1、低分子肝素预处理对大鼠急性肺损伤的影响北京大学第一医院麻醉科邢军 吴新民【摘要】目的 探讨低分子肝素(LMWH)预处理对急性肺损伤(ALI )大鼠细胞因子和粘附分子表达的影响。方法 腹腔内注射内毒素制备 ALI 大鼠模型。50 只 SD 大鼠按随机数字表法分为正常对照组、ALI 组、LMWH 预处理组(100u/kg、200u/kg 和300u/kg) ,每组 10 只。观察肺湿干重比(W/D) 、BALF 中总蛋白浓度、肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性、肺组织 TNF- 水平、血浆凝血酶原时间(PT) 、活化部分凝血活酶时间(APTT) 、血浆纤维蛋白原水平以及肺组织 ICAM-1、E-se
2、lectin、组织因子(TF)和纤溶酶原激活物抑制物(PAI)-1 mRNA 的表达情况。结果 ALI 组的 W/D、BALF 总蛋白浓度、肺组织 MPO 活性和 TNF- 含量、肺组织炎性细胞因子、粘附分子的 mRNA 表达均明显升高(p0.05 ) (见表2) 。肺组织MPO活性、肺组织TNF- 含量的变化: ALI组的肺组织MPO活性和TNF-含量较 C组显著增加(p0.05) ;LMWH200 组和 300 组的 PAI-1 mRNA 表达较 ALI 组明显降低(p0.05) (见表 4) 。表 2 肺湿干重比、BALF 总蛋白浓度、肺组织MPO活性和TNF-含量的变化(n=10 s)
3、x组别 肺组织湿干重比 BALF总蛋白浓度(g/ml)肺组织MPO(U/g组织湿片)肺组织TNF-(pg/mg)C组 4.860.13 264.14120.99 51.5331.81 63.4528.59ALI组 6.221.09* 477.10101.08* 119.7664.60* 123.0964.27*LMWH100组 5.770.77 435.68207.98 66.0528.44# # 81.1751.99LMWH200组 5.170.44# 475.93231.94* 57.3110.33# # 74.9842.30#LMWH300组 5.390.63# 433.73259.32
4、 61.3712.28# # 80.9028.39与C组相比,*p0.05,*p0.001与ALI组相比, #p0.05, # #p0.05表 3 血浆 PT、APTT 和纤维蛋白原水平测定(n=9 s)x组别 PT(秒) APTT(秒) 纤维蛋白原(g/L)C组 17.571.74 15.662.83 1.630.06ALI组 21.961.87* 25.506.08* 1.070.32*LMWH100 组 21.862.12* 26.477.28* 1.290.39*LMWH200 组 19.791.36* # 23.684.42* 1.360.19* #LMWH300 组 21.761.
5、05* 29.505.34* 1.080.23*与对照组比较,*P0.05,*P0.01;与脂多糖组比较, #P0.05, #P0.01;表4 肺组织炎性细胞因子和粘附分子 mRNA的表达(x s)组别 ICAM-1 E-selectin TF(倍数) PAI-1(倍数)C组 1.000.25 1.000.79 1.00000.5479 1.00000.4380ALI组 2.230.90* 6.245.95* 3.56271.5021* 53.34629.6905*LMWH100组 1.840.36* 3.001.22* 5.35543.3624* 54.644019.0033*LMWH200
6、组 2.240.63* 5.315.48* 4.91041.4071* 34.34938.0510* #LMWH300组 1.750.66* 3.151.81* 4.01211.6189* 36.672510.3349* #与C组相比,*p0.05,*p0.001与ALI组相比, #p0.05, # #p0.001图1 C组 图2 ALI组图3 LMWH100组 图4 LMWH200组图5 LMWH300组讨 论低分子量肝素(low molecular weight heparin , LMWH)是近二十年发展起来的新一代肝素类抗血栓药物,它是由普通肝素(unfractionated hepa
7、rin,UFH)经化学或酶解聚的方法得到的相对低分子质量的肝素片段或经分级法得到的低分子量肝素组分,分子量范围一般为30008000D,平均分子量为5000D 左右。LMWH 有抗凝血、抗血栓、调血脂、抗肿瘤等作用。与普通肝素相比,LMWH具有皮下注射吸收好,半衰期长,生物利用度高,与血浆、血小板亲和力小,出血副作用少等优点。LMWH的主要药理作用为抗凝和抗血栓作用 (1、2) 。肝素的抗凝作用一般认为主要通过两个方面:(1)对凝血酶的抑制作用;(2)对凝血活性因子Xa ( FXa) 的抑制作用。LMWH的作用机制与肝素一样都是依赖于戊糖结构与抗凝血酶- (AT-)的结合,从而增强AT- 对X
8、a 因子和凝血酶的抑制作用。其中肝素抑制凝血酶的作用不但要求肝素与 AT- 的结合,还同时要求肝素与凝血酶的直接结合。这就需要肝素分子有足够的长度(至少18个单糖的长度,分子量至少为5400D),但肝素增强AT- 抑制Xa因子的作用不需要肝素与Xa 因子直接接触,此种作用对肝素无最低分子量上的要求。LMWH由于片断较短,大部分分子长度均低于18个单糖的长度,因此抗Xa 因子作用明显强于肝素。研究表明普通肝素抗Xa因子与抗凝血酶的活性之比约为1,而LMWH 抗Xa因子与抗凝血酶的活性之比介于24 之间。凝血酶的激活是血栓形成的主要因素之一,LMWH由于相对分子质量小有很强的抗Xa因子作用,能抑制
9、凝血酶的激活,还能抑制血小板聚集,减少暂时性血小板凝块转变为永久性血小板纤维蛋白凝块的发生几率,能改变血液流变性,降低血液粘度,维持血液正常流动,因而抗血栓形成作用更加明显。研究发现,LMWH 还具有许多其他的作用,例如:抑制肿瘤生长和转移的作用 (3、4) 、抑制肾小球系膜细胞及基质增生 (5、6) 以及调节血脂代谢、保护心肝肾组织细胞不受高胆固醇血症的损害 (7) 等作用。此外,LMWH还具有抗炎作用。近年来许多研究和实验观察到凝血与炎症存在相互作用的网络关系,一些天然抗凝物质具有抗炎作用。最初发现抗凝剂具有抗炎作用也是源于治疗炎症反应的凝血紊乱。有多项动物实验发现LMWH具有抗炎作用,其
10、可能的抗炎机制包括:(1)抑制血管内皮细胞上ICAM-1和E-selectin的表达,降低中性粒细胞与内皮细胞的粘附 (8) 。(2)通过电荷依赖性机制防止血小板、红细胞粘附、聚集; 结合并灭活对血管有损伤作用的活性物质以保护内皮细胞并促进损伤的内皮细胞修复和生长 (9) 。(3) 抗自由基损伤作用。肝素能抑制被激活的PMN 呼吸爆发, 并能阻止PMN 的粘附, 避免PMN释放自由基和溶酶体酶 (10) 。(4)降低炎性细胞因子的表达,从而减轻炎症反应 (11) 。LMWH还有抗过敏、抗补体、增强网状内皮系统吞噬细胞活性、直接抗内毒素等作用。在对类风湿性关节炎、支气管哮喘和炎性肠病的临床研究
11、(12-14) 中,LMWH也显示减轻炎症反应的特性。ALI是由感染等多因素引起的、以中性粒细胞浸润为主的肺组织炎症反应, 伴有 TNF-和IL-1 等细胞因子以及细胞间粘附分子(ICAM)、血管内皮粘附分子(VCAM) 和E选择素等粘附分子的过度表达 (15) 。多种炎性介质的产生和肺组织的广泛损害可引起急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和多器官功能障碍综合征(MODS)。同时,内毒素、TNF-和IL-1能刺激单核细胞和内皮细胞大量表达组织因子 ( TF), 激活外源性凝血途径,产生大量具有促凝作用的凝血酶。另一方面,内源性抗凝物质蛋白C(PC) 和AT- 水平显著下降,影响了抗凝系统的作用;
12、TNF-等细胞因子还导致纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)大量产生,造成纤溶抑制。既然LMWH 本身兼具抗凝和抗炎两大特性,那么在炎症发生初始或在某些高危易感病人中预防性使用能否减轻炎症反应呢?因此我们采用皮下注射LMWH和腹腔内注射LPS的方式模拟LMWH在临床的使用情况和腹腔内感染致急性肺损伤的模型,并对肺通透性、中性粒细胞激活、炎症介质的水平、粘附分子的表达以及凝血和纤溶等方面进行了测定。急性肺损伤时,激活的中性粒细胞在肺血管处聚集,浸润并迁移至肺间质和肺泡腔,释放促炎性细胞因子和氧自由基,破坏血管内皮和肺泡上皮的完整性,肺血管通透性增加 (16-18 。中性粒细胞在ALI时的炎症反
13、应中有着重要的作用。因此,人们常用中性粒细胞激活的强度来代表肺损伤的严重程度。髓过氧化物酶(MPO)主要位于中性粒细胞的胞浆中,在单核细胞和巨噬细胞中含量极低(19、20) PO活性的高低在很大范围内与中性粒细胞的数量成正比,并且检测方法简易可靠,现在已经被广泛用于评估中性粒细胞聚集并激活的程度。Sjoukje H等 (21 人对小鼠DIC 模型的研究中发现LMWH对肺组织MPO活性并没有降低的作用。Darien等人在进行LMWH对猪急性肺损伤影响的实验中显示,给予LMWH能缓解脂多糖介导的TNF-增加,减轻肺动脉高压以及中性粒细胞迁移和肺水肿。本实验采用比色法测量了肺组织MPO活性,用来量化
14、评估中性粒细胞在肺部聚集的多少。注射脂多糖4小时后,肺组织的MPO活性明显高于盐水对照组,而在给予LMWH预处理后MPO活性明显降低了(p0.05)。这说明 LMWH能抑制中性粒细胞在肺部的聚集。越来越多的证据表明,粘附分子参与并介导了细胞及细胞与基质的相互作用,在炎症的发生过程中起着重要作用。中性粒细胞与血管内皮细胞的结合并渗出是一个多重的过程,而粘附分子在此过程中发挥着不可替代的作用。有关粘附分子在ALI/ARDS中的作用,众多学者也进行了大量的研究。Sakamaki F等分别对19例ALI 患者、29例患有其他肺部疾病如特发性肺纤维化、肺炎等的患者及正常人的血浆可溶性P-选择素(PPS)
15、的浓度做了测定,结果发现ALI组患者的PPS 浓度明显高于非ALI组,也高于正常对照组,二者之间有显著性差异(p0.05 )。动物实验证实P-选择素单克隆抗体可抑制髓过氧化物酶(MPO)的活性,减轻肺出血,改善肺气体交换功能。Samer K等 (22 则报道ALI病人血浆中可溶性 E-选择素、ICAM-1 和量比健康志愿者显著升高,L-选择素含量大大下降,他们认为血浆中可溶性粘附分子可作为ALI病情监测的标志物。目前,观察LMWH对炎症反应时粘附分子表达的影响大多在内皮细胞与单核细胞共同培养的离体实验中进行研究。例如Manduteanu I等人的研究发现,依诺肝素( 血浆浓度16mg/ml)对
16、人脐静脉内皮细胞预处理后,能抑制脂多糖诱导的E-selectin表达和 TNF-刺激引起的 ICAM-1的表达,从而降低单核细胞与内皮细胞的粘附 (23) 。Lever等人观察到血浆浓度50-1000u/ml的LMWH能明显抑制中性粒细胞与激活的人脐静脉内皮细胞之间的粘附,但对粘附分子ICAM-1 和E-selectin的表达影响很小(34) 。而在另一个单核细胞与内皮细胞的离体研究中,LMWH并没有显示出对E-selectin表达的影响 (21) 。为了探讨 LMWH在活体ALI动物中的影响,本实验采用实时定量PCR的方法,测量肺组织ICAM-1和E-selectin的mRNA水平。这样便于
17、在分析LMWH在正常使用剂量时产生的效应。研究表明 (22) ,发生ALI/ARDS4小时后,病人血中可溶性粘附分子才开始升高,大约在24小时达到高峰。本实验拟定在注射脂多糖4小时时采集标本,因此并没有选择检测循环中可溶性粘附分子,而是采用实时定量RT-PCR的方法测定肺组织粘附分子mRNA的表达。我们知道,mRNA表达水平的改变会先于蛋白水平的改变。因此,我们希望通过这个方法确定LMWH对粘附分子表达有无影响。实验结果显示,LMWH预处理组的ICAM-1和E-selectin的mRNA表达较脂多糖组差异没有统计学意义。这与Manduteanu I等人在离体研究 (23) 中得到的结论有所不同
18、。原因可能有以下几点: Manduteanu I等人使用的依诺肝素的剂量很大,达到了血浆浓度16mg/ml ,而这么大的剂量在活体动物身上是不适用的。离体实验的内环境比较单一,影响因素少,而活体动物实验时内环境复杂,影响因素较多。从我们的实验结果来看,LMWH降低急性肺损伤时肺组织炎症反应的机制可能与降低粘附分子的表达无关。LMWH作为一种抗凝抗血栓的药物,由于其安全性高于普通肝素,因此在临床上预防血栓形成时,通常很少进行特殊监测。但是在某些危重疾病时,如急性肺损伤时,除了呼吸功能不全之外,常伴随着包括凝血系统紊乱在内的多个系统受累,病情非常复杂,在应用抗凝药物时常常会顾虑会有出血倾向,需进行
19、密切的观察和对凝血功能进行监测。此外,选用合适的剂量也能减少出血等不良反应。以往关于LMWH对急性肺损伤影响的研究所选用的LMWH剂量范围很大,有静脉给予5IU抗a 因子的弗希肝素(Fraxiparin )、给急性肺损伤大鼠皮下注射LMWH1000IU/kg以及静脉注射亭扎肝素钠(Tinzaparin )10mg/kg等,均未发生出血等不良反应。依诺肝素每1mg含100单位抗a因子,治疗深静脉血栓的剂量为1mg/kg(即100抗a /kg),高度血栓形成危险病人预防用药的剂量为40mg qd;中度血栓形成危险病人为20mg qd。在治疗弥散性血管内凝血时,低分子量肝素的剂量为75-150抗a/
20、kg/d。动物与人类凝血系统的状态是不同的。由于长期以来形成的自我保护机制,动物的凝血系统通常处于高凝状态,以便在自然环境中受伤后能够迅速止血。因此,本实验选用的依诺肝素的剂量比治疗人凝血紊乱时的剂量要大。为了明确LMWH 对急性肺损伤时凝血系统的影响,本实验测量了右心室血的PT 、APTT和纤维蛋白原水平以及肺组织TF 和PAI-1 mRNA的表达水平。结果显示,脂多糖组的PT和APTT值较盐水对照组明显延长(p0.05 ),血浆纤维蛋白原水平明显降低(p0.001)。这说明在给予脂多糖4个小时后已经处于低凝状态了。我们的预实验显示, 在给予脂多糖后1、2和3小时时测定右室血PT、APTT和
21、纤维蛋白原水平,PT 和APTT的值均较盐水对照组延长,血浆纤维蛋白原水平均降低。因此,从全身凝血状态上来说,从注射脂多糖起就开始向低凝方向发展了。文献上所说的脂多糖引起的高凝状态和纤溶抑制应该发生于受累脏器的微循环中,类似于DIC病生理过程中的微循环障碍。在我们给予LMWH预处理后,LMWH200u/kg组的PT值较脂多糖组明显降低(p0.05),APTT值也有所降低,但与脂多糖组相比差异没有统计学意义。LMWH100u/kg组和300u/kg组的PT 和APTT值与脂多糖组相比无明显差异。在血浆纤维蛋白原水平方面,LMWH200u/kg预处理组能明显升高纤维蛋白原水平(p0.05),减少纤
22、维蛋白原的消耗。从我们的实验结果大概可以看出,过高或过低的LMWH 剂量均不能改善ALI 时的凝血紊乱,需要选择适宜的剂量。在本实验中,LMWH300u/kg 组的大鼠有2只发生了眼球结膜出血。组织因子(TF)是位于细胞表面可溶性的糖蛋白,是外源性凝血通路的启动因子。组织因子除凝血作用外尚具有促进炎症反应的作用。TF 强烈的促炎症反应主要由单核细胞及其释放的化学增活素介导,需要VIIa因子诱导的钙外流参与。 TF可增加白细胞粘附及从内皮细胞渗出,促进氧自由基产生、纤维蛋白原形成、组织相容性复合物和细胞粘附分子的表达 (25)。TNF-和IL-1使内皮细胞组织型纤溶酶原激活物 (tissue p
23、lasminogen activator, tPA)的合成减少,却增加了组织型纤溶酶原激活物抑制剂(tissue plasminogen activaor inhibitor , tPAI)的合成,这些机能紊乱的最终结果是纤溶酶的生成减少及活性降低。脂多糖组TF和PAI-1的表达明显高于盐水对照组( p0.05),三个LMWH预处理组的TF 表达较脂多糖组没有降低,但LMWH200组和300组的PAI-1的表达与脂多糖组相比明显降低(p0.05)。结合血浆纤维蛋白原的实验结果来看,LMWH预处理对纤溶系统的改善更为明显。本实验给予LMWH 时间是在ALI 发生以前,而在许多临床情况中,通常是在
24、ALI发生以后才给予LMWH ,那么这时LMWH 会产生什么影响呢?另外,鉴于动物与人在各个方面还存在着差异,在动物实验中得到的结论也不能完全简单地应用于临床实验或临床病人的治疗,还需对LMWH改善急性肺损伤的机理和临床剂量的选择进行更多的研究,以便更好地为ALI的临床治疗提供理论依据。我们可以对临床上使用LMWH预防深静脉血栓的手术病人和因需呼吸机支持、长期卧床导致体内高凝而需LMWH治疗的病人进行回顾性研究,观察LMWH 的应用对炎症因子等方面的影响,这样就可以知道在正常临床剂量时LMWH能否产生抗炎作用。从本实验的结果来看,LMWH200u/kg 预处理能更明显地减轻大鼠急性肺损伤时中性
25、粒细胞在肺部激活,降低 TNF- 的水平,改善肺血管的通透性,从而减轻急性肺损伤。同时,这个 LMWH 剂量也能有效的改善 ALI 时的纤溶系统的紊乱,降低纤维蛋白原的消耗。结 论6mg/kg 的脂多糖腹腔内注射可以导致大鼠急性肺损伤,同时在给予 4 小时后导致低凝状态。LMWH100、200 和 300u/kg 预处理没有影响肺组织粘附分子的表达,但能减少中性粒细胞在肺部聚集,降低肺组织 TNF- 含量。LMWH200u/kg 预处理改善了纤溶系统的紊乱,减轻了急性肺损伤诱发的纤维蛋白原的消耗,但是对低凝血状态无明显影响。参考文献1. Hirsh J, Warkentin TE, Shaug
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