。当粪便样品是液态时，不必在PBS 中稀释，直接使用500ul 的样品。 （2）漩涡振荡每个样品1 分钟。在5000 rpm 下,1 标本前处理,离心5 分钟，使得固体沉淀。澄清上清液可以直接用于病毒核酸提取或贮存于-70。 （3）取澄清的上清液200ul 进行R
3、NA 提取。,1 标本前处理,1.2 水 通过阴离子滤膜过滤水样品。用牛肉膏（1.5%w/v）含0.05M 甘氨酸（pH9.0）缓冲液洗脱附在膜上的病毒。使用Microsep 100TM 或CentriconTM columns 离心管进一步浓缩洗脱液。 1.2.1 设备和材料 DEPC 水、新配制次氯酸盐（至少1%）或等效消毒剂、MilliporeHA filter（孔径0.45um、）、换膜过滤器、真空泵、计时器、PH 值酸度计、磁力搅拌器及转子、低温冰箱（-20、-70）、Microsep 100K columns（PALL 公司）、Centriprep YM-50（Millipore
4、公司）、洗脱液（BE-0.05Gly pH7.0）、PBS (pH7.2)、离心机、,DEPC水是用DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压 灭菌的MiliQ纯水，无色液体。经检测不含杂质RNA、DNA和蛋白质。,1 标本前处理,氯仿、丁醇。 1.2.2 操作方法 1.2.2.1 过滤装置准备 （1）使用无菌的镊子将滤膜放在滤器架上，滤膜有三层，型号分别为Millipore HA filter、AP15 和AP20，放置顺序为Millipore HA filterAP15 AP20。 注意：暴露出滤膜表面使其能与水样接触，请将滤膜光滑表面的那边向下
5、。所有的玻璃器皿应干净无菌。每批水样使用不同的漏斗。,1 标本前处理,（2）将滤膜置中，将有刻度的漏斗放在滤器的上边。 （3）使用不锈钢滤器夹进行水的密封。 （4）真空泵连接1000ml 的锥形瓶。 注意：为防止气溶胶的污染，应在无菌的环境中过滤，在生物安全柜进行操作。 （5）向滤器中倒入20ml 无菌水（DEPC 水）检查滤膜的密封情况。 （6）打开泵，调整水的流速至形成缓慢的细流。,1 标本前处理,1.2.2.2 水样品的过滤 （1）向玻璃漏斗里倒水样，当水样完全滤过立刻关闭真空泵。 （2）用不锈钢的滤器夹，小心移开滤膜上的刻度漏斗。 1.2.2.3 用酸漂洗滤膜 将膜用无菌的镊子夹放在有
6、200ml 0.05mM H2SO4（pH3.0）的无菌500ml 烧杯中进行漂洗滤膜去除Mg2+。 1.2.2.4 洗脱 （1）将膜夹出放在无菌的60mm 培养皿中，加5ml 洗脱液。盖上铝箔。,1 标本前处理,注意：要将滤膜的上边向下（倒置）放在锥形瓶里。 （2）将锥形瓶放在恒温摇床上，转速45rpm，室温（23 3），15min。 （3）关闭摇床，将洗脱液（大约5ml）转移到管子里。 1.2.2.5 中和洗脱液 用1N HCl 或1N NaOH 调整洗脱液的pH 到7.0-7.4。检测前，洗脱液在-70储藏。 1.2.2.6 二次浓缩,1 标本前处理,方法一：用Microsep 100
7、K columns 或Centriprep YM-50 浓缩病毒 （1）为防止病毒的附着，先用无病毒粒子的洗脱液浸湿过滤器。 （2）将水标本滤膜洗脱液（大约5ml）加入到浓缩柱中，5000rpm离心5min。 （3）吸取浓缩液（约150l），转移至1.5ml 离心管中。,1 标本前处理,方法二：PEG 沉淀 （1）向标本洗脱液中加入NaCl 终浓度是0.3mol/L（若洗脱液为5ml 加0.08775g 的NaCl）, 有助于病毒的沉淀，再等量加入PEG-6000终浓度为12.5（w/v）（若洗脱液为5ml，加0.0625g 的PEG-6000。4过夜。 （2）4，10000rpm 离心30
8、分钟，收集沉淀。 （3）Millipore HA filter，倾倒并弃掉上清液。每个离心管添加150-500l pH7.2（0.2）PBS 重悬沉淀物。将离心管放置在离心管架上，为更好的让缓冲液与沉淀物接触，将离心管架成一定角度放置。室温放置30min。,1 标本前处理,注意：如果沉淀物没有溶解，可用缓冲液反复的轻轻吹打沉淀物。吹打过力会产生气泡。 （4）向悬液中加入等体积的氯仿/丁醇（1:1 vol/vol）混合。去除病毒悬液中的抑制剂。 （5）4，10000rpm，离心20 分钟。 （6）分离出水相（上清液），-80储藏。 （7）取200l 上清液进行核酸提取。,1 标本前处理,1.3
9、环境涂抹样将棉签在PBS里蘸湿，用力涂抹待测表面（最大面积100cm2）后，立即浸入核酸提取试剂盒裂解缓冲液中（QIAamp试剂盒560l，Genaid试剂盒400l），将棉签用力压EP管的侧壁，释放棉签中的液体。重复浸入和压侧壁的步骤3-4次，确保病毒最大释放量，直接进入核酸提取步骤。,1 标本前处理,1 标本前处理,1.4 食品 1.4.1 贝类 1.4.1.1 设备和材料诺如病毒质控样（中国食品药品检定研究院）、高速离心机（可离心15mL50mL 体积）、台式离心机、碎花制冰机、生物安全柜、实时荧光定量PCR 检测系统、眼科剪、眼科镊、一次性无菌培养皿、恒温摇床、高压灭菌器、电磨均质器（
10、LX134MO）、一次性研磨杵（上海生工）、15mL 去RNAase 离心管、1.5mL 去RNAaseEppendorf 管、20L、200L、1000L 微量移液器、 PBS 溶液 pH7.2 （Gebico）、蛋白酶K（PCR 级 Roche）。,1 标本前处理,1.4.1.2 贝类样品处理程序,1 标本前处理,1.4.1.3 解剖方法5 个贝类个体作为一件样品，分别解剖，取其消化腺和肠道，用于检测。如果一件样品的消化腺和肠道的总质量不够2.0g，应适当增加取样量，使得每件样品检验的总质量达到2.0g。 （1）牡蛎的解剖方法使用灭菌的刀具将牡蛎壳撬开，使用灭菌的眼科剪和眼科镊，先将牡蛎的
11、内脏部分剪取下来放到一个灭菌的平皿里，沿肠道将牡蛎软体部分剪开，暴露出肠道和消化腺，将多余的组织去掉，取其消化腺和肠道用于检测。牡蛎的解刨过程及解剖结构见下图。,1 标本前处理,1 标本前处理,（2）海虹用灭菌刀具将双壳撬开，将消化腺用镊子直接夹下，同时尽量将肠道取下。由于海虹的消化腺相对牡蛎较小，所以需要增加取样的海虹个体数，以使得总质量达到2.0g，用于后续的检测。海虹的解剖结构见下图，图中镊子所指的位置为海虹的消化腺。,1 标本前处理,（3）扇贝、毛蚶与文蛤扇贝与毛蚶的解剖结构与海虹相似，参照海虹的方法将壳打开后，直接判断消化腺所处的位置，用眼科镊和眼科剪，将其消化腺和肠道取下用于诺如病
12、毒的检测。文蛤的消化腺包在内脏团里，在解剖时可以直接用镊子在内脏团消化腺位置撕开，将消化腺取下，同时将肠道取出，用于检测，文蛤的消化腺体积较小，需要适当增加取样量以满足检验的要求。 1.4.1.4 均质将上述解剖下的消化腺和肠道放到50mL 灭菌的小烧杯内，用电磨均质器（LX134MO）将消化腺仔细打碎，成糊状。,1 标本前处理,1.4.1.5 蛋白酶K 消化将上述均质的消化腺，分别称取2.00.1g，加入15mL 的离心管，然后每管加入2mL 的PBS 溶液，加入20mg/mL 蛋白酶K（Roche）溶液10L 进行消化，另外取1 件样品加入诺如病毒的阳性质控球，作为外部质控阳性对照。 1.
13、4.1.6 将上述样品于摇床37，320rpm 振荡1h。恒温水浴60，保持15min；将15mL 离心管，3000g 离心5min，取200L 用于RNA的提取，剩余部分冷冻保存，用于复检。,1 标本前处理,1.4.2 三文鱼 1.4.2.1 设备和材料诺如病毒质控样（中国食品药品检定研究院）、恒温振荡器、食品均值器、天平：感量0.1 g、高速低温离心机（4 ，10000 g）、5PEG8000/NaCl 溶液（PEG8000 5002g，NaCl 871g,先用450mL蒸馏水溶解，稍微加热，待溶解后定容至1000mL，121，15min 灭菌）、磷酸盐缓冲液（PBS pH 7.2）、Tr
14、is/甘氨酸/牛肉膏缓冲液（TGBE）( Tris base 12.10.2g,甘氨酸 3.80.1g，牛肉膏101.0g，蒸馏水10001mL，121，15min 灭菌)、氯仿/正丁醇（1:1 体积比）溶液。,1 标本前处理,1.4.2.2 样品处理程序及方法,1 标本前处理,（1）取三文鱼样品25 g，剪碎后置于带滤网的均质袋中，加人TGBE 缓冲液40 mL，均质均匀，于室温60 r/min 震荡20 min。 （2）取滤液至50 mL 新的离心管中，4 ，10000 g 离心30 min。 （3）取上清液（小心避开液体表面的油脂层），加入上清液1/4体积的5PEG/NaCl 溶液，颠倒
15、60 s，4 ，60 r/min 震荡60 min。 （4）将上述溶液于4 ，10000 g 离心30 min，弃去上清液。向沉淀物中加入PBS 溶液700 L，震荡重悬。,1 标本前处理,（5）加入与上述重悬液等体积的氯仿/正丁醇（1:1）溶液，充分振荡，室温孵育5 min。于4 ，10000 g 离心15 min。 （6）取上层水相液体200 L 用于提取病毒RNA。,1 标本前处理,1.4.3 草莓、蓝莓 1.4.3.1 设备和材料诺如病毒质控样（ 中国食品药品检定研究院）、PEG8000（Polyethylene glycol）、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、碳酸氢钠（NaHC
16、O3）、磷酸二氢钾（KH2PO3）、磷酸氢二钠（Na2HPO3）、NaOH 溶液（5M）、HCl 溶液（1M）、纯水（Milli Q 系统净化）、氯仿（Methenyl trichoride）、丁醇（1-Butanol）、牛肉膏（Beef Extract）、甘氨酸（Glycine）、蛋白酶K（Proteinase K）、果胶酶（Pectinase from Aspergilus niger，Sigma）、5PEG/NaCl 缓冲液（PEG8000 5002g，NaCl 871g,1 标本前处理,先用450mL 蒸馏水溶解，稍微加热，待溶解后定容至1000mL，121，15min 灭菌）、TGB
17、E 缓冲液( Tris base 12.10.2g,甘氨酸 3.80.1g，牛肉膏101.0g，蒸馏水10001mL，121，15min 灭菌)、DHZ-D 型冷冻恒温振荡器、FE20K 型酸度计、小型高速离心机、CR22E 型高速冷冻离心机。 1.4.3.2 样品处理程序及方法 （1）取样称取25g 草莓（蓝莓）样本放入滤膜均质袋中，加入40ml TGBE 缓冲液，（取一份样本,1 标本前处理,作为阳性对照，可在这步加入诺如病毒的阳性质控球），以及30 单位果胶酶（Pectinase from Aspergilus niger, Sigma）。 （2）样品提取室温振荡孵育10min，测量pH
18、 值。若pH9.0；将流出液倒至离心管中（必要情况下使用2 个离心管），4，10000g 离心30min；上清移至一新管或瓶，用HCl(1M)调节pH 至7.00.5。,1 标本前处理,（3）样品富集浓缩加入1/4 体积的5PEG/NaCl 缓冲液，在4条件下，于振荡孵育器孵育60min；4，10000g 离心30min（必要情况下将液体分装于2 只离心管）。弃去上层溶液，4，再次10000g 离心5min 以使颗粒紧凑。弃去上层溶液，用500l PBS 重悬沉淀。如果一个样品分两管离心，则用同样体积PBS 依次重悬。将重悬液移至新的EP 管中，加入等体积的氯仿/丁醇溶液，涡旋混匀，室温孵育5
19、min。4，10000g 离心15min，小心将水相转移至新管待提取RNA。,1 标本前处理,1.4.4 生菜和苗芽菜 1.4.4.1 设备和材料食品均质器（可拆卸、可清洗、可高压灭菌）、电子天平（感量0.01g）、台式离心机（最高转速15000g）、微型离心机、电热恒温水浴锅（0-100）、涡旋振荡器、实时荧光PCR 仪、Roche，LightCycler480。 1.4.4.2 样品处理程序及方法 （1）同一批次的生菜或苗芽菜样品，随机抽取样品数不少于5件，并用灭菌处理的剪刀剪碎至,1 标本前处理,2.5cm2.5cm2.5cm 大小的形状，称量25g 放入带有滤膜均质袋一侧中，作为待试样
20、品。另称 取200g 样品放入50mL 离心管中，-80保存，留作备样，并做好标记。 （2）向上述均质袋中加入40mL TGBE buffer，均质器拍打混匀，尼龙扎带封口后，室温振荡约20min。 （3）将均质袋滤膜一侧液体倾入50 mL 离心管，4条件下10000g 离心30min。 （4）离心结束后，将上清转移至另一50 mL 离心管，加入1/4倍体积的5PEG/NaCl 溶液，室温条件振荡60min。,1 标本前处理,（5）振荡完毕，4条件下10000g 离心30min。 （6）离心结束，弃上清，继续4条件下10000g 离心5min 压实沉淀。 （7）向沉淀加入500L PBS 溶液
21、以溶解沉淀。吸取溶解沉淀后的PBS 溶液200L 转移至无菌离心管中，作为试样。剩余的溶液分装到离心管中标记作为备样，-80冻存。,2 核酸提取,各类样品经前处理后，每个样品分别取200ul，下面表格中提供的RNA提取试剂盒供参考，按试剂盒说明书操作提取RNA。,3 诺如病毒核酸检测方法,3 诺如病毒核酸检测方法,3.1 粪便、呕吐物、肛拭子、水、环境涂抹样 3.1.1 诺如病毒双重Real-time （TaqMan）RT-PCR 分析 3.1.1.1 使用范围：ABI 7500 realtime PCR、Smartcycler (Cepheid),Mx3005P, Mx3000P (Stra
22、tagene)和ICycler iQTM Real-Time PCR 检测系统(BioRad)等。 本设计应用QuantiTect Multiplex RT-PCR Kits (Qiagen)，引物和探针浓度分别被优化为终浓度400 nM 和200 nM。每个试剂盒特异的RT 最适环境和活化步骤，需要遵循制造说明书使用。,3 诺如病毒核酸检测方法,该试验方法来自美国CDC 诺如病毒暴发网络（CaliciNet USA）双重Real-time RT-PCR 操作标准，引物设计参考文献。 3.1.1.2 设备和材料涡流混合器、微量离心机、移液器（量程为P20、P200和P1000）、Real-ti
23、me PCR仪可以是ABI 7500 (ABI)、Smartcycler (Cepheid)、Mx3005P or Mx3000P (Strategene)或BioRad iCycler iQTM Real-Time PCR检测系统(BioRad)。一次性手套、带滤芯枪头、无菌 1.5ml 微量离心管、RNA酶去除剂、96-孔反应板、盖子或薄膜。,3 诺如病毒核酸检测方法,3.1.1.3 诺如病毒寡核苷酸引物/探针,* GI TaqMan探针：5端用FAM荧光素标记，3端用BHQ淬灭基团标记; BHQ淬灭基团1更好。,*GII TaqMan探针：5端用JOE（HEX 或VIC 等）荧光素标记，
24、3端用BHQ 淬灭基团标记。,3 诺如病毒核酸检测方法,3.1.1.4 操作方法 （1）实验准备 用RNA 酶去除剂擦拭工作台表面、移液器和离心机除去潜在的RNA 酶污染。Real time PCR 仪开机预热15 分钟。 （2）试剂准备 所有试剂冰浴。 轻弹管壁混合2QuantiTect Multiplex RT-PCR Master Mix反应液。 涡旋所有引物和探针5秒钟。 QuantiTect Multiplex RT Mix、引物、探针置于冰上。,3 诺如病毒核酸检测方法,（3）对照设立每一次实验都要包括无模板对照(NC)（第一个和最后一个孔各设一个）和阳性对照 (PC) （GI 和
25、GII 诺如病毒核酸或标准品）。 （4）检测注意：请在PCR清洁区准备、配制反应体系（master mix）。 在1.5 ml离心管中准备master mix。 确定每次分析的反应数(N)，需要多配反应数来弥补重复移液中的小量丢失： 如果样本数(n) （包括NC和VC对照）= 1 - 14, 做 n + 1 个反应的mix。,3 诺如病毒核酸检测方法,如果样本数(n) （包括NC和VC对照） 15, 做 n + 2 个反应的mix。 配制Real-time RT-PCR反应混合液22.5l（表2）,3 诺如病毒核酸检测方法,吸打混匀Master Mix。 按如下方式排列阴性对照、阳性对照和样品
26、，在每孔中加入22.5l Master Mix。,*阴性模板对照(NC) 加入第一列，样本加入后面的11列，检查加入样本时可能的交叉污染。病毒模板对照(PC在所有样本和NC密封后加入到最后。,3 诺如病毒核酸检测方法,加入2.5lDEPC水到第一个NC孔，盖好。 将反应平板转移到核酸处理区域或清洁区外面。 将RNA样本从-70C冰箱转移在冰上融化;漩涡振荡5秒钟之后快速离心5秒钟，移液2.5 l RNA样本到标记好的孔。例如, 加样本1(S1)到平板位置A2和B2。如果样本体积小于2.5 l, 加DEPC水至反应管使总反应体积达到25 l。 加2.5 l水到最后的NC孔，盖好。 最后, 移液G
27、I和GII诺如病毒阳性对照各2.5l到适当的PC孔，盖好。 小心混合平板。 4离心平板500rpm 1分钟，以移除孔中可能存在的气泡和液滴。,3 诺如病毒核酸检测方法, RT-PCR扩增条件：按照ABI 7500 (or other platform) 的说明书放置好平板。终反应体积为25l。根据QuantiTect Multiplex RT-PCRKits说明书，RT-PCR热循环程序为：,3 诺如病毒核酸检测方法,3.1.1.5 结果解释 （1）阴性对照（NC）如果一个或更多NC反应出现假阳性,则可能发生了污染。这种情况下,检测无效，需重复检测。 （2）阳性对照（PC）阳性对照产生超过阈值
28、的荧光曲线或扩增图像。 （3）检测样本只有在所有质量控制严格准确时，如果曲线在Ct 值为40，则认为检测样本为阳性。,3 诺如病毒核酸检测方法,3.1.2 诺如病毒传统RT-PCR 分析 3.1.2.1 原理人诺如病毒分为5 个基因组（Genogroup，G），其中GI、GII和GIV 型可感染人。本方案利用衣壳蛋白的部分区域（region C）来对诺如病毒进行分型。本方案由四个引物组成，扩增ORF2的5末端，编码主要外壳蛋白VP1。引物G1SKF 和G1SKR 用于GI 的检测，扩增片段330bp。引物和CoG2F 和G2SKR 用于GII 的监测，扩增片段387bp。,3 诺如病毒核酸检测
29、方法,3.1.2.2 设备与材料涡流混合器、微量离心机、移液器、PCR 仪、微波炉、电泳仪和制胶器。一次性手套、带滤芯枪头、无菌 1.5-ml 微量离心管、RNA酶去除剂、薄壁PCR 管（Rnase free，0.5ml）、Loading Buffer、Qiangen OneStep RT-PCR Kit（货号：210212）。 3.1.2.3 诺如病毒寡核苷酸引物/探针（见表3）,3 诺如病毒核酸检测方法,Y = C or T; H = A, C, or T; R = A or G; I = inosine; S = C or G; N =G, A, T, or C; W = A or T;
30、 K = G or T。,3 诺如病毒核酸检测方法,3.1.2.4 操作方法 （1）实验准备用RNA酶去除剂擦拭工作台表面、移液管和离心机以去掉潜在的RNA酶污染。 （2）试剂准备 所有试剂冰浴。 轻弹管壁混合5X缓冲液。 离心酶、RNA酶抑制剂和dNTPs后将其放在冰上备用。 涡旋所有引物5秒钟，离心5秒钟备用。,3 诺如病毒核酸检测方法,（3）对照设立每次PCR实验都应设置阴性对照和阳性对照，包括诺如病毒GI和GII，阳性对照为阳性粪便样品。 （4）检测注意：在PCR清洁区配置反应体系。用1.5 ml离心管准备反应体系。确定每次分析的反应数(N)，在操作需配置过量的反应体系来校正重复移液中
31、的小量丢失；见下面的样本: ,3 诺如病毒核酸检测方法,如果样本数(n) （包括NC和VC对照）= 1 - 14, 做 n + 1 个反应的mix。 如果样本数(n) （包括NC和VC对照） 15, 做 n + 2 个反应的mix。 将每个引物对按以下计算量添加到反应混合液中（表4和5）。,3 诺如病毒核酸检测方法,表4 诺如病毒Region C反应体系-Genogroup I,3 诺如病毒核酸检测方法,表5 诺如病毒Region C反应体系-Genogroup II,3 诺如病毒核酸检测方法,用移液管上下吹打混合液。 向每个反应管中分装20ul混合液。 设立阴性对照，加5ulDEPC水。 将
32、反应管转移到核酸处理区。 将病毒核酸在冰上融化，漩涡振荡5秒钟之后快速离心5秒钟。 移取5ul的RNA模板到每一个相应的反应管中。 最后加5阳性对照。 将所有的反应管放置在PCR仪上，按照下面的条件设置：,3 诺如病毒核酸检测方法,准备2%的琼脂糖凝胶，进行核酸电泳。 （5）解释如果阴性对照出现条带，说明可能出现污染，需重复实验。阳性对照在正确位置出现条带，则判定反应体系工作正常。,3 诺如病毒核酸检测方法,3.2 食品诺如病毒荧光定量PCR（RocheLightMix Kit NorovirusGG ,GG ,MS2 或等效的诺如病毒检测试剂盒） 3.2.1 反应体系及仪器设置 反应体系的添
33、加按下表：,3 诺如病毒核酸检测方法,具体的仪器设置为检测信号通道FAM 通道465nm-510nm，内参信号ROX 通道533nm-610nm，做分型的LC670 通道498nm-660nm，反应具体参数设置如下： （1）逆转录61，3min。 （2）预变性95，30s。 （3）PCR 循环，9510s，56 10s 收集信号，72 5s，45 个循环。 （4）溶解曲线，95 30s，40 2min，85 1s 收集信号。,3 诺如病毒核酸检测方法,3.2.2 诺如病毒荧光定量PCR 结果判读 实验结束后，分析结果，具体分析标准按下表进行。,3 诺如病毒核酸检测方法,在食品类的诺如病毒检测方
34、法中，通过诺如病毒质控样的加入作为外部质控以判断RNA 的提取过程是否正常；同时在RT-PCR 过程中还含有ROX荧光通道检测内部质控噬菌体pMS2，用以判断在PCR过程中是否含有PCR 抑制物质，如含有抑制物质扩增过程为阴性或扩增效率不高，正常则扩增为阳性。该试剂盒还含有与GII 产物结合的探针，用以区分诺如病毒的型别。如果扩增的结果为GII，则可以检测到探针信号，如果为GI 型则无信号。可以根据上表来对诺如病毒的检测结果进行判断。,4诺如病毒ELISA 检测方法 （粪便、呕吐物）,4.1 操作步骤（RIDASCREEN Norovirus 3rd Generation）： （1）将两滴（1
35、00l）阳性质控液Control+，标本稀释液 （阴性质控液）和10便悬液上清加入为微孔中。 （2）再分别加入2 滴（100l）生物素标记抗体标记物1 ，在充分混匀（轻轻振动微孔板边缘）后，室温(20-25)孵育60分钟。 （3）每孔加入300l 洗液，洗5 次，在吸水纸上拍干。 （4）微孔中加入2 滴（100 l）酶结合物标记物2 ，室温20-25孵育30 分钟。,Dilutent-,Conjugate1,Conjugate2,4.1 操作步骤（RIDASCREEN Norovirus 3rd Generation）： （1）将两滴（100l）阳性质控液Control+，标本稀释液 （阴性质
36、控液）和10便悬液上清加入为微孔中。 （2）再分别加入2 滴（100l）生物素标记抗体标记物1 ，在充分混匀（轻轻振动微孔板边缘）后，室温(20-25)孵育60分钟。 （3）每孔加入300l 洗液，洗5 次，在吸水纸上拍干。 （4）微孔中加入2 滴（100 l）酶结合物标记物2 ，室温20-25孵育30 分钟。,Dilutent-,Conjugate1,Conjugate2,4诺如病毒ELISA 检测方法 （粪便、呕吐物）,（5）每孔加入300l 洗液，洗5 次，在吸水纸上拍干。 （6）在每个孔中加入2 滴（100 l）的底物 。然后微孔板在室温（20-25）下避光孵育15 分钟。在每个微孔中
37、加入1 滴（50 l）终止液 以终止反应。轻微混合后（轻拍微孔板的边缘），用酶标仪测定在450 nm 的光波下测定吸光度。 （7）结果判定：将阴性质控所得吸光度值加上0.15 即为Cut-off值。样本吸光度值大于Cut-off 值10 % 视为阳性。样本吸光度值处于上述Cut-off 值 10 % 范围视为可疑，应重复检测。,Substrate,Stop,4诺如病毒ELISA 检测方法 （粪便、呕吐物）,重复测试新鲜粪便样本，结果仍在此区域，则视为阴性。样本吸光度值小于上述Cut-off 值+10 % 视为阴性。阴性样品还需按本指南“3.1.1 诺如病毒双重Real-time（TaqMan）RT-PCR 分析”检测确认。,谢谢,
