1、综述肿瘤相关基因分析方法同济医科大学附属协和医院武汉430030)胡慈综述易粹琼王家耽审校肿瘤的发生发展是多因素多基因长期作用的结果。克隆肿瘤相关荃因的方法有多种，且根据不同的分类有不同的侧重点。本文以研究对象水平的不同概括为三大类:第一类从DNA水平入手;第二类以mRNA水平为基础;第三类以蛋白质水平为基础。以DNA水平为甚础肿瘤相关基因改变的类型多种多样。有的基因在基因组结构上发生改变，如发生基因重排，抗癌基因丢失，原癌基因突变等。从DNA水平入手即可克隆这类基因。方法分述于下。1.1定位克隆 定位克隆是当前克隆肿瘤易感基因的一条主要途径。它的一般程序包括:首 用分 分析 定 的 方 ，
2、对家 分析 易感基因定位在 的 定 ， 这一 的DNA克隆在基础上 currency1基因的cDNA“， 分析这currency1基因在fi和fl它家 和生 的突变以”的肿瘤易感基因。1.1.1基因在 上的定位这是关的 ，作 大，期长。大分类型肿瘤为多基因 ，基因相作用方 以 ，大 的家 。基因定位的主要手“是 分析，即 基因 上多DNA 的重组 fi的 。用于定位克隆的DNA 包括 “长 多(RFLP) 可变 重 DNA等。这是 的 学方法， 的定位结果 ，要 以上的 为基础，且不 研究 基因，于是关 分析方法 生。 方法不要大的家 ，在fi和 的 研究， 基因的定位，如PTC基因的定位。1
3、.1，2 currency1 的cDNA“cDNAR的currency1可 定。 肿瘤相关基因定位在上某一局 位置 检索GENBANK核酸和蛋白质 据库fl它种类生物同很序列相比以寻currency1的cDNA序列。另外可直接 定有关的表达序列，如杂交吸附currency1法 外显子捕 法 CpG岛currency1法 直接用基因组DNAcDNA文库杂交法 外显子扩增法 种同镇序列杂文法 currency1剪接位点法 编码序列富集法 直接currency1PCR法等。每种方法各有长处各有缺陷， 使用几种方法才能完全currency1currency1 存在的。DNA序列。1.1.3基因功能的鉴
4、定在 currency1 的cDNA 要逐个检它 在fi及fl它家 和生 改变的，对基因编码蛋白质的氮基酸序列 分析，以 一 鉴定fl功能，可 转基因 基因敲除 分析肿瘤的关 。1.2表差异分析RDA 用识别六碱基的 内切酶消化基因组DNA，fl 杂降低， 多轮消减杂交结 PCR反使差异的靶基因“以大 富集。1.2.1接头和引物的设 设 几对一长一短的 个寡核苷酸“ 接于酶切 的DNA“的末端。fl长的作为相的PCR引物，一对 备扩增子，另外2一4对用于杂交和扩增程。相 的 轮PcR反不能用相同的一对接头。1.2.2 备扩增子 扩增子是DNA 内切酶消化 上接头 PcR扩增的“。它具有 个 点
5、:fl一，大大降低了基因组的 杂，使扩增 率提高;fl二， 驱赶子于检子的差异转化为 内切酶位点的差异，从 可备的探针用于 学分析 基因定位等方面。1.2.3差异富集它是动力富集和PcR 方面的结 。反开始时检子和 的驱赶子变杂文，在这一 程靶序列即 动力富集。 PCR反，驱赶子缺乏存在于检子的靶序列，反的结果是同聚 端由于有 个接头故呈指 扩增， 杂交 有单链有接头故呈线扩增。这样 多富集靶序列以显著增加。1.3比基因组杂文它是一种荧光原位杂交技术。它 用等 肿瘤基因组DNA和常对照基因组DNA作为探针常人期 本 原位杂交， 根据荧光信号强 差异 基因组差异 ， 荧光显 镜电脑彩 图象分析统
6、 接，对 种萤光比值 定 。它对于 瘤基因组水平上的研究有重要价值。 ，CGH不能检平衡易位 重排及fl它 有 变化的异常， 且 于扩增水平的高低及 的大 ，因同fl它学技术相结 。1.4AP.PCR它是在对 扩增的基因序列一 的下， 用 设 的一 个 异引物，在高 子 低 条 下使引物 DNA 多序列 。如果在 条单链上相 一定 有反 引物存在 可使二fi的DNA“以扩增。扩增 物 电 分 可DNA指 图。 对不同 基因指 图的比即可 差异“。AP.PcR是一种 定 的方法，不 可用于检基因结构的变化， 且能检 多 及杂 变化。用它 功 分 结直相关基因 癌相关基因。Ap-pcR 于 物质改
7、变的质和程 ，它很检单一 上的位点， 一个 的缺失易于检。2从RNA水平 发某肿瘤相关基因在结构上currency1发生改变， 是在表达上发生改变。表在n1RNA水平上的 表达 表达 降低。从mRNA水平 发可能发这基因的异常。2.1消减杂交2，1.1 的cDNA消减杂交cDNA消减杂交是分 差异表达基因的一种有 途径。常 Tester 的加DRIvermRNA(cDNA)杂交， 用 基“和析 fi生物素蛋白一生物素结 OLIGO(dT)-fl 等方法分 currency1杂交上的 分。 方法的缺点是对低 转本的分 率很低，且 多，作 大。2.1.2cDNA.RDA RDA可用于克隆差异表达的
8、CDNA。它 用识别 碱基的 内切酶识别六碱基的内切酶，这样可以消化基因组DNA，使同 序列消减，降低”率。它于 克隆和分 全长。DNA序列。它可根据表型的差异 定引差异的基因，从 一个相对完的表达图。 它不能各类mRNA 差别， 多轮消减。2.1.3 消减杂交(s ponsubtractivehybdizateon，H)H是一种 的以PCR反为基础的cDNA消减杂交方法。它 个不同的接头( 接头有一“反 末端重 序列)，接于 内切酶消化 的。DNA“5末端，以currency1扩增 的cDNA“，同时 的cDNA扩增。这种 PCR反是由于相同的接头因为末端的长反 重 序列 结构 不 扩增，有
9、不同的接头才可能呈指扩增。 方法的另一 点是 一化 程。在第一 杂交 程由于杂交二 动力学的原因，高 的转物易 ，从使序列 化。 一轮消减即可对 转物富集1000一5000 。Lud。 atchenko等 用 方法分组 异CDNA 8。fl基本 程如下:(l) dscDNA:提 比的 组 的mR ，用01190(dT) fl反转为。DNA。 加入几DNA聚 酶以 生平头cDNA。(2) 备Tester:用RSal Haelll 内切酶 dsDNA切 短“分为 组，分别 上接头1 2o(3) 备Driver:用上述酶切，不 加接头。(4)消减杂交:分别 个Tester样 加入 的加ver杂交。第
10、一轮杂交完 二fi ， 加入ver杂文以 差异表达序列。(5)PCR反:杂交 物 端 有不同接头的“是要的差异表达基因。第一 PCR反以 个接头的5端作引物扩增， 用 个接头的3端作引物 扩增以 一 消除 序列的 fi。(6)以PCR对比组 的n1RNA Northern ， cDNA文库 unthern 杂交以 定差异“的 异。对”“ 序分析鉴定fl 分。方法 易 ， 高，”率低，期短， 且可用 克隆的消减cDNA 物作为杂交探针currency1YAC BAC005重 ， 识别可能的差异表达基因。 SSH高差异currency1结 可以 有 克隆 有差异表达基因。2.2差异杂交( 11er
11、entialh如ridization)基本原是 不同的cDNA定于一定 上，用同一种mRNA探针杂交 比fl 差， 不同 的探针定于 上的同一cDNA杂交比 差异。 cDNA定于 叫高 eDNA 分析(Highdensity。nNAfilteranal”15，HDC-以)L191。近年 发展 的DNA芯技术即 在差异杂交的基础上。 种探针 上不同颇 的荧光素，同一DNA芯杂交 可根据荧光颜 用 分析判结果。平方厘米大于1000个cDNA的排列 使在一个杂交反定 大 基因 为可能。2.3R 指 法(R漱fingerp对nting)RNA指 法包括MDn(叔 differenti以di即lay)2
12、0和RAp.咒R(RNAarbitr面-lyprim PcR)2飞1。2.3.1MDD: 方法 用”核生物大多 mRNA的3端都具有Poly(A)尾，且紧靠Poly(A)的 个碱基除去倒 第一位A的组 外有12种组 的 点，相对 设 能上述12种组 补的引物如5一TllCA-3等。 引物很1/12mR-NA .能锚定于Poly(A)上游有TG的mRNA亚。若改变引物3端的 个碱基 可对不同的mRNA亚 反转。接着在有3端引物存在的条 下，加入一个5端的 引物对cDNA亚 PCR扩增，可 自同一mRNA亚不同mRNA的扩增 物，能反l/12的mRNA亚。1994年Liang等 设 单碱基锚定的0
13、11沙dT引物如5-T12G3，每种引物参1/3的mNA亚的反转从 减 反转 ，降低”率。如果 扩增 物电 分 即可RNA的指 图，可从 差异显示的cDNA“，从琼脂凝胶上纯化这cDNA“， 序列分析 作为探针杂文基因文库可currency1全长基因。2.3.2R月井.PCR: 法 用 引物 逆转。 引物currency1 RNA内某 结 ， PCR反。这一方法可针对RNA任何 ，包括开发阅读框(ORF)，可用于分析不 Poly(A)+的RNA如 多菌RNA，是 有90RNA的扩增 物可能不易观察。 用嵌套引物的RNA指 法可以提高 有RNA的可能川。它以第一 PcR 物的一 分作为 ， 用嵌
14、套引物(比第一 扩增引物3端增加一个 个 碱基) 扩增，这样多 的碱基对原 的物 currency1，使那 对好因 太低的 分可能 观察。为 一 提高fl ，可 cDNA结 在上 扩增即相差示PCR，它 的mRNA 极 ;为提高 异，可用不同 的同一样本作RNA指 图，有在多个下均存在的差异“才值考虑。2.4基因表达的 列分析法(alanalvsi，ofgeneexpre吧IOn，SAGE)SAGE是近发展 的鉴定差异表达基因的方法231。HOpkins大学研究 组首 sAGE用于分析在人类胰腺表达的基因。 从胰腺组 提 总mNA，原腆腺基因的cDNA，同时用一种生物素分子 cDNA的3末端，
15、 用一种 内切酶切割cDNA，接着用另一种 内切酶 上述DNA“切割 至 9一10饰的DNA 签“， 用PCR扩增上述每一 签“， 30一50个不同的签“ 一个单一的DNA分子， 克隆序这分子。 方法不 可以显示哪基因在 组 表达， 且可以显示它 表达水平的高低。每一个 签“ 的 是反映 荃因表达水平高低的指 。 方法 自动序及大表达序列 签相 ，能够对大 基因的表达变化 枪，具有 济 的 点。3从蛋白质水平 发从 功能的蛋白质入手是早用于克隆基因的方法。对于一肿瘤相关基因，首 发fl蛋白质， 推的分核酸序列， 用 同 比和匹 分析，currency1cDNA文库: 在 fi 的下用杭 cur
16、rency1表达序列 志 据库(ExPr画on傲习encetag，EST); 用cDNA末端 扩增法(RaPidam仙ficat汤ofcDNAends，RACE)以 相的CDNA，currency1基因组文库以 全长基因。分析不同类型表达的蛋白质可 ZD凝胶电 。抽提物在电 程蛋白质个 首 据 电荷， 据分子大 分 。电 结果呈一幅由1000一3000个斑点组 的 征图，每一个斑点表一个单一蛋白质。它在大 上不 显示了蛋白质的 且显示了它 的 多翻译 修饰。质仪可帮助人 研究的蛋白质据库的 对比分析，能给 分肤链的序列。至从论上 说， 每一茶ZD凝胶斑点编码 斑点的基因 是可能的。 切研究这基
17、因的功能，可以寻的诊具，如针对某种肿瘤的 蛋白质。人类基因组 划(HngeDomeproject，HGP)的 的是破译人类基因组3x109个核昔酸的序列，阐 有人类基因及fl在 上的位置，是生物领的一项重大程。美国于1990年 启动， 2005年完 全序列的定。 着各种 技术的诞生和 用，越 越多的 相关基因分。 前分辨率为0.7cm的 作图分辨率为100kb的物图 提前完 ， 入大规 序阶“。在序完 以，主要任务是功能荃因组的研究，即研究各基因的功能及fl表达规律， fl 用于 的 防 诊和治疗。前 有一个学说可以完 阐述HE的发生。普遍认为HE的发生是 内多种毒素协同作用的结果，至 有10
18、余种毒素 认为HE的发生有关。fl氨毒 认为着关的作用。早在60年人 注意血氮的水平HE的严重程 不完全一致，甚至在某肝昏 fi血氨水平不 高。70年末 二氮 的发和 对 统作用的研究，以及80年末内 物质致 说的提 ，使 多 致力于内 二氮类物质的提 分，直至 前 人 意的结果。不 作fi认为，HE的发生是多因素协同作用的结果。1.1 二氮 类物质的作用有人认为， 二氮 类物质的 不是在 内 ， 是存在于物 由生物 的。在肝功能常的下，这外 大分 肝 除，极 血 入 统，在肝 严重 时，这物质 聚于血 ， 入 统 二氮 致HE的发生。血的 二氮 类物质主要 子 ，这 为 吸 抗生 去 。近
19、ne等川 对90 志fi和113 肝化fi 了血 二氮 类物质定 发，肝化不有HE的59 fi在有49 ”， 肝化有HE的54fi49 ”，有7%的fi低于可定水平。作fi认为在肝化发生 程有血 二氮 类物质的 聚，fl 高程 肝功能减 程 相关， HE的程 显的相关，认为 类物质对 统的作用 于 统的功能 ，同样的 对常人可能 作用，在fl它毒素对 统 易化的下 可 致HE的发生。1.2氮A协同作用氨毒和GABA能 功能增强 认为是 致11E发生的 个主要因素。动物 ，氨对 统具有显著的currency1作用，这“ 可以分HEfi有的发生，fifl大分HEfi表为 功能的 不是currenc
20、y1。GABA是 fl类动物脑内主要的 质，fl 在 上 二氮 和 子 蛋白相 存在。GABA 化 致 子 的开 突 电位的 生， 引 ，这 于时 动功能和意识 低下有关。肝脑 时引GA能 ”紧 增加的 有:脑内 二 类物质 增加;血脑 增加和0A 的降低， 致GABA在突 内 聚。 电生和 为显示，氨 在0.75一2mM时可增强 能力，相反，当氮 在0.15一0.75mM时( 常 于昏 前期)可: GABA 的 子 动;增强GABAfl 的结;增加 型 的 ， 某 可强化GABA能 ” 能力t2。KanekO等3发，当血氨 0.1一。.5mo L时即可以 GA 子 的开增强GAI认的 作用，这种 作用不能 二氮 类 抗 逆转。当血氮 在50一100 L时可增强 二氮 类物质fl 的和力，接增强fl 作用，提示血氮 的 高可增强GABA的 作用。
