1、第六章 第1节 微生物的生长 一、概念 1.生长：在适宜条件下，微生物获取营养细胞代谢细胞重量、体积增大的过程。 2.繁殖：生长到一定阶段，经过细胞结构的复制与重建所引起个体数目的增多,二、微生物个体的生长在微生物学中，在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物(culture)，而只有一种微生物的培养物称为纯培养物(pure culture)。由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利用和重复结果，因此把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。,1.微生物的纯培养在微生物学中，将由一个细胞生长、繁殖而得到的后代称为纯培养。 2.纯培
2、养的分离方法 稀释倒平板法与涂布平板法 ：,培养基,样品,将待分离材料用无菌水作一系列稀释（10倍稀释法）。由于将含菌材料先加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是 涂布平板法：,先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，再将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，最后用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。如果稀释得当，在平板表面或培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取
3、该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。,平皿划线分离法：用接种环挑少量待分离材料，在培养基表面平行或连续划线，培养可得单菌落，分离纯化得纯培养。,单细胞挑取法：用单细胞挑取仪（显微镜挑取器）在显微镜下直接挑取单个细胞（菌体）进行培养。稀释法只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类，而在自然界，很多微生物在混杂群体中都是少数。这时可以采取这种显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。,选择培养基分离法：放线菌、病原菌没有一种培养基能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。在一种培养基上接种多种微生物，只有能生长的才生长，其他
4、被抑制。如果某种微生物的生长需要是已知的，也可以设计一套特定环境使之特别适合这种微生物的生长，因而能够从自然界混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来。,3.微生物个体生长的标志（以细菌为例）细胞壁的延伸、遗传物质的复制、其它各种细胞结构的重建原生质总量增加、细胞体积增大细胞分裂 三、微生物群体的生长（以细菌为例） 1.微生物学中提到的生长均指群体生长 即在一定时间和条件下细胞数量的增加个体生长 个体繁殖 群体生长群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖,2. 细菌群体生长的培养方式及其生长规律 分批培养（单批培养、一次培养、密闭培养）将少量细菌接种到一个恒定容积的新 鲜液体培养基中，在适宜的条
5、件下培养 定时取样测定细菌总数，如果以培养时间 为横坐标，以活细菌数目的对数或生长 速率为纵坐标作图绘制曲线，可以得到细 菌的生长曲线。,细菌的生长曲线可以分为 延迟期、对数生长期、稳定期与衰亡期。, 延迟期（lag phase）细菌从接种（到新鲜培养基后）到开始增殖之间的时期。 少量细菌接种到新鲜培养基后，在开始培养的一段时间内，细胞数目不增加，甚至稍有减少的时期，又称为迟缓期、调整期或滞留适应期。 特点：生长速率近于零；细胞形态变大、增长；分裂迟缓、代谢活跃、抗逆性弱。 出现的原因：调整代谢，适应新环境。 实际生产中缩短延迟期的方法：P173, 对数生长期（exponential phas
6、e） 迟缓期后菌体数目以几何指数增加（最快）的时期；细菌呈高速率生长，细胞数目以几何级数增加；又称为指数期或生长旺盛期。 特点：生长速率最大，代时最短；细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最均匀； 生长受温度影响明显，最适温度下，细胞代谢最强, 组成新物质最快。,在对数期细菌数量按几何级数增加：1,2,4,8, , 若以 乘方形式 表示则为：20,21, 2n “n” 是细菌分裂的次数或增殖代数。 1个细菌繁殖 n 代可产生2n 个细菌。利用生长曲线可求增殖代数n 和 代时G （单个细胞完成一次分裂所需的时间，又称 增代时间或世代时间）设在时间 t0 时菌数为N0,经过一段时间到t1时，繁殖n 代
7、后，菌数为Nt，则,Nt = N0 2n 求出 增殖代数 n P173-174 代时 G = ( t1 - t0 ) / n 影响代时的因素： 菌种、营养成分及其浓度（生长限制因子） 培养温度等 对数期菌种的用途： 个体形态、化学组成和生理特性均较一 致，代谢旺盛，生长迅速，代谢稳定, 用于科学研究、发酵生产上的接种种子,例题：设大肠杆菌在接种时的细胞浓度为100个/mL, 经400分钟的培养，细胞浓度增至10亿个/mL,求该菌的世代时间和繁殖代数。 解：接种时间t0时，N0 = 100 培养400分钟后t1时，Nt=1,000,000,000 n = 3.322（lg109-lg102）=
8、23.1 G =（t1-t0）/n =（400-0）/23.1=17.3 即大肠杆菌的世代时间为17.3分钟,在400分钟内共繁殖23.1代。, 稳定期（stationary phase）P174对数期后群体细胞总数不变，趋于稳定的时期。 生长速率逐渐趋向零，生长率与死亡率达到动态平衡；又称恒定期、静止期、最高生长期。 出现原因：养分减少，有毒代谢物产生 特 点：培养物中细胞总数最高，细胞内开始积累贮藏物和代谢产物，是发酵生产的最佳收获期。, 衰亡期（decline phase） P175稳定期后，继续培养，群体数目逐渐减少的时期。死亡率大于生长率，群体中活细菌的数目急剧下降，其对数与时间呈反
9、比，出现“负生长”。又称对数死亡期、衰老期。 特 点：细胞内颗粒状物质增多，出现液泡，菌体出现畸形、衰退形并伴随自溶 生产上应尽量防止或推迟此期的出现。,细菌在有限营养液中的群体生长、非同步生长。营养物质的消耗和代谢产物的积累是导致细菌生长停止的主要原因。, 连续培养（continuous cultivation）通过一定的控制系统，使培养基不断更新，从而长期维持恒定生长速率的培养。当微生物以分批培养方式到对数期的后期时，一方面以一定速率连续流入新鲜培养基并立即搅匀，另一方面又以相同的速率流出培养物（菌体和代谢产物），使 培养 达到动态平衡，其中的微生物可长期保持对数期的生长状态。,连续培养的
10、分类 恒浊连续培养不断调节培养基流入或排出的速率以使培养液中微生物细胞密度保持恒定（恒浊）在恒浊培养装置中需要浊度计。借光电池检测培养室中的浊度：通过光电效应产生的电信号强弱变化，自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速。培养室中浓度超过预期值时，流速加快，浊度降低；反之，流速减慢，浊度增加，以此来维持培养物的某一恒定浊度。,恒化连续培养 随着细菌的生长，生长限制性因子（低浓度时明显影响生长速率和菌体产量的营养物）的浓度降低，致使细菌生长速率受限，若同时通过自动控制系统来保持生长限制因子的恒定流速，不断予以补充，就能使细菌保持恒定的生长速率。常见的生长限制因子包括 作为氮源的氨、氨基酸；
11、作为碳源的葡萄糖、乳酸及生长因子，无机盐等。,恒浊培养 恒化培养, 同步培养法（synchronous cultivation）使培养物中所有微生物都处于相同的生长阶段的培养方法。 同步生长、同步细胞同步培养法通常分为机械（物理）选择法 和 环境条件诱导法。P175由于同步群体内细胞个体之间的差异，同步生长不能无限的维持，往往会逐渐破坏，最多能维持23个世代后，群体内的各个细胞个体就会因为生长周期的代时差异而处于不同的生长阶段，出现非同步生长。,四、微生物群体生长的测定方法 1、测定细胞数量显微镜直接计数法、比浊法、平皿菌落计数法等2、测定细胞生物量 测干重、 测某一化学成分或代谢产物等,五、
12、微生物生长的影响因素 1. 温 度 每种微生物都有3种基本温度即温度三基点 最低生长温度：低于这个温度以下不再生长 最适生长温度：在此温度时生长速率最快 最高生长温度：在此温度以上不可能生长 同一种微生物在不同的生理过程有不同的最适温度 生长最适温：生长繁殖速度最快或代时最短的温度,发酵最适温、累积产物最适温等 微生物的温度类型微生物按其生长温度范围可分为三类：低温微生物、中温微生物、 高温微生物。 见书P176，表6-2 温度对微生物生长的影响,嗜冷性微生物（低温微生物）：指那些最适生长温度为15或以下，最高生长温度低于20，最低生长温度在0或更低的微生物。专性嗜冷微生物：最适生长温度15，
13、最高生长温度20的微生物。 （最低-12，主要分布在南北极地区，如假单胞菌）兼性嗜冷微生物：最适生长温度25-30，最高生长温度35的微生物。（最低-50，主要分布在海洋及冷藏食品上，如乳酸杆菌，青霉菌）嗜温性微生物（中温微生物）：最适生长温度2040（有的说2540）的微生物，大多数微生物属此。主要分布于动物、人体、植物、土壤等，如人类的病原菌，最适生长温度为37。另外啤酒酵母、曲霉、大多数细菌。（最低1020，最高40-45）。 嗜热性微生物（高温微生物）：最适生长温度在5060， 甚至更高。（最低生长温度3540,最高70-95，）主要分布在温泉、堆肥，如硫化叶菌属。, 低温对微生物具有
14、抑制或杀死作用，故常用低温保藏食品。 处于低温状态的微生物，代谢活动降低，生长繁殖停滞，但仍维持存活状态，一旦遇到适合的生活环境就可生长繁殖。因此，常用低温保存微生物菌种。 高温可引起微生物蛋白质和核酸不可逆的变性，产生致死作用，故广泛用于消毒灭菌。,2. 氧气见书P178 专性好氧 兼性好氧 专性厌氧 耐氧型 微好氧,3. pH 每种微生物也都有pH三基点；同一种微生物在其不同的生理过程中有不同的最适pH要求，发酵生产中控制pH尤为重要大多数细菌最适pH 为6.57.5。 放线菌最适pH 为7.58。 酵母菌、霉菌最适pH 为464. 水活度与渗透压,微生物生长环境中可利用的水常以水活度值(
15、Aw)表示.水活度是指在一定的温度和压力条件下，溶液的蒸气压力与同样条件下纯水蒸气压力之比，即AwPwPow Pw-溶液蒸气压力，Pow-纯水蒸气压力纯水Aw=1，溶液中溶质越多，Aw越小。微生物一般在 Aw=0.600.99 的条件下生长，微生物不同，其生长的最适Aw不同。 5. 氧还电位与辐射,第六章 第2节 抑菌、灭菌与化学治疗 微生物学的基本任务：发掘、利用和改善有益微生物；控制、消灭或改造有害微生物。 一、控制有害微生物的措施 杀灭有害微生物 灭菌：彻底杀灭物品内外所有微生物 高温灭菌 干热灭菌法： 火焰灼烧法 接种工具、金属小工具污染物品和实验动物尸体 烘箱热空气法 玻璃器皿、陶瓷
16、器具、金属用具等,湿热灭菌法 煮沸消毒法：100，5-15分钟（水中煮沸15分钟以上）能杀死一切细菌的营养体和部分芽孢，适于饮用水，解剖用具，注射 器等的消毒。 高压蒸汽灭菌法：1.1Kg/cm2 ，20-30min . 间歇灭菌法：100，维持30-60分钟，以杀死微生物的营养体，冷却后，于37培养一天，次日同法灭菌，如此反复3次，即可达到灭菌的目的。主要应用于一些不宜于高压灭菌的培养基，如糖类、明胶、牛奶等的灭菌。 巴斯德消毒法：啤酒65，15分钟；牛乳63-6630分钟，或7115分钟；此法是据结核杆菌的致死温度为62处理15分钟制定的。该法能杀灭食品中的病原微生物，同时保持食品的营养和
17、风味。 连续灭菌法：100，处理8小时，达到杀灭微生物及芽孢的目的。,过滤除菌：依靠过滤器的拦截作用或通过惯性碰撞、扩散和吸附作用除菌。有些需要灭菌的材料不能受热，例如对许多维生素溶液、含有热敏物质的培养基、空气等的灭菌绝对过滤器：过滤介质为各种纤维素膜、 过滤器 聚丙烯膜、聚乙烯膜等，滤孔小深层过滤器：过滤介质为各种纤维、颗粒活性炭、石棉板等，滤孔大,过滤法不是将微生物杀死，而是把它们排除出去。过滤法用途广泛，除在饮料、药物生产中使用外，空气也常常用过滤法除菌。我们做微生物学实验时，灭过菌的容器一般用棉花塞堵在出口处，实际上就是过滤除去空气中的微生物，使进入容器的空气中没有微生物污染。微生物
18、学实验室使用的超净台也是用过滤法除菌。, 辐射灭菌X射线、射线、射线和射线均为电离辐射。其杀菌作用原理：引起环境或细胞中的水分子在吸收能量后发生电离产生自由基，这些自由基常与周围存在的氧分子作用，产生一些具强氧化性的过氧化物，从而使细胞内某些重要的蛋白质和酶发生变化（如使酶蛋白的-SH基氧化）最终使细胞受到损伤或死亡。,60Co照射 射线灭菌 紫外辐射能作用于核酸，引起致死突变。紫外线穿透能力很差，不能穿过玻璃、衣物、纸张等，但能够在空气中传播，可用做物体表面或室内空气的灭菌。经紫外辐射处理后，受损伤的微生物细胞若再暴露于可见光中，一部分可恢复正常，这称为光复活现象。因此紫外照射后须在红光或避
19、光条件下工作。, 消毒：杀灭物品内外的病原微生物或杂菌 煮沸消毒法 巴氏消毒法 消毒剂处理：强碱类、高浓度盐或重金属盐类、氧化剂等 有机化合物：苯酚、70-75%乙醇、甲醛、新洁尔灭等2. 阻止或抑制有害微生物的生长, 防腐：利用某些理化因子，使物体内外的微生物暂时处于不生长、不繁殖但又未死亡的状态。这是一种防止食品腐败和其他物质霉变的技术措施。 低温：4以下，短期保藏 除氧或缺氧：保鲜 干燥：长期保藏 高渗环境或高酸度：盐腌、糖渍、酸（泡）菜等 加防腐剂, 化疗：利用某些具有选择毒性的化学药物或抗生素，对生物体的深部感染进行治疗，可以有效地消除宿主体内的病原体，但对宿主却基本上没有损害。化学
20、治疗剂能直接干扰病原微生物的 生长繁殖：它能选择性地作用于病原微 生物新陈代谢的某个环节，使其生长受 到抑制或致死。 化学治疗剂包括：各种抗生素、抗代谢药物（如磺胺类药）和中草药中的有效成分。,抗生素是微生物在其生命过程中产生的一种次生代谢产物或其人工衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或杀死其他微生物，因而可用作优良的化学治疗剂。 抗生素的作用范围称为抗菌谱。金霉素、土霉素、四环霉素等可抑制多种微生物的生长广谱抗生素。微生物在进化中通过：产生钝化和分解药物的酶、改变细胞膜的透性，使药物不能进入细胞、改变药物敏感位点等方式 形成对某种抗生素的抗药性。,抗生素的作用机制 抑制细胞壁的合成：如青霉素含
21、有-内酰胺环，可特异地结合在细菌细胞壁肽聚糖上，抑制细胞壁的合成， 因而只作用于细菌特别是肽聚糖成分丰富的G+菌。 破坏细胞膜的功能：如多黏菌素可作用于膜磷脂使膜溶解，而 G-菌细胞膜磷脂特别丰富，所以可特异性地抑制G-细菌的生长。,抑制蛋白质的合成： 由于原核微生物蛋白质合成所需的核糖体为 30S 以及 50S 亚基，与真核细胞明显不同，氯霉素是 50S亚基的抑制剂。链霉素、四环素、卡那霉素等是 30S亚基的抑制剂，因而它们都可特异地抑制原核微生物的生长。抑制核酸的合成: 利福霉素 可特异地结合到与真核细胞明显不同的 细菌RNA聚合酶上,新生霉素 则作用于 细菌DNA酶,因而抑制细菌生长。,
22、抗代谢药物的作用机制有些化合物在结构上与生物体必需的代谢物很相似，可以和特定的酶结合（本来这个酶是用来结合底物的），从而阻碍酶的功能，干扰代谢的正常进行，这样的化合物称为抗代谢物。抗代谢物的种类较多，如叶酸对抗物（磺胺类药物）、嘌呤对抗物（6巯基嘌呤）、氨基酸对抗物（5甲基色氨酸）、吡哆醇对抗物（异烟肼）等。,磺胺类药物是最常用的抗代谢药物，它可抑制大多数革兰氏阳性细菌和某些革兰氏阴性细菌的生长繁殖，能治疗多种疾病。其作用机制如下：,二、影响灭菌、消毒、防腐与化疗的因素1.微生物的种类 2.处理剂量：强度与时间 3.灭菌物品的含菌量 4.灭菌时的各种理化因素如温度、湿度、酸碱度与氧的影响 5. 杀（抑）菌因子的穿透条件,
