1、生物选修一,生物技术实践,课题1 果酒和果醋的制作 课题2 腐乳的制作 课题3 制作泡菜并检测亚硝酸盐含量,专题1 传统发酵技术的应用,一、果酒制作,1、酵母菌：,4、流程：选果冲洗榨汁发酵酒精,2、原理：,5、检验：酸性条件酒精遇重铬酸钾呈灰绿色,真菌、异养兼性厌氧型、繁殖最适温度20,（1）前期需O2,（2）后期不需O2,3、发酵条件：,1825,二、果醋制作,1、醋酸菌：,2、原理：,（1）氧气、糖源都 ：醋酸菌将葡萄汁中的 分解成 。 （糖制醋） （2）氧气充足、糖源不足：醋酸菌将 乙醛 。 （酒变醋）果酒制作果醋的反应式为:。,充足,糖,醋酸,乙醇,醋酸,3、条件：,最适温度为303
2、5，需要充足的氧气。,4、流程：选果榨汁酒精发酵醋酸发酵,原核、异养需氧型,思考讨论：,（1）装置中充气口、排气口和出料口分别有哪些作用？,（2）为什么排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接？,（3）为什么发酵瓶中只装入2/3的液体？,其目的是先让酵母菌有氧呼吸快速繁殖，耗尽氧气后再进行酒精发酵；其次，防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液的溢出。,充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气 排气口：排出发酵时产生的CO2，以免发酵瓶爆裂。 出料口：用来取样。,排气管长而弯，可防止空气中微生物的污染。,三、腐乳制作,1、毛霉（主要）：,让豆腐长出毛霉加盐腌制加卤汤装瓶密封腌制,2、原理：,5、盐与
3、酒的作用：抑制微生物生长,毛霉等产生的蛋白酶、脂肪酶分解豆腐成小分子肽、氨基酸、甘油、脂肪酸。,3、温度条件：,1518,真菌、异养需氧型,4、流程：,四、泡菜制作,1、乳酸菌：,3、流程：,2、原理：,原核、异养厌氧型,4、亚硝酸盐及其含量测定：,（1）测定亚硝酸盐含量的方法：,比色法,（2）测定亚硝酸盐含量的原理：,在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，再与N-1萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红染料，通过目测比较，大致估算其含量。,专题2：微生物的培养与应用,一、培养基：,1、概念：,2、成分,培养基（培养液）是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养
4、基质。,水 无机盐 碳源 (提供碳元素的物质） 氮源（提供氮元素的物质,注意：培养基还需要满足微生物对PH、特殊营养物质以及氧气的需求。,课题1:微生物的实验室培养,3、类型,液体培养基固体培养基,选择培养基：在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长。,鉴别培养基：在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物。,例如，在培养基中加入青霉素，以抑制细菌、放线菌的生长，从而分离到酵母菌和霉菌。又如，在培养基中加入高浓度的食盐可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长。,根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成
5、，用以鉴别不同种类的微生物。例如，在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌：如果有大肠杆菌，其代谢产物就与伊红和美蓝结合，使菌落呈深紫色，并带有金属光泽。,较为温和的物理或化学方法,强烈的理化因素,仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）,杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子,煮沸消毒法、 巴氏消毒法、 化学药剂消毒法、紫外线消毒法等,灼烧灭菌、 干热灭菌、 高压蒸汽灭菌,二、无菌技术,泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法,灭菌的方法：,back,三、微生物培养技术,（一）实验操作步骤（以培养大肠杆菌为例）：1、制备培
6、养基,（1）计算 （2）称量 （3）溶化（注意取出称量纸） （4）灭菌:高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121，灭菌1530min。 （5）倒平板:待培养基冷却到50 左右时，在酒精灯附近倒平板。2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种。,倒平板技术,2、纯化大肠杆菌：,平板划线法和稀释涂布平板法,在培养基上将细菌逐步稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是一个纯化的细菌菌落。,*菌落是鉴定菌种的重要依据。,（1）原理：,（2）常用接种方法：,菌落,2.稀释涂布平板的操作方法,四、菌种的保存方法,1、临时保藏：接种到试管的固体斜面培养基，待长出菌落后放4的冰箱保藏 2、
7、长期保存：甘油管藏,一、实验室中微生物筛选的原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。,二、分离能够分解尿素的细菌的培养基：,以尿素作为唯一氮源,课题2:土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,三、统计菌落数目：,2、间接计数法（活菌计数法）,利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点是不能区分死菌和活菌。,1、显微镜直接计数法,当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。,（1）常用方法：,（2）原理：,
8、稀释涂布平板法,（3）操作：,设置重复组，增强实验的说服力和准确性。,为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。,（4）计算公式：,每克样品中的菌株数 （CV）M C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V：涂布平板时所用的稀释液的体积（ml) M：稀释倍数,四、细菌分离与计数的实验流程：,土壤取样,样品的稀释,取样涂布,微生物的培养,细菌的计数,观察并记录结果,一.纤维素与纤维素酶,课题3:分解纤维素的微生物的分离,1.纤维素纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。,2.纤维素酶,纤维二糖,C1酶、Cx酶,葡萄糖苷酶,葡萄糖,纤维素,
9、纤维素酶（复合酶）,二.纤维素分解细菌的筛选： 1.方法：刚果红染色法。 2.原理：刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 3.优点：该方法可以通过颜色反应直接筛选。,三.实验设计：,注意：分解纤维素的微生物的分离可用以纤维素为唯一碳源的选择培养基。,（应选择富含纤维素的环境）,一、菊花组织的培养 1、原理：植物细胞的全能性 2、步骤：（1）制备MS固体培养基（灭菌）无机盐、维生素、蔗糖、激素（2）外植体消毒（未开花新生侧枝）（3）接种（4）培养（5）移栽（6）栽培,专题3
10、 植物组织培养技术,培养条件：PH5.8、温度18-22、每日光照12h,3、过程：,根、芽 （胚状体）,4、不同植物激素使用顺序和使用量,有利于分裂但不分化,细胞既分裂也分化,分化频率提高,有利于根的分化，抑制芽的形成,有利于芽的分化， 抑制根的形成,促进愈伤组织生长,二、月季花药培养 1、花药选取： 2、花粉发育检查： （1）醋酸洋红法（细胞核红色） （2）焙花青-铬矾法（细胞核蓝黑色） 3、培养过程：,初花期、未开放花蕾、单核期,注意：两条途径之间没有绝对的界限，主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。,一、果胶酶在果汁生产中的应用,专题4：酶的应用,果胶酶可水解果胶，瓦解植物的细胞壁
11、和胞间层。,二、酶的活性与影响酶活性的因素,酶活性是指酶催化一定化学反应的能力。,酶活性的高低可以用在一定条件下，酶所催化的某一化学反应的反应速度来表示。,酶反应速度用单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的增加量来表示。,影响酶活性的因素：,温度、PH和酶的抑制剂等条件,二、加酶洗衣粉的洗涤效果 1、定义: 加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉。 2、酶制剂：用特殊化学物质包裹酶，使之耐酸碱、耐高温、忍受表面活性剂 3、酶制剂的种类： 蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶，其中效果最明显的是碱性蛋白酶和碱性脂肪酶 4、作用：分解污渍（蛋白质、脂肪、淀粉、纤维素）,三、固定化酶 1、原理：2、高果
12、糖浆生产： （1）原理： （2）固定化酶：（3）生产过程：,把酶固定在颗粒状的载体上，易于催化回收、重复使用,酶固定在载体上、装入反应柱,上端注入葡萄糖，柱内酶催化，下端生产果糖浆,固定化酶和固定化细胞是利用理化方法，把酶或细胞固定在一定空间内发挥作用的技术。,四、固定化细胞,2、方法：,（1）包埋法：包埋在多孔载体里 （2）化学结合法：结合到载体上 （3）物理吸附法：吸附到载体表面,1、概念：,注意：一般来说，酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定化，而细胞多采用包埋法固定化。,3、固定化酵母细胞 （1）酵母细胞活化：1g干酵母+10ml水 （2）配制CaCl2溶液：0.05mol/L （3）
13、配海藻酸钠溶液：0.7g海藻酸钠+10ml水 （4）海藻酸钠溶液与酵母细胞混合成A液（吸入注射器） （5）固定化酵母细胞：把A液滴入CaCl2形成凝胶珠 （6）冲洗凝胶珠（蒸馏水） （7）酒精发酵：凝胶珠+葡萄糖液酒精（25度）,专题5 DNA和蛋白质技术,一、DNA的粗提取与鉴定,（一）实验原理,1.血细胞在蒸馏水中易吸水而导致细胞膜和核膜的破裂。利用此特性可得到含有DNA的溶液。,2.DNA在不同浓度的氯化钠溶液中溶解度不同，在0.14 molL的氯化钠溶液中的溶解度最低。利用这一原理，可使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。,3.DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这
14、一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。,4.DNA遇二苯胺（沸水浴）会变成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。,（二）实验设计,1、实验材料的选取,选用DNA含量相对较高的组织（如鸡血细胞）,2、破碎细胞，获取含DNA的滤液,动物细胞：加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液,植物细胞：需要先用洗涤剂溶解细胞膜,3、除去滤液中的杂质,原理：,方案一：（高中实验室较常用）,DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同。,过程：利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质。具体做法是：在滤液中加入NaCl ，使NaCl溶液浓度为2mol/
15、L，过滤除去不溶的杂质，再加入蒸馏水调节NaCl溶液浓度为0.14mol/L ，析出DNA，过滤去除溶液中的杂质，再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。,方案二：直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10-15min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质。,方案三：将滤液放在60-75的恒温水浴箱中保温10-15min，注意严格控制温度范围。,4、DNA的析出与鉴定,与滤液体积相等的冷却的酒精溶液(体积分数95)， 静置23min，溶液中会出现白色丝状物粗提取DNA。,1、DNA的析出,2. DNA的鉴定,试剂：,条件：,二苯胺（现配现用）,沸水浴条件下， DNA遇二苯胺被染成蓝色,沸水浴,现象：,D
16、NA模板； 分别与两条模板链相结合的两种引物； 四种脱氧核苷酸； 耐高温的DNA聚合酶； 控制温度，但不需解旋酶； 缓冲溶液,二、PCR技术 1、反应条件：,3,5,3,5,3,3,3,3,3,3,3,3,5,5,5,5,5,5,5,5,2、过程： （1）变性： 95DNA解旋为单链 （2）复性： 55引物与模板配对 （3）延伸： 72合成子链,注意：DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。,三、血红蛋白的提取和分离,1、分离方法：,（1）凝胶色谱法（分配色谱法）,原理：,根据相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法。,不同蛋白质通过多孔凝胶通道时：大分子路程短、流动快先收集小分子路程长、流动
17、慢后收集,（2）电泳法,原理：,利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,2、血红蛋白的提取：,分四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定,样品处理：（1）红细胞的洗涤：生理盐水-除杂蛋白（2）血红蛋白的释放：蒸馏水-40%甲苯（3）分离血红蛋白溶液：离心分层第3层红色透明液体，是血红蛋白的水溶液。 粗分离：透析：除去样品中相对分子质量较小的杂质。 纯化：一般采用凝胶色谱法对血红蛋白和其他杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化。 纯度鉴定：一般用SDS-聚丙烯
18、酰胺凝胶电泳法来测定蛋白质的分子量，即对血红蛋白进行纯度鉴定。,（2011广东理综，5）以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是（ ） A.洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂 B.猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少 C.血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测 D.在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢,D,将无根的非洲菊幼苗转入无植物激素的培养基中，在适宜的温度和光照等条件下培养一段时间后，应出现的现象是( ),B,下列关于纤维素分解菌分离实验的说法不正确的是（ ） A通常采用刚果红染色法筛选纤维素分解菌 B当纤维素被分解菌分解后，培养基中会出
19、现透明圈 C该实验选择培养用的培养基为液体培养基 D在用刚果红染色时只能先培养微生物再加入刚果红，不能在倒平板时加入,D,下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是（ ） A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白膝培养基，经高温、高压灭菌后倒平板 B取104、105 、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1ml，分别涂布于各组平板上 C将实验组和对照组平板倒置，370C恒温培养24-48小时 D确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数,D,某同学进行“加酶洗衣粉和普通洗衣粉的洗涤效果比较”课题研究。下列叙述错误的是( ) A设计对照实验，分别使用蛋白酶洗衣粉和复合酶洗衣粉
20、 B洗衣粉用量、污渍种类和洗涤温度等无关变量全部相同且适宜 C根据相同时间内污渍去除程度的差异得出实验结论 D根据污渍完全洗净所需时间的差异得出实验结论,A,酶制剂、固定化酶、固定化细胞已经广泛地应用于各个领域，下列有关叙述错误的是( ) A90高温会使Taq DNA聚合酶失去催化活性 B制备固定化酶的方法主要有包埋法、交联法和吸附法等 C固定化酶固定时可能会造成酶的损伤而影响活性 D固定化细胞可以催化一系列酶促反应,A,某个DNA分子的碱基总数中腺嘌呤为200个，利用PCR技术 循环数次后，消耗周围环境中腺嘌呤脱氧核苷酸3000个，该DNA分子已循环了几次？（ ） A.三次 B.四次 C.五
21、次 D.六次 在DNA粗提取过程中，先后两次向烧杯中加入蒸馏水的作 用分别是（ ） A稀释血液；冲洗样品 B.使血细胞破裂；降低NaCl浓度使DNA析出 C使血细胞破裂；增大DNA溶解量 D使血细胞破裂；提取含杂质较少的DNA,B,B,下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述不正确的是（ ）A. 样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液B. 通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取C. 可通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即样品的纯化D. 可通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度,B,下列有关果酒、果醋和腐乳制作的叙述，正确的是( ) A参与果酒发酵和果醋发酵的微生物都含有线粒体 B果酒制成后只需将装置转移至温度较高的环境中即可制作果醋 C在腐乳制作过程中必须有能生产蛋白酶的微生物参与 D在腐乳装瓶时自下而上随层数的增加逐渐减少盐量,C,
