1、一、色谱起源,1906 年俄国植物学家Tsweet 发现色谱分离现象,2,高效液相色谱仪的分析原理,高效液相色谱仪的结构 色谱柱在高效液相色谱仪中的作用和峰形产生原理,高压泵,进样器,检测器,色谱工作站,色谱柱,1 Basic principle of chromatographic separation 1.1 色谱分离基本原理,Partition coefficient K分配系数,硅胶颗粒基质合成步骤： 1.合成硅胶基质 2.键合配体(键合相) 3.端基封尾 end-capped,以传统方式制造硅胶色谱填料的过程: 起始原料为矿物硅酸盐（如泡花碱），即A类硅胶,90年代以后方式：orga
2、nosilica polymer 有机单晶硅聚合的硅胶，即B类硅胶,填料的端基封尾 封口残余硅羟基 减少不可逆吸附或拖尾 增加碳含量（0.1% -1%）,C18键合并端基封尾后 还能看见什么？硅羟基!即使进行高密度键合，硅胶表面仍将残留约50%硅羟基(SiOH)!,单、双、三官能团键合,三官能团键合,二官能团键合,单官能团键合,键合,常用封尾end-capped ：三甲基硅氧烷,极性封尾，增加极性保留,Hypersil ODS即没有封尾 Hypersil ODS-2有封尾,由于空间位阻的存在，键合反应最多只能覆盖50%的硅羟基，超过一半硅羟基是活性硅羟基，与碱性基团会发生离子交换作用，增加了保
3、留，导致峰形拖尾，用短链氯硅烷（如三甲基氯硅烷）键合活性的硅羟基，可以减小这种影响，这种操作被称为封尾，封端，封口。,封尾,封尾,空间位阻：异丙基硅氧烷，异丁基硅氧烷,空间位阻,极性嵌入 polar embedded,问题：下列色谱柱如何选择？,amidohexadecylsilyl silica gel Column: size : l = 0.25 m, = 4.6 mm; stationary phase: diisopropylcyanopropylsilyl silica gel for chromatography R (5 m) with a specific surface a
4、rea of 180 m2/g and a pore size of 8 nm; stationary phase: spherical octadecylsilyl silica gel for chromatography R (5 m) with aspecific surface area of 170 m2/g and a pore size of 12 nm. stationary phase: aminopropylsilyl silica gel for chromatography R (5 m), stationary phase: end-capped octadecyl
5、silyl silica gel for chromatography R (5 m), stationary phase: base-deactivated octadecylsilyl silica gel for chromatography R (3 m). stationary phase: octylsilyl base-deactivated silica gel for chromatography R (4 m) with a pore size of 6 nm, stationary phase: end-capped polar-embedded octadecylsil
6、yl amorphous organosilicapolymer R (5 m);Mobile phaseMix 35 volumes of acetonitrile R and 65 volumes of a 5.23 g/l solution ofdipotassium hydrogen phosphate R previously adjusted to pH 7.0 with phosphoric acid R.,（答案见备注信息）,以传统方式制造硅胶（A类硅胶）色谱填料的过程: 起始原料为矿物硅酸盐（如泡花碱）,Na2SiO3 (矿物) + 2H+,Si(OH)4 (silicic
7、acid)+ 2Na+,硅胶颗粒 (含金属杂质!),C18/C8 bonding + endcapping,C18/C8 Reversed Phases (最终仍带金属杂质!),与键合相的疏水性作用,双重保留机理:1). 与键合相的的疏水性作用; 2). 与残余硅醇基间的离子交换作用,O-,Si,O-,Si,O,-,O-,Si,O-,Si,O,-,O-,Si,O,-,O-,Si,O-,Si,O-,Si,O,-,O-,Si,O-,Si,O-,Si,O-,Si,OH,O-,Si,O-,Si,OH,O-,Si,OH,O-,Si,O-,Si,O-,Si,OH,O-,Si,O-,Si,当流动相pH值小于
8、3时, 硅醇基呈中性(未解离),Base,Base,对碱性化合物的保留及严重拖尾,两实验使用相同的传统C8硅胶柱,离子交换作用,碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理,当流动相为 pH6-8时, 硅醇基带负电性(大部解离),既然pH 3时硅醇基离解受抑制，为何不在所有情况下采用酸性条件进行分离?,低pH可导致分离选择性的完全丧失!,硅胶晶格中杂质铝对硅醇基酸度的影响,质子酸,H,金属嵌入硅胶晶格中，使硅醇基的酸性大大增强,+,_,硅胶中金属杂质含量对螯合性化合物Hinokitiol峰形的影响,Minutes,2,4,6,8,流动相:20 mM Phosphate Buffer pH 3.6 （含 0.
9、05% EDTA): Acetonitrile (50:50),低金属杂质,高金属杂质含量,金属杂质的存在可使得硅醇基过度活化，以至某些碱性化合物在酸性条件下仍呈现拖尾峰,分析物: Chlorpheniramine,杂质铝含量, ppm,1,2,3,4,0,100,200,300,400,拖尾因子,“高纯硅胶 ”区,流动相 : 乙腈/KH2PO4 pH 3.0 (20:80),传统型C18硅胶柱上金属杂质对碱性化合物峰形的影响,Minutes,5,15,25,35,45,Amitriptyline,Acenaphthene,Propranolol and Butylparaben,Naphth
10、alene,铝杂质含量 375 ppm Tf USP = 6.5,流动相 pH 7,如何解决碱性化合物和螯合物的峰形问题?,从修饰流动相着手改善峰形(例如使用竞争性碱TEA或离子对色谱) 1970-1980年代策略 从改善反相填料着手降低硅醇基活性 自1990年代起至今,现代色谱柱三大技术平台,亲水AQ柱 ECOSIL ODS-AQ Atlantis Dc18, T3 Synergi Hydro-RPHILIC柱 Zic-HILIC Hypersil GOLD HILIC Atlantis HILIC 柱目的：提高极性化合物保留,宽pH色谱柱 ECOSIL ODS-Extend Xbridge
11、/Xterra C18/C8 Gemini C18 Zorbax ODS-Extend目的：提高色谱柱pH使用范围,纯硅胶柱 ECOSIL ODS-SH Purospher STAR RP18e Symmetry C18极性嵌入柱 ECOSIL ODS-EPS Zorbax-Bonus RP18 Symmetryshield RP18目的：改善峰形,Tetraethoxysilane (TEOS),Polyethoxysilane (PEOS),B类超纯硅胶柱基体颗粒的化学合成过程,无金属杂质的超纯起始原料,常见品牌C18柱在pH7下的性能比较,品牌,Acenaph,k,Amitrip/Ace
12、nap,a,Amitriptyline,拖尾因子(美国药典法),Ecosil C18-SH,16,1.3,1.4,Inertsil ODS-2,16,1.4,2.5,Puresil C18,14,1.5,3.3,Zorbax Rx C18,16,1.8,6.0,Purospher RP-18,16,4.8,6.0,Kromasil C18 Alltima C18,19 23,1.5 3.5,9.413,Nova-Pak C18,16,2.3,5.5,Nucleosil C18,15,4.3,10,Hypersil ODS,11,2.8,10,Zorbax ODS,21,无法测得结果!,2.6,
13、常见品牌C18柱在pH3下的性能比较,对碱性化合物的峰对称性,pH 7,pH 3,Symmetry,Symmetry,(极佳),Inertsil,Purospher,LiChrospher RP,select B,Alltima,YMCbasic,Inertsil,Puresil,kromasil,Purospher,YMCbasic,Zorbax Rx,Zorbax Rx,Nova,-,Pak,LiChrospher RP,select B,kromasil,Puresil,Alltima,Nova,-,Pak,Nucleosil,Nucleosil,Hypersil,Zorbax,Zorb
14、ax,Hypersil,(差),常见品牌柱在pH3和 pH7下的峰形优劣排序,Ecosil ODS-SH,Ecosil ODS-SH,具有极性嵌入基团的反相填料结构示意,内嵌极性基团固定相：水表面层可能机理,水 “屏蔽”层,改善与水的浸润性100%水溶液兼容 降低了碱性化合物的保留 降低了拖尾现象,屏蔽了带负电的硅羟基,极性基团增加了表面层水的浓度,C18键合相硅胶柱填料需要合适的湿润度,注意：需要有机溶剂来保证反相填料有合适的湿度, 反之停流速后易出现“疏水塌陷”问题,未湿润的孔,湿润的孔,注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿润，那么有效的色谱表面积会减少95%，因此
15、，减少被分析物的保留时间即等于“疏水塌陷”，记住：几乎所有的表面积都在孔内！,低比例有机溶剂或纯水溶液流动相,C18 硅胶,什么是“疏水塌陷”？,分,流动相：0.1% 醋酸水溶液,阿莫西林,Vo：被分析物没有保留,“湿润时”,“去湿后”,疏水塌陷,停流速后 (孔去湿: 3%),流动相：0.1% 醋酸水溶液,极性嵌入色谱柱：无疏水塌陷现象发生,内嵌极性基团键合相： 使用高比例水溶液流动相时色谱性能稳定,Ecosil C18-EPS Tf USP = 1.1,阿米替林,Ecosil C18-SH Tf USP = 1.4,注意：对碱性化合物而言，可以减少保留时间并且改善色谱峰形,相同硅胶基质(配体
16、不同),内嵌极性基团的配体与直链烷烃配体的比较,注: 使用相同的流动相,Ecosil C8-EPS,Ecosil C8-SH,选择性不同,呋喃唑酮(痢特灵)杂质分析,极性基团嵌入技术（屏蔽技术）的历史沿革,1990: Supelcosil pKb-100 (嵌入酰胺键), 专利 (两步合成法) 1992: Prism RP (嵌入脲结构) 和 Supelcosil LC-ABZ (两步合成法) 1993: Supelcosil ABZ+Plus (两步合成法) 1995/1996: Waters SymmetryShield RP18/RP8(氨基甲酸酯结构),专利(一步合成法) 1999:
17、Waters Xterra RP18/RP8 (氨基甲酸酯结构),专利(一步合成法) 1998/1999 (Supelco放弃了基于酰胺键嵌入技术的两步合成法专利): Discovery RP Amide C16 (一步合成法) 许多其他公司开始仿制. 2000: ECOSIL C18-EPS/C8-EPS (酰胺基十六烷基结构)(一步合成法),多种品牌色谱柱对碱性化合物的峰形比较,USP Tailing Factor (amitriptyline, pH 7),1.1,1.1,1.1,1.1,1.2,1.2,1.4,1.4,1.4,1.5,1.6,1.8,1.8,1.8,1.9,2.1,2.
18、4,2.6,3.4,4.3,5,5.6,6.4,9,10,1,3,5,7,9,Ecosil C8-EPS,Ecosil C18-EPS,SymmetryShield RP8,SymmetryShield RP18,YMC-Pack PolymericC18,Luna C18(2),Supelcosil ABZ+Plus,Discovery RP Amide C16,ECOSIL C18SH,Luna C18,Zorbax Bonus RP,YMC-Pack CN,Nova-Pak CN HP,YMC-Pack Pro C8,Symmetry C18,Symmetry C8,YMC-Pack P
19、ro C18,Nova-Pak Phenyl,Zorbax Extend C18,YMC-Pack Phenyl,YMC-Pack ODS-A,Waters Spherisorb ODSB,Nova-Pak C18,Waters Spherisorb ODS2,Bondapak C18,Atlantis dC18 Column: 揭开人类酿酒历史之谜 (2004),古埃及十二世王 Tutankhamen (约公元前 1346-1327),1922年发掘Tut王墓葬时所发现的具象形文字的残片, 疑为盛酒器皿上的标签说明,Tartaric Acid (酒石酸) Syringic Acid (丁香酸
20、): 是红葡萄中的两个内源性标记物,AQ柱的极性保留秘诀,表面峰端,键合密度,键合相连接方式,微孔大小,防微孔脱水,峰形,保留性能,柱寿命,1、极性封尾 2、极性嵌入 3、低碳载量 4、保留硅羟基 5、增加极性嵌入键合相,AQ色谱柱的特点,对极性与非极性化合物的优异保留特性 在100水溶液流动相中运行保持色谱性能稳定 峰形优异 超低键合相流失，质谱兼容 酸性条件下稳定性良好 在高水相、低pH条件下具有较长的色谱柱寿命 极佳的色谱柱间重现性,Atlantis dC18柱对极性化合物的优异保留性能,对嘌呤碱表现良好峰形(因对填料进行了彻底封端),Compounds: 1. Cytosine 2.
21、5-Fluorocytosine 3. Uracil 4. 5-Fluorouracil 5. Guanine 6. Thymine 7. Adenine,Conditions Column: AtlantisTM dC18 4.6 x 150 mm, 5 m Mobile Phase A: H20 Mobile Phase B: ACN Mobile Phase C: 100 mM CH3COONH4, pH 5.0 Flow Rate: 1.0 mL/min Gradient: Time Profile(min) %A %B %C0.0 90 0 1010.0 84 6 10 Inject
22、ion Volume: 10 L Temperature: 30 oC Detection: UV 254 nm Instrument: AllianceTM 2695, 2996 PDA,尿嘧啶(Uracil) 是测试反相柱最广泛采用的死体积标记物, 但在Atlantis dC18柱上具显著保留,Atlantis dC18:丙毒(丙烯酰胺)分析,色谱柱：Atlantis dC18色谱柱 5m，2.1150m m 流动相：0.1%甲酸+甲醇=98+2 流速：0.2mL/min 进样体积：20ml,数据来源： 北京CDC,条件 色谱柱： AtlantisTM dC18 4.6 x 150 mm,
23、 5 m 流动相 A: 0.1% TFA 水溶液 流动相 B: 0.1% TFA 乙腈溶液 流速: 1.4 mL/min 梯度: 时间 梯度组成(min) %A %B0.0 100 05.0 97 36.0 85 1510.0 80 2012.0 0 10025.0 0 100 进样体积: 10.0 L 温度: 30 oC 检测: UV 268 nm 仪器: AllianceTM 2695, 2996 PDA,极性与非极性化合物保留的完美平衡,化合物： 浓度(g/mL) 1. L-抗坏血酸(VC) 19.6 2. 烟酸 (niacin) 9.8 3. 硫胺(VB1) 19.6 4. 吡哆醛 3
24、9.2 5. 吡哆醇(VB6) 39.2 6. 叶酸 (VB11) 23.5 7. 咖啡因 9.8 8. 核黄素 (VB2) 3.9 9. 视黄醇(VA) 19.6 10. 生育酚 (VE) 39.2 11. 麦角钙化甾醇(VD2) 9.8,Grumbach, Diehl,对于水溶性维生素的极佳保留,对于脂溶性维生素 不过度保留,注：无需离子对试剂！,问题,AQ柱有哪些不足之处？,HILIC,Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (HILIC) 亲水作用液相色谱,其他HILC柱 硅胶柱 氨基柱 丙基酰胺柱 亲水键合硅胶柱（多羟基等）,问题：
25、 为什么不考虑SCX或SAX,HILIC柱特性,HILIC 柱用于在AQ柱上依然无有效保留的场合 分离机制为“反反相色谱”技术 HILIC 柱与C18柱上的出峰顺序刚好相反 由于使用含高有机溶剂成分的流动相进行分离，在LC/MS应用中的检测灵敏度比AQ柱上显著提高 可直接将样品溶于纯有机溶剂中进样，省却了将样品溶剂蒸干再定容的麻烦。,HILIC保留特性 1、固定水，利用氢键作用 2、离子交换作用,洗脱能力： water methanol ethanol propanol acetonitrile acetone,三聚氰胺和三聚氰酸同时检测,FDA推荐Zic-HILIC,突破高纯硅胶柱局限性的必
26、要性,硅胶柱pH适用极限,0,10,20,30,40,0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,k,pH,硅醇基解离,带负电荷,硅醇基未解离,碱性化合物具良好峰形 但保留不足,对碱性化合物的保留增强,但需严格控制流动相pH 值。封端不佳的反相柱会面临峰拖尾的问题。,硅醇基完全解离, 硅胶基体逐步溶解！,碱性化合物呈中性，保留强,峰性佳。,需要全新的柱技术,宽pH值色谱柱 突破硅胶柱应用禁区的有力手段,优点,缺点,无机基质 (C18 硅胶),机械强度高柱效高保留稳定,有限的pH应用范围对碱性分析物拖尾化学不稳定性,有机基质 (高聚物),很宽的pH应用范围无离子型作用 化学稳定性好
27、,机械强度不佳 柱效低保留行为难以预测,宽pH值色谱柱,宽pH值色谱柱的几种类型,双齿键合，Agilent,四乙氧基硅烷 (TEOS),硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷 (MPEOS),甲基三乙氧基硅烷 (MTEOS),Waters 专利技术 荣获2000年全球 R&D 100 大奖,杂化颗粒柱(XTerra)的合成过程示意,第二代杂化颗粒技术,高pH条件下柱稳定性的强化测试结果 柱寿命比超纯硅胶柱提高十倍以上!,pH对填料稳定性的影响,高pH实验 pH 8时,许多C18硅胶基质过早地丧失柱效 由于填料颗粒溶解,色谱柱内产生空隙 随着键合相覆盖率的增加，色谱柱寿命延长 低pH实验 pH 2时,许多C1
28、8硅胶基质过早地丧失柱效 由于键合相之水解作用,被测物丧失保留行为 使用三官能团键合相可获得最佳的稳定性,灵敏度与选择性的改变,色谱柱: XTerra RP18, 4.6.x 150 mm, 3.5 m 检 测: 254 nm (相同进样量) 流动相: 50% 乙腈/40% 水/10% 含 100 mM CAPSO, pH 10 流动相: 30% 乙腈/60% 水/10% 含100 mM 磷酸钠, pH 2.0,Minutes,pH 10,色谱图重叠,pH 2 与10：阿司咪唑与 酮康唑分析,简化方法开发过程,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,pH,中间 pH 硅胶柱,低
29、pH 硅胶柱,高 pH 聚合物基质柱,宽 pH 范围 填料色谱柱,宽pH值色谱柱之宽pH范围(以一当三),温度,pH,宽pH值色谱柱：高温稳定性,高温寿命试验,Conditions: Column: XTerra RP18, 5 m, 4.6 X 150 mm Mobile Phase: 40% pH 7 , 10 mM Na2PO4, 60% ACN Column Temp.: 60 C Flow Rate: 1.5 mL/min Detector: 254 nm,三环抗抑郁药物分离,宽pH值色谱柱的优点,为方法开发提供了极其有效且方便的工具 宽pH范围 良好色谱峰形 高稳定性,基于杂化颗粒
30、的XTerra RP18柱与普通C18硅胶柱 在分离酸性、碱性化合物时的拖尾因子比较,为何杂化颗粒柱可增强在高pH下的柱寿命？,硅胶快速溶解严重的柱失效柱寿命短暂,Surface modified Silica Particles,因嵌入硅甲基的阻挡, 颗粒表面溶解速度明显减缓柱寿命大大延长,XTerra Hybrid Particles,普通硅胶柱,基于杂化颗粒的Xterra 柱,基质溶解度 (ppm),1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12,240- 220- 200- 180- 160- 140- 120- 100-80-60-40-20-0-,pH,基质溶解度曲线,传统硅胶柱适
31、用范围pH 2-7,各种基质的液相柱在高pH中溶解速率的比较,液相柱基体材料的溶解导致柱前端形成空腔，由此而造成色谱峰畸形、分叉。,现代超纯硅胶柱适用范围pH 2-8,宽pH值色谱柱适用范围pH 1-12,宽pH值色谱柱对创建稳定可靠的HPLC分析方法的独特价值,Note: Column Particle, Temperature and % Organic Held Constant,0.1,1,10,100,0,2,4,6,8,10,12,14,pH,k,Acetaminophen,Ibuprofen,Nortriptyline,Lidocaine,Doxepin,Imipramine,p
32、-Toluamide,Mobile Phase: 35% MeCN, 65% 20 mM Buffer,硅胶柱,宽pH值色谱柱,Dibucaine (局部麻醉药-碱性化合物),美国药典USP 28 上所推荐的色谱方法 淋洗剂: 1.2 g 十二烷基磺酸钠 (SDS), 0.2g 醋酸钠, 2.0 ml 三乙基胺溶于 300 ml 水中, 调pH 至 5.6，然后加700 ml甲醇 3.9 x 300 mm L1 柱，要求 拖尾因子3.0,SDS: 表面活性剂/ 离子对试剂TEA: 竞争碱为对抗峰拖尾而加入?,文献 pKa = 8.9,Minutes,0,12,分析柱: XTerra RP18,
33、 4.6.x 150 mm, 3.5 m 检测波长: 254 nm 流动相: 50% ACN/40% Water/10% aqueous 100 mM NH4HCO3, pH 10.3,USP TF 1.02,6,Good Peak ShapeNo AdditivesSimple mobile phase,用杂化柱在高pH下分析Dibucaine 拖尾问题迎刃而解,Altretamine (三嗪类抗癌药物-强碱性化合物),美国药典USP 28 上所推荐的色谱方法 流动相: 制备甲醇与缓冲液的混合液(790 mg 碳酸铵(NH4)2CO3溶于1000mL水中，调节pH至8.0 0.05) (65
34、:35) 色谱柱: 一根以USP L1填制的 4.6-mm x 30-cm 分析柱。 USP 拖尾因子不得大于1.5。,pKa = 10.3,正确的做法是用碳酸氢铵而不是 碳酸铵来配制缓冲液 pH 需要控制在 0.05范围内,分析柱: XTerra RP18, 4.6.x 150 mm, 3.5 m 检测波长: 227 nm 流动相: 50% ACN/40% Water/10% aqueous 100 mM NH4HCO3, pH 10.0,USP TF = 1.08,用杂化柱在高pH下分析Altretamine 柱寿命、峰拖尾和方法重现性问题迎刃而解,您在日常HPLC分析工作中所面临的常见问
35、题,Product Quality,Price,Waters,Peak Tailing,Retention Reproducibility,峰拖尾: 28%,保留时间不重现: 25%,分离不佳: 24%,柱寿命太短 11%,极性化合物保留不佳: 12%,我的色谱分离为何重现性不佳?,仪器系统问题泵精度、维修保养状况色谱柱是否置于恒温箱中系统滞后体积发生改变 (仅影响梯度分离!)柱与柱间分离表现发生改变您的色谱柱是否购自可靠的生产和销售厂家?源自方法本身的问题流动相的配制方法在无意中发生了改变分离可离子化化合物（酸、碱）未在流动相中使用缓冲液(或缓冲液的浓度不足)流动相的pH值与被分析酸性、碱性
36、化合物的pKa相近,梯度分离时系统滞后体积变化对分离时间的影响,10.00,15.00,20.00,25.00,1 2 3,4,5,10.00,15.00,20.00,25.00,Minutes,1 2 3,4,5,系统 A: 泵滞后体积 800 L,系统 B: 泵滞后体积 1000 L,分离在同一根色谱柱上进行!,解决方案: 1. 在梯度表的每一个时间段中加入相应的补偿时间 2. 在Empower软件上启动柱前体积功能,*,* 需指明哪个溶剂先加（如将甲醇加入水中还是水加入甲醇中？）,关于流动相pH的提醒: 缓冲液的pH需在加入有机溶剂前调试！,流动相的配制顺序: 您常常忽视的细节,pH,0
37、.1,1,10,100,0,2,4,6,8,10,12,14,保留因子 (k),酸 (未离子化),中性化合物,碱 1,碱 1+2 (完全离子化),酸 (完全离子化),碱 2,(未离子化),B1,N,A,B2,pH 5.5,pH6.0,您的分析方法为何重现性不佳? 流动相缓冲pH值是否靠近分析物的pKa范围?,如图所示, 在靠近中性pH区间分析可离子化化合物时需要对流动相pH进行非常仔细的控制!,1. p-Toluamide 2. Lidocaine 3. Ibuprofen,Grumbach, Diehl,分析方法对pH敏感度的测试- 糟糕的结果,Column: XTerra RP18 4.6
38、 x 100 mm, 5 m Mobile Phase A: 20mM Ammonium Acetate (pH 5.0 to 5.8) or 20mM Ammonium Bicarbonate (pH 6.8 to 7.0) Mobile Phase B: ACN Flow Rate: 0.5 mL/min Isocratic Mobile Phase Composition: 40% A; 60% B Injection volume: 10L Temperature: 30oC Detection: UV 230 nm Instrument: AllianceTM 2690, 996 P
39、DA,1. p-Toluamide 2. Lidocaine 3. Ibuprofen,Grumbach, Diehl,Column: XTerra RP18 4.6 x 100 mm, 5 m Mobile Phase A: 20mM Ammonium Acetate (pH 5.0 to 5.8) or 20mM Ammonium Bicarbonate (pH 6.8 to 7.0) Mobile Phase B: ACN Flow Rate: 0.5 mL/min Isocratic Mobile Phase Composition: 40% A; 60% B Injection vo
40、lume: 10L Temperature: 30oC Detection: UV 230 nm Instrument: AllianceTM 2690, 996 PDA,分析方法对pH敏感度的测试- 糟糕的结果,分析方法对pH敏感度的测试- 优异的结果,杂化颗粒柱对创建稳定可靠的HPLC分析方法的独特价值,Note: Column Particle, Temperature and % Organic Held Constant,0.1,1,10,100,0,2,4,6,8,10,12,14,pH,k,Acetaminophen,Ibuprofen,Nortriptyline,Lidocai
41、ne,Doxepin,Imipramine,p-Toluamide,Mobile Phase: 35% MeCN, 65% 20 mM Buffer,硅胶柱,Xterra & X-Bridge 杂化颗粒柱,您在日常HPLC分析工作中所面临的常见问题,Product Quality,Price,Waters,Peak Tailing,Retention Reproducibility,峰拖尾: 28%,保留时间重现性不佳: 25%,分离不佳: 24%,柱寿命太短 11%,极性化合物保留不佳: 12%,我的色谱柱寿命为何不长?,您是否有恰当的样品前处理手段?样品前处理 (净化和富集)的好坏不仅影响
42、分析结果的灵敏度和可靠性，而且直接影响色谱柱的寿命 您的色谱柱是否有适当的保护措施? 在线过滤器保护柱您的色谱柱是否曾暴露在过于剧烈的分离条件?使用某些对填料基体有腐蚀性的高浓度缓冲盐 (如在中性或碱性pH区域使用高浓度缓冲盐的磷酸盐或硼酸盐)柱温过高将色谱柱暴露在极端pH的流动相中,您在日常HPLC分析工作中所面临的常见问题,Product Quality,Price,Waters,Peak Tailing,Retention Reproducibility,峰拖尾: 28%,保留时间不重现: 25%,分离不佳: 24%,柱寿命太短 11%,极性化合物保留不佳: 12%,影响分离度的若干因素
43、,柱效 N 2, R 40%,分离选择性 (方法开发归根结底是如何使得a 1),保留因子 K最佳=5,如何在实践中调控 a? 这是方法开发的根本!,溶剂选择性,常用溶剂: 甲醇(MeOH) 乙腈 (MeCN) 其他溶剂: 异丙醇(IPA) 乙醇 (EtOH) THF (Tetrahydrofuran),使用不同溶剂，可以改变选择性和洗脱强度,反相色谱中选择性的调节工具,1 不同类型2 不同键合相3 不同品牌,色谱柱选择,反相色谱中选择性的调节工具,选择性与pH,仅影响带离子型官能团的待测物 如：胺，羧酸及酚类等 pH不影响不能发生电离的中性物质的保留 大多数药物含有一个或多个离子型官能团pH变化引起的选择性变化最大,pH带来的保留与选择性变化,化合物从离子化状态变化到非离子化状态其保留因子变化10 到 30倍 上述变化相当于有机溶剂的比例变化20% pH带来最显著的选择性变化 pH是方法开发最强有力的选择性调节工具,方法开发的基本思路,哪一根色谱柱可以在低PH下得到: 所有杂质峰基线分离? 所有杂质峰之峰形良好? 主峰与杂质完全分离(用PDA或MS确定峰纯度)? 次要色谱峰足够的信噪比(S/N)? 如果答案是肯定的，则选择此色谱柱，并在此基础上进一步优化方法(有机相比例) 如果答案是否定的，尝试使用高pH分离条件,90,运行低pH快梯度：在选择性不同的所有色谱柱上,
