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1、第9章 生物分析,Another World,内 容,DNA电泳琼脂糖凝胶电泳 DNA序列分析双脱氧核苷酸链终止法 DNA的扩增聚合酶链式反应(PCR) 蛋白质水平的测定western blot 细胞活力测定MTT法 细胞凋亡分析荧光法、DNA电泳法,一、DNA电泳,DNA分子中的磷酸基团带负电荷，在电场中将向正极移动，通过凝胶的分子筛作用可以将不同大小的DNA分子分离，分子量小的DNA，具有较紧密的构型，在凝胶中移动快；反之，分子量大的DNA移动慢。,原理：,(一) 凝胶电泳的种类和在DNA分离中的用途,形形色色的电泳装置,垂直板电泳，适用于聚丙烯酰胺凝胶,水平板电泳，适用于琼脂糖凝胶,(二

2、) 琼脂糖凝胶,琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，其熔点为90度左右，凝固点为4045度左右。因此，将含适量固体琼脂糖的溶液加热至沸，即可使琼脂糖完全溶解得清亮透明溶液，把它浇在模板上冷却后固化就可形成凝胶泳道。不同浓度的凝胶，可获得不同大小的孔径，就可分离不同大小的分子。 优点：琼脂糖凝胶电泳一般采用平板式，制板和操作简便；电泳速度快，样品扩散较少。适用于分离分子量较高的DNA。,琼脂糖凝胶电泳的基本过程,材料：电泳缓冲液、电泳级琼脂糖、溴化乙锭溶液(DNA显示剂)、加样缓冲液(保证核酸不在加样孔中扩散和用于电泳时间的指示系统)、水平凝胶电泳装置及制胶系统、直流电源系统、凝胶成像系统。 基

3、本过程：制胶 放入电泳槽中并加入电泳缓冲液 取出梳子 将适量的DNA样品和上样缓冲液混合并上样于加样孔中 一定电压条件下电泳 合适的时间后停止电泳 取出凝胶进行溴化乙锭染色 凝胶成像系统(紫外灯下观察并照相保存结果) 注意：溴化乙锭具有致癌性，操作时要带手套,核酸电泳的染色剂和指示剂, 指示剂 在电泳过程中，常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程。常用的指示剂有溴酚蓝、二甲苯青蓝。, 染色剂溴化乙锭(ethidium bromide, EB)是一种扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。在适当的染色条件下，荧光的强度是同DNA

4、片断的大小(或数量)成正比的。EB是一种强癌诱变剂，见光易分解。,2%琼脂糖凝胶电泳结果, 采用一定的方法确定待测DNA片段上的核苷酸顺序，也就是测定DNA分子上A、T、G、C的排列顺序密码翻译机。,什么是DNA序列分析？,二、DNA序列分析,研究历史,由于发明了DNA序列分析方法，Sanger、Maxam和Gilbert分享了1980年诺贝尔化学奖。,基本原理：,DNA聚合酶能以2,3双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)作底物，取代正常所需的2-脱氧核苷三磷酸(dNTP)直接掺入到新合成的DNA链的末端。但由于ddNTP无3羟基(-OH),不能与下一个核苷三磷酸形成正常的35磷酸二酯键，所以发生特

5、异性的链终止效应，DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列。,(一) 双脱氧核苷酸链终止法,(A),ddNTP的两个作用： 1.可以当作正常碱基参与复制； 2.一旦掺入DNA链中，其后就不能再继续连接其它碱基。,基本过程：,(1)制备ss-DNA，与引物退火杂交，新链合成反应。反应混合物包括：待测DNA(顺序未知)+寡聚核苷酸引物(顺序已知)+dNTPs(四种核苷三磷酸的混合物，dATP常带同位素标记)。以下分四管进行。 (2)分别加入ddATP+DNA聚合酶、ddCTP+DNA聚合酶、ddGTP+DNA聚合酶、ddT

6、TP+DNA聚合酶，其中DNA聚合酶使DNA链合成延伸，而ddNTP做抑制剂随机终止链延伸。 (3)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA片段。 (4)凝胶干燥、放射自显影、读序。,Electrophoresis 电泳,negative,positive,Template DNA sequence is 3TACAGTCAGGTC5,ddATP,ddTTP,ddCTP,ddGTP,5,3,(三) DNA自动测序法,采用荧光替代放射性同位素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷三磷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳(平板电泳或毛细管电泳)分离后，通过四种激光激

7、发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。,基本过程：,4. Fragments move off gel in size order; pass through laser beam,5. Color that each fragment fluoresces is recorded on printout.,DNA自动测序结果举例:,三、DNA的扩增聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction (PCR),发明历史,在PCR发明前，人们对DNA的复制、转录和翻译已经研究得比较清除。1)DNA的变性和

8、复性。2)至二十世纪80年代，寡核苷酸小片段的DNA已能人工合成并也已用作探针。3)1986年，已能用离体系统高效合成DNA，沃森还知道了寡核苷酸可作为引物，合成特征序列。 1987年，为美国西特斯公司工作的穆里斯将当时的一些研究成果结合起来，发明了PCR技术。穆里斯也因此发明而获得了1993年的诺贝尔化学奖。,(一) 什么是PCR？,DNA体外扩增方法的一种，能够将很少的试样(比如只有罪犯的一滴血)，扩增成完全相同的无数拷贝。,以DNA变性、复性、互补链聚合为基础，通过DNA加热变性、引物与模板DNA一侧的互补序列退火杂交、耐热性DNA聚合酶催化引物延伸等的多次循环，获得大量待扩增的特异性D

9、NA片段。,1.基本原理：,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,一个DNA经n次扩增后, 可变为2n个分子。理论上经过30次循环，靶DNA得到109倍的扩增，实际是1067倍的扩增。因此，通过PCR可以使靶DNA在数小时内扩增上百万倍！,2.基本反应步骤:,变性 94C,延伸 72C,退火 Tm-5C,2530,加热至94，底物双链DNA变性为两条单链DNA，作为互补链聚合反应的模板,降温至55，使两种引物分别与模板DNA链的3端的互补序列杂交(退火),升温至72，耐热性DNA聚合酶催化引物按53方向延伸，合成模板DNA的互补链。,重复以上过程，经过2

10、530个循环,PCR 仪(基因扩增仪),(二)逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR),RT-PCR是将mRNA逆转录为DNA，然后再用常规的PCR技术进行定性或定量分析的一项技术。主要用于mRNA的PCR扩增，以详细研究各种因素对基因表达的影响。,Oligo(dT)15,Exponential amplification,PCR,AGAROSE GEL ELECTROPHORESIS,(三)实时荧光定量PCR技术 (Real-time quantitative PCR),通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及

11、定性的分析。,原理：在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。,平台期,荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段,四、蛋白质水平的测定western blot,原理：也称蛋白免疫印迹技术。将经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体

12、起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的靶蛋白的水平。可检测到低至15ng(最低可到10-100pg)、中等大小的靶蛋白。,(一) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，SDS-polyacrylamide gel electrophoresis),使用含有去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)和还原剂(通常为巯基乙醇)的样品处理液对蛋白质样品进行处理(一般煮沸3-5min)，通过加热使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时，还原剂可以切断蛋白质中的任何一个二硫键(使二硫键还原)。 电泳时，SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白

13、质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。 SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。,(二) Western blot 的过程,0h 4h 8h 16h,Western Blot analysis of cytochrome C release,Cyto-C,五、细胞活力测定MTT法,原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT 还原为难溶性的蓝紫色晶体，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲亚砜(DMSO)能溶解生成的蓝紫色晶体，然后用全自动酶标仪测定570nm的吸光度，可间接反应活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与活细胞数成正比。

14、优点：此法简便快捷、灵敏度高，所需细胞数较少，便于大规模进行药物敏感试验，目前已广泛用于临床前抗癌药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。,MTT：3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,MTT法测细胞活力基本过程,制备单细胞悬液 接种96孔板 进行实验处理如加药、照射等 每孔直接加入0.5mg/mL MTT；作用4 h后，小心弃去培养基，每孔加入100L DMSO溶解紫色晶体，于570nm测吸光度 统计处理数据,试验结果以细胞存活率表示：,细胞凋亡(apoptosis)，或称为程序性细胞死亡(programmed cell death) ，是指细胞在基因调控下按一定

15、程序主动地走向死亡的过程，它调节着机体细胞增殖与死亡的平衡，维持组织器官正常生理功能和细胞数量的稳定。某些致病因子可以使细胞凋亡的基因调控失常，引起细胞凋亡的增强或减弱，从而破坏机体细胞的自身稳定状态，导致疾病的发生和发展。因此，细胞凋亡是贯穿整个生命活动过程的一种普遍存在的生物现象，不仅存在于正常组织和器官，也存在于各种疾病组织中。,六、细胞凋亡分析,细胞凋亡与坏死(necrosis),细胞凋亡过程中，细胞质膜反折，包裹断裂的染色质片段或细胞器，然后逐渐分离，形成众多的凋亡小体（apoptotic bodies），凋亡小体则为邻近的细胞所吞噬。整个过程中，细胞质膜的整合性保持良好，死亡细胞的

16、内容物不会逸散到胞外环境中去，因而不引发炎症反应。 细胞坏死是细胞受到强烈刺激被动死亡的过程。在细胞坏死时，细胞质膜发生渗漏，细胞内容物，包括膨大和破碎的细胞器以及染色质片段，释放到胞外，导致炎症反应。,细胞核：细胞核固缩，染色质密度增加并聚集在核膜周边，DNA断裂为180200bp及其倍数的、末端为3-OH的寡核苷酸片段，琼脂糖凝胶电泳中呈特征性梯形DNA条带。 细胞膜：凋亡早期细胞膜还是完整的，但位于膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)会从细胞膜的内侧翻转到外侧。凋亡晚期细胞膜完全破损。 细胞：细胞皱缩，胞浆内出现空泡，细胞膜内陷将细胞分割为多个外有膜包裹，内有完整细胞器的凋亡小体(apoptosi

17、s bodies)。,细胞凋亡的特征:,(一)激光共聚焦荧光显微镜(Confocal)观察凋亡细胞形态,吖啶橙(AO) 碘化丙啶(PI) Hoechst 33258和Hoechst 33342 TUNEL Annexin V/PI 荧光双染,AO与DNA和RNA通过两个部位结合，碱基对和磷酸盐基团。AO与碱基对结合，形成第一复合物。第二复合物在多核苷酸表面，由AO与磷酸盐基团连接而成。AO染色后、488nm激发，荧光显微镜观察到细胞核DNA为黄色或黄绿色荧光，细胞质和核仁的RNA为桔黄或桔红色荧光。细胞凋亡时，细胞核可见致密浓染的黄绿色荧光。,1.吖啶橙(AO),2.碘化丙啶(PI),PI的特

18、性：可以同时标记出双链的DNA和RNA，标记反应速度快，简单易行；不能进入完整的细胞膜，因此可用来检验细胞的死活。 PI的应用：当标记活细胞样品时，可检查细胞膜的完整性及其坏死情况，常用于检测膜损伤、细胞凋亡；标记固定细胞时，可进行细胞核定位、显示染色体形态、定量测定核酸等，常用于检测细胞周期、细胞凋亡、RNA和DNA在细胞内的分布及其含量变化以及用作核酸显色剂。,用PI标记细胞的方法,PI溶液：蒸馏水配制成1mg/ml浓度的储备液，避光4保存。使用时用PBS稀释成终浓度为110g/ml的工作液。,操作步骤： 样品为活细胞时：细胞用PBS洗3次，直接加入PI工作液，室温避光放置515min后，

19、再用PBS洗3次去除过量的PI染料。confocal检测，激发光为543nm，检测的发射光大于590nm。细胞膜完好的正常活细胞，PI不能染色；膜破损的死细胞则可检测到PI的红色荧光。该项检测最好在短时间内完成，因PI也有一定的细胞毒性，长时间接触会损伤正常活细胞而进入细胞内，造成实验假象。 样品为固定细胞时：用新鲜配置的固定液室温固定细胞30min以上，弃去固定液，用PBS洗细胞3次，余下操作同上。结果观察到细胞核均发出红色荧光。,固定细胞PI荧光标记,探针的特性： DNA特异性的荧光染料，专一的与DNA结合，细胞毒性小。与DNA结合后以366nm紫外光激发，发射明亮的蓝色荧光，分辨率高。

20、应用：检测细胞凋亡； DNA的定量检测，作为细胞增殖活性的指示剂； 测定细胞数量、染色体分型； 定量PCR扩增产物； 区分DNA发夹构型中的平行区和反平行区； 判定细胞周期，然后将细胞群分类；追踪观察体内细胞的迁移、精子的结合位点、卵原核的变化。其中，Hoechst 是标记活细胞DNA最常用的荧光探针。,2. Hoechst 33258和Hoechst 33342,用Hoechst 33258标记细胞的方法,操作步骤： 样品为活细胞时：用PBS洗细胞3次，加入Hoechst33258工作液在37避光负载30min，PBS洗3次以去掉多余的荧光染料。样品用confocal观察，激发光为364nm

21、、351nm紫外光，检测的发射光为44020nm，观察到细胞核发蓝色荧光。 样品为固定细胞时：用新鲜配置的固定液室温固定30min以上，吸除固定液，用PBS洗3次，余下操作同上。,Hoechst 33258溶液：蒸馏水配制成1mg/ml浓度的储备液，避光4保存。使用时用PBS稀释成终浓度为15g/ml的工作液。,正常细胞,凋亡细胞,3. TUNEL (TdT介导的dUTP缺口末端标记),原理：细胞凋亡时DNA双链断裂或一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3-OH末端，可在脱氧核苷酸末端转移酶(terminal-deoxynucleotide transferase ，TdT)作用下，与脱氧核

22、糖核苷酸衍生物地高辛-11-dUTP形成异多聚体，该异多聚体可与荧光素FITC标记的抗地高辛结合。当遇到波长为488nm的激发光时，荧光素产生波长为523nm的绿色荧光，从而可用confocal观察。 TUNEL方法的灵敏度高，特异性强，是现在最常用的测定细胞凋亡的方法。,TUNEL原理示意图,O,H,Hoechst33285染色,TUNEL染色,4. Annexin V/PI 荧光双染,细胞凋亡早期膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)会从细胞膜的内侧翻转到外侧，暴露到细胞外环境中。而annexin V是一种Ca2+依赖性的磷脂结合蛋白，对PS有高度的亲和性，因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞

23、膜表面的PS。 PS转移到细胞膜外不是凋亡所独有的，也可以发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别在于，凋亡的早期细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被碘化丙啶(PI)着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会被PI着染。 因此，用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的annexin和PI结合的双染法，可分辩细胞早期凋亡、晚期凋亡和坏死。,原理：,I: Annexin V,II: PI,I和II叠加,无荧光细胞为正常细胞； 仅有绿色荧光为早期凋亡细胞； 绿色和红色荧光均有为晚期凋亡或坏死细胞。,(二)流式细胞仪(Flow Cytometry

24、)分析细胞凋亡比例,1.碘化丙啶(PI)染色分析,细胞经药物作用一定时间后，0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，PBS洗2次，离心去除PBS，加入预冰冷的70的乙醇，在-20下固定过夜。固定后的细胞用PBS洗2次，加入10g/mL PI和100g/mL无DNase的RNase，4避光染色半小时，用流式细胞仪测定PI的红色荧光强度。细胞凋亡时，因DNA断裂和细胞核固缩导致PI染色荧光降低，在流式细胞分析中形成亚二倍体峰，亚二倍体峰所占比例即为凋亡细胞比例。,Control,7.00%,49.05%,50mol/L Triol,PI染色、流式细胞仪定量分析Triol对钙化VSMCs凋亡的影响。亚二倍体

25、峰所占比例(M1)即为凋亡细胞百分比。,绿色荧光强度,红色荧光强度,流式细胞仪分析骨髓基质细胞凋亡过程中的FITC-Annexin和PI染色,2. FITC-Annexin和PI染色分析,原理：细胞发生凋亡时，内源性核酸内切酶将核小体间的连接DNA降解，形成长度为180200bp整数倍的寡聚核苷酸片断，在DNA琼脂糖凝胶电泳时呈现特征性“梯状条带(ladder)”。而细胞坏死时DNA随意断裂为长度不一的片断，琼脂糖凝胶电泳呈“弥散状”。,(三)DNA电泳法分析细胞凋亡,细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1细胞色素c诱导0 h 2细胞色素c诱导1 h 3细胞色素c诱导2 h 4细胞色素c诱导3

26、 h 5细胞色素c诱导4 h 6阴性对照 7Marker（ 自赵允、翟中和）,Confocal技术的应用,一、原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构,在细胞原位检测核酸 在细胞原位检测蛋白质和抗原等 检测细胞凋亡 观察细胞骨架 细胞器观察及检测 检测细胞间隙连接通讯 ,(一)细胞原位检测蛋白质和抗原等,1.免疫荧光标记蛋白质、抗原,荧光探针：FITC是检测细胞总蛋白最常用的荧光探针，同时它又能广泛的标记各种特异性的配体，如用FITC标记的抗体可检测细胞表面抗原，而用FITC标记的激素、生长因子和神经递质可准确的检测细胞相应的特定受体。FITC经488nm激发光激发后发出绿色荧

27、光。,标记方法： 直接法：直接用荧光探针标记的抗体与组织或细胞中相应蛋白质或抗原结合 间接法：首先用未标记的一抗与组织中的蛋白质或抗原相结合，然后再用荧光探针标记的二抗结合一抗，从而显示了蛋白质或抗原的位点,间接免疫荧光标记示意图,Fig. 7-Ketocholesterol induces reversible cytochrome c release from mitochondria. In control SMCs immunofluorescence of MitoTracker Green (A) and cytochrome c (B) showed an orange colo

28、r in the overlay (C), demonstrating co-localization of cytochrome c and the mitochondrial marker. SMCs treated with 25 M 7-ketocholesterol for 16 h showed shrinking, increased peri-nuclear clustering of the mitochondria (D) and diffuse cytoplasmic cytochrome c staining (E) outside the mitochondria (

29、E F, arrow heads).Seye CI, et al. Cardiovascular Research, 2004, 64:144153,2.检测荧光蛋白,绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP, 27kD) 是一种水母的代谢产物，是水母散发荧光的来源，它在受到紫外光或蓝光激发时，均可发出绿色荧光。从1994年起， GFP在跟踪活组织或细胞内基因表达及蛋白质定位等研究中得到广泛应用。,由于GFP是由一小段DNA序列所编码，易于操作和构建各种各样的融合体，因此，将目的基因与GFP DNA 相连，GFP可作为目的基因的报告基因实时监测目的基因的表达。

30、,目前使用的其他一些荧光蛋白包括蓝色荧光蛋白(BFP)、蓝绿色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)，都是GFP的衍生物。,First discovered in Aequorea jellyfishGFP absorbs blue & emits green fluorescenceGFP has a chromophore,Green Fluorescent Bunny,“Alba”, an albino rabbitDOB: Feb, 2000 in FranceShe is white with pink eyes,When illuminated with blue light

31、(488nm) She glows with a bright green light (509nm),http:/www.ekac.org/gfpbunny.html,3D Structure of GFP,GFP主要应用: 对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中或外界刺激因子的作用下的时空表达, 如某种转录因子的核转位、蛋白激酶C的膜转位等。GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞, 可动态观察该分泌蛋白分泌到细胞外的过程GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连，就能显 示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的结构及病理过程

32、 可用于观察分子的运动 蛋白质之间的相互作用 蛋白质的构象变化,Application 1: Nuclear translocation of green fluorescent protein-nuclear factor B in living cells,Fig. The construction of GFP-p105 (p50/IUBQ). p105 was fused at its N-terminus to the GFP in pCMX-SAH/Y145F.,Fig. Confocal images of GFP-p105 chimeric proteins at 37. Fl

33、uorescence pseudo-color images of the GFP-p105 transfected in a COS-7 cell before (A) and 20 min after (B) stimulation with hydrogen peroxide (250 M), respectively.,Tenjinbaru K, et al. FEBS Letters, 1999, 444:14,A,B,(二)观察细胞骨架,肌动蛋白(actin)是构成微丝的基本成分。鬼笔环肽能与多聚体肌动蛋白微丝专一性结合且亲和作用强烈。若将鬼笔环肽用FITC标记，则可以通过其荧光图

34、像显示出细胞内微丝的结构与分布、以及含量的变化。 间接免疫荧光的方法可以显示细胞内微管蛋白(tubulin)。例如，用兔抗微管蛋白抗体(一抗)与细胞温育，该抗体将与细胞内微管特异结合，然后用FITC标记的羊抗兔IgG(二抗)与一抗结合，即可显示细胞内微管蛋白的网络分布,微管和微丝是细胞骨架的重要组成部分,正常的间期细胞和有丝分裂细胞纺锤体组装,F-actin,Tubulin,DNA,Overlay,F-actin,Tubulin,DNA,Overlay,通过多荧光标记技术同时显示出细胞内骨架,微管和微丝是细胞骨架的重要组成部分，在有丝分裂时，微管解聚并重新聚合成纺锤体。如右图所示，正常的纺锤体

35、应该是对称的两极，染色体排列在中间。,二、活体细胞或组织功能的实时动态监测,实时定量测定细胞内Ca2+的变化 检测细胞内活性氧物种的产生 测定细胞内pH变化 检测细胞质膜和线粒体膜电位的变化 检测荧光共振能量转移,检测细胞内活性氧物种(ROS)的产生,荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS的原理：不发光的DCFH-DA进入细胞，被细胞内酯酶水解后生成不发荧光的DCFH, DCFH被细胞内的过氧化氢、羟自由基及过氧化硝基等ROS氧化形成DCF，DCF被激发后可发出绿色荧光，反映了胞内上述胞内ROS水平的变化。,用DCFH标记细胞内ROS方法,DCFH-DA溶液：用无水DMSO(进口)配制成1mg

36、/ml浓度的储备液，分装后避光-20保存。使用时用Krebs Ringer 缓冲液稀释成工作液。,操作步骤： 用PBS洗细胞3次，加入含5g/ml DCFH的Krebs Ringer 缓冲液，在室温下避光负载20min。用PBS洗3次去除多余的荧光物质，confocal随机扫描视野内所有细胞的荧光，每个样品扫描8个视野。用显微镜自带软件分析每个视野内所有细胞(40个细胞)的荧光强度，取它们的平均荧光强度。用8个视野平均荧光强度的平均值间接表示胞内ROS水平。 *DCFH光敏，样品不能在镜下用汞灯照射及观察，必需在完全黑暗的环境下观察,离心分离技术,用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物 差速离心：分离密度不同的细胞组分 密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离,Control,15M Triol 6h,