1、骨质疏松的机制 和治疗药靶,一、破骨细胞与骨头吸收,破骨细胞来源于造血干细胞，与单核细胞和巨噬细胞相系密切。,M-CSF:巨噬细胞集落刺激因子 RANKL:破骨细胞分化因子,CTR:降钙素(calcitonin )受体 TRAP:抗酒石酸酸性磷酸酶,RANKL是破骨细胞生成的关键因子,破骨细胞的生成,从破骨细胞前体分化成多核的破骨细胞主要依赖于RANKL结合到破骨细胞中的受体RANK上，激活破骨细胞,RANKL（receptor activator of NF-B ligand ）：TNF家族成员，起巨噬细胞集落刺激因子作用， RANKL在成骨细胞、骨髓基质细胞，以及T和B淋巴细胞中表达 RA
2、NK :RANKL受体 OPG: RANKL的可溶性受体，起抑制信号作用,RANK 信号通路,RANK 有三个TRAF结合基序，可募集6种TRAF蛋白 基序1募集TRAF6,激活6条主要的信号通路（Akt, NFATc1, NF-B, JNK, ERK and p38) ，涉及破骨细胞的分化、功能和存活，其功能类似于TNF 和 IL-1，与免疫应答有关 基序2和3与那个TRAF结合还不是很清楚，都能激活NF-KB，基序2还激活P38，这两个基序涉及破骨细胞生成，是治疗骨质疏松的靶点 。 RANK 还含有一个IVVY基序，结合与TRAF无关的信号蛋白（？），介导Rac的激活，涉及破骨细胞骨架构架
3、和破骨细胞谱系的定型，是治疗骨质疏松的靶点。,c-Src, TAB2 TAK1,TAB1,NFATc1, 在破骨细胞前体中表达，是破骨细胞生成的重要调节者,TRAF:肿瘤坏死困子受体相关因子 NFATc1: T细胞激活核因子c1,NFATc1破骨细胞分化的主要转录因子,成骨细胞分泌的RANKL和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，在巨噬细胞前体中，激活Fos的表达，后者又介导破骨细胞分化的主要调节者-T细胞激活核因子C1 (NFATc1) 的表达，诱导破骨细胞分化。NFATc1可诱导破骨细胞表达的基因有： 抗酒石酸酸性磷酸酶（ TRAP ） 组织蛋白酶K（ cathepsin K ） 氯离通道
4、7（ Clcn7 ） MMP-9 ephrinB2,RANKL/RANK/OPG系统,Wnt信号与骨吸收,Wnt5aRor2 信号是破骨生成的重要信号， Wnt5a 从成骨谱系细胞中分泌，结合成破骨细胞前体细胞上的Ror2t和其受体复受体上，激活Jnk，以致 cJun 募集到RANK 启动的SP1上，促进RANK的表达，增强RANK诱导的破骨细胞的生成。而 GST-sRor2是抑制骨形成。,非经典的Wnt信号能提高RANKL的水平，能促进骨吸收,破骨细胞的激活,RANKL结合到 RANK后，激活一些关键的转录因子和酶，促进破骨细胞的分化、增值、多核化、激活和存活，深入诱导骨吸收。,破骨细胞在激
5、活后，在整合素v3 的帮助下，破骨细胞粘附在骨表面，形成一个封闭区，质子泵和氯离子通道打开，产生高酸性的微环境，催化破骨细胞酶 cathepsin K 的活性，降解胶原，分解骨头。 整合素结合到骨表面上，激活整合素依赖性蛋白激酶Src 激酶信号。,二、成骨细胞与骨形成,成骨细胞来源于间质干细胞(MSCs),成骨细胞生成涉及核心转录因子Runx2,Osteopontin:骨桥蛋白 Osteocalcin:骨钙素 Sclerostin:硬骨素,DMP-1：牙本质基质蛋白 I COll I :胶原蛋白 I TNAP：组织非特异性碱性磷酸酶,Runx2 是成骨形成必需的转录因子,在I型胶原蛋白弱表达的
6、前成骨细胞中，可以检测到Runx2的表达，然而在表达骨钙素 (OC) 的成熟成骨细胞中， Runx2 的表达下降 。随着成骨细胞转化成能表达CD44, DMP1 和 MEPE的骨细胞，硷性磷酸酶降低，而OC升高。 Runx2的表达和转录活性受成骨细胞分化过程中的多种蛋白质严格调节。,Runx2是骨形成过程中成骨细胞分化、基质产生和矿化必需的转录因子,Col1A1:胶原1型蛋白1 ALP:碱性磷酸酶 OPN:骨桥蛋白 BSP:骨唾液酸蛋白 OC:骨钙素,MEPE:细胞外磷糖蛋白基质 DMP1:牙本质基质酸性磷蛋白,剌激成骨细胞分化的生长因子,两个生长因子家族刺激成骨细胞从MSCs分化，它们都能调
7、节Runx2的表达Wnt TGF家族,Wnt信号通路,-catenin 依赖性经典通路,-catenin 非依赖性非经典通路,PCP:平面细胞极性,DDK1抑制Wnt信号,-catenin 稳定化后，转移到核，与TCF结合，促进基因表达，这些基因包括：cyclin D1, c-myc, c-jun, VEGF、 Runx2、 Osx，以及一些与细胞生长相关的生长因子，如：TGF-等DKK1能竞争性结合到LRP5/6，使后者与Kremen 结合而失活，导致形成 -catenin 降解复合物， CKI和 GSK3 磷酸化-catenin，使-catenin通过泛素途经被解降。,Wnt 3a、5a、
8、7b 和10b 等Wnt分子与 Ihh共同捉进成骨细胞的分化DKK1 抑制成骨细胞生成，使发育过程向脂肪生成方向发展。 -catenin/TCF1通过诱导骨头主要发育蛋白Runx2表达，承担促进早期成骨细胞谱系的义务，而DKK1 通过Wnt信号通路抑制 Runx2 表达 Runx2促进次级骨头发育主要转录因子Osterix (Osx) 的转录活性（旁边标注的是普系特异性的表型标记物） 激活Wnt信号通路，能上调OPG表达，抑制RANKL表达,Wnt信号调节成骨细胞生成,非经典 Wnt 通路 通过Ca2+-CaMkII-TAK1- TAB2-NLK 信号抑抑制PPAR- 的转录活性，促进成骨细胞
9、生成，Wnt5a 激活NLK，生成一个共抑制复合物，使PPAR-失活，,非经典 Wnt 通路与成骨细胞生成,TGF-家族信号通路,经典Smad依赖的TGF- 信号， TGF-首先结合到II型受体 (R-II) 和I型受体 (R-I), 然后转导到 Smads， 激活的Smads 2/3 与Smad4 形成复合物，然后转入核，激活转录，启动Runx2基因表。Smad7 能破坏激活的Smad2/3与 Smad4形成复合物。 非Smad依赖性TAK1 信号通路也调节骨形成。,TGF-能调节Runx2和 osterix 表达,PTH 结合激活PTH1R，刺激几个下游效应子，驱动t PTH1R-TGFR
10、II 复合物的内化，降低 TGF- 和 PTH 信号，CREB介导成骨细胞中的PTH信号。,BMPs 属于TGF-超级家族,Smad依赖的BMP信号， BMP结合到R-II 和 R-I，然后信号转导至Smads，激活的Smads1/5/8与 Smad4 形成复合物，转移到核，启动靶基因表达。 Neogenin 调节BMP受体的联系和Smad1/5/8 信号。激活的 Smads 调节成骨细胞中转录因子和转录共活化因子(Dlx5, Runx2 and Osx) 的表达。Smad6 结合 I型BMP受体，抑制 Smad1/5/8 的激活。 非Smad依赖的TAK1 信号通路也调节骨形成。,BMPs
11、和 Wnt 信号相互作用影响骨的形成，BMPRIA 信号上调Sost 表达，主要通过Smad依赖的信号，而它又通过Smad依赖和非Smad依赖的信号上调DKK1，Sost 和 DKK1都能抑制经典 的 Wnt信号，导致骨质降低。,三、骨细胞,形态类似于神经细胞，有长的树枝状突出的管道，在骨细胞之间连接成网络，形成感应网络 骨细胞能表达许多可以调节磷盐的因子，在基质的矿化过程中起着重要的作用 骨细胞能分泌硬骨素（sclerostin），是Wnt信号通路的抑制剂，可抑制成骨细胞分化和骨形成 骨细胞能通过TGF-B降低RANKL的表达抑制骨吸收,骨细胞在所有的骨头细胞中占 90 %，分散在矿化的基质
12、中。是最终分化的成骨细胞,骨细胞能沿着树枝极化到骨表面，并与成骨细胞和骨衬细胞接触，感应微裂缝、裂纹和机械负荷丧失，触发破骨细胞分化。凋亡的骨细胞可能分泌一些因子达到骨表面诱导破骨细胞分化。,四、骨头重构的三个阶段,在启始阶段，开始于造血前体细胞的募集，成骨细胞谱系表达RANKL，诱导破骨细胞分化，形成多核破的骨细胞，吸收骨头 转换阶段，以骨头吸收到骨头形成为标志，通过偶合因子开启，这些因子可以是可扩散的因子、膜结合分子，或骨基质内含有的因子 终止阶段，由于成骨细胞的骨形成活性，确保成骨细胞在吸收陷窝内填充，而且，成骨细胞扁平化形成新骨头表面的骨衬细胞层,启始阶段 早期 的始发阶段，破骨细胞前
13、体的募集 在骨表面上骨衬细胞下，破骨细胞分化转换阶段 (c) 多核的破骨细胞进行骨吸收，诱导成骨细胞分化。(d)破骨细胞在骨吸收陷窝内凋亡 终止阶段 (e) 成骨细胞生成和骨细胞的产生 (f) 进入静态,骨重构发生于对不同剌激的响应：骨微裂、失去机械负荷、低血钙、激素和细胞因子变化等,骨细胞定位并响应刺激，刺激表面的骨髓基质细胞、骨血管内皮细胞、成骨细胞分泌RANKL和一些趋化因子，募集破骨细胞前体，触发破骨细胞分化。,RANKL等介导破骨细胞分化，然后，破骨细胞通过整合素avb3与骨基质上的玻连蛋白、粘连蛋白和骨桥蛋白相互作用。,启始阶段,过渡阶段,在过渡阶段，骨吸收的破骨细胞刺激成骨细胞前
14、体分化，在骨吸收陷窝处激活骨的形成。随着骨形成的激活，破骨细胞的骨吸收停止，破骨细胞通过Bim/caspase-3依赖途经过雌激素诱导的Fas配体，经受凋亡。 在骨吸收过程中，破骨细胞分泌盐酸分解羟基磷灰石，以及组织蛋白酶K分解胶原和其它基质蛋白。 破骨细胞的骨吸收会从基质中释放出生长因子如：TGF-b、BMPs和IGF-II等，这些反过来又激活成骨细胞的形成。 破骨细胞产生分泌的或膜结合的分子能作用于成骨细胞前体刺激骨的形成。 为什么成骨细胞会在骨吸收陷窝处成骨，在没有破骨细胞的骨吸收陷窝内，V型抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）和TGF-b受体相互作用蛋白(TRIP-1)可能起了重要作用。 骨
15、头吸收会刺激对等的骨形成（偶联），有多少骨吸收就能诱导多少骨形成。,红色的是正在临床应用或还在临床研究的，绿色为可能的靶,骨重构各阶段及涉及的因子,TRAP (Tartarate resistant acid phosphatase) Trph1 (Tryptophan hydroxylase 1 WIF (Wnt inhibitory factor) sFRP (Secreted frizzled related protein）,骨重构过程中的偶合刺激因子和抑制因子,其中 ephrins/Ephs 非常重要,ephrins/Ephs重要的偶合因子,Eph受体与蝶素（ephrin)在细胞表面
16、结合，触化双相信号：向前，通过Eph受体（如：EphB2），激活Eph激酶活性和激酶依赖信号，反向，通过ephrin，激活Src家族激酶和其它效应因子。从而，改变细胞粘附、迁移、分化。,ephrinB2在分化中的和成熟的破骨细胞中表达，而ephrinA2在早期的分化中的破骨细胞中表达。 反向，ephrinB2通过含PDZ结构域的蛋白质(如Dvl2)介导反向信号，抑制Fos和Nfatc1的转录，抑制破骨细胞的分化。LephrinA2通过激活PC2介导反向信号。 向前，dEphB4通过抑制RhoA的活性刺激成骨细胞分化，而通EphA2可能增强RhoA的活性，而抑制成骨细胞的分化。 而RhoA是如何
17、受体EphB4和EphA2不同调节还不清楚。,终止阶段,骨形成过程缓慢，约三个月，而骨吸收大约3周。 骨细胞产生sclerostin，并通过微管分泌。sclerostin抑制成骨细胞的骨形成，使成骨细胞安静下来。 在终止阶段，破骨细胞的分化受成骨细胞产生的OPG所抑制。 成熟的成骨细胞中Wnt信号通路调节OPG的转录,抑制破骨细胞生成。 Notch 配体表达于破骨细胞，破骨细胞与成骨细胞相互作用诱导成骨细胞中的Notch信号通路，增加OPG的产生，抑制破骨细胞的形成,骨吸收与骨形成不平衡相关疾病,骨吸收和骨形成的任务不平衡，都会造成骨不正常 石骨症（osteopetrosis）：破骨形成缺陷，
18、或破骨细胞的骨吸收功能缺陷 骨硬化症(osteosclerosis )：骨形成增加 骨质疏松（osteoporosis）：骨吸收增加，与骨吸收相比，骨形成相对降低,五、骨质疏松,骨质疏松的根本机制是骨吸收和骨形成之间的不平衡。正常情况下，骨基质的重构是恒定的，多达10 %的骨质在任何时间都在进行着重构。 在重构过程中，过度的骨吸收和不适当的新骨形成是骨质疏松的根本原因。,骨质疏松的诊断,传统的X-射线图像：传统的 X-射线图像，或者，与CT或 MRI合用，主要特征是骨皮质变薄和射线透射性增加。灵敏度低，30%的骨流失量才能在X-射线图像中出现，常检查脊椎，如： T4-L4 ，表现为高度和面积减
19、少。,Multiple osteoporotic wedge fractures demonstrated on a lateral thoraco-lumbar spine X-ray,双能量X-射线 (DXA)是骨质疏松诊断的金标准，用骨矿物质密度指数T-score来表示,cathepsin K ：也是诊断骨质疏松的一个重要的指标，可以用抗体检验其中的neoepitope片段； 尿药排泄的1型胶原蛋白的碎片也成骨质疏松的标志物,六、骨质疏松治疗靶点和药物,骨质疏松的治疗药物分为两类： 抗吸收药物，减慢骨吸收 骨生成药物，刺激骨形成,抗吸收治疗,成骨细胞与破骨细胞的功能是双向信息交流偶联的
20、经典的抗吸收作用是降低破骨细胞的活力，结果是破骨细胞的信号和相继的成骨细胞的形成都被抑制 解偶联抗吸收只抑制破骨细胞的作用，而不是破骨细胞的活力，让破骨细胞与成骨细胞之间能进行信息交流，维持成骨细胞的形成,治疗的靶点及药物,Estrogen受体Estrogen直接降低RANKL表达，增加OPG分泌，抑制破骨细胞。间接抑制炎症因子和增加IGF-1和TGF-1在成骨细胞中的表达。SERMs（选择性雌激素受体调节剂），结合到其受体抑制破骨细胞功能,双磷酸盐类药物Bisphosphonates, 降低骨折 PTH间歇性的PTH 钙受体拮抗剂：拮抗CaSR ，可唤起PTH分泌的短期脉冲，缺点是治疗指数较
21、窄，如：MK-5442 Cathepsins K (CatK) 抑制剂，如：odanacatib,激动剂：加强受体与特定的共激活剂(CoA)相互作用，细胞的响应决定于不同组织中表达特定的CoA的水平 拮抗剂：促进受体与共抑制剂相互作用(CoR) 选择性受体调节剂(SERMs)：使受体与不同的共激活剂或共抑制剂的亚型相互作用，使药物在不同的组织发挥不同的作用,Src tyrosine kinase抑制剂，如：Saracatinib， Src kinase 的ATP竞争抑制 剂 Wnt抑制分子：sclerostin 和 Dkk-1 是可能的靶点。抑制它可以促进骨形成。如：Sclerostin an
22、tibody（Romosozumab）Dickkopf-1 antibody (BHQ-880) RANKL 拮抗剂，如：RANKL的抗体Denosumab,可能的靶点,Nitric oxide (NO)基于骨内NO/cyclic GMP/PKG信号，增强骨细胞的成活和骨形成，活化， 如： cinaciguat Sirtuin1NAD+依赖的去乙酰化酶，可以使重要的转录因子共因子去乙醯化，如：FoxO家族和-catenin等，激活Wnt信号通路。活化，如：Resveratrol （白黎芦醇） tryptophan hydroxylase 1 (Tph-1)周边血清素合成的主要酶，血清素能抑制成
23、骨基因的增值。抑制剂，如： LP533401 Glucagon-like peptide 1 (GLP-1)作用于成骨前体细胞中的GLP-1受体，通过降钙素依赖性通路， PTH-related protein (PTHrP)表达于骨头中，调节骨的形成 OPG结合RNAKL,Vitamin K调节骨钙素osteocalcin 的 羧基化，有利于结合到矿物磷灰石上。 Activin A激活素A, 通过 Smad通路，促进破骨细胞生成，抑制成骨细胞分化。拮抗剂 Glycogen synthase kinase-3 (GSK-3)抑制Wnt信号通路的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，抑制剂 11-Hydroxy
24、steroid dehydrogenase type 1 (11-HSD1)能将皮质酮转化成对骨有害的皮质醇，抑制剂 PPAR转录因子，将前体细胞分化的脂肪细胞，抑制它可以促进前体细胞分化成成骨细胞还不是脂肪细胞。其抑制剂对糠尿病骨质疏松可能更有吸引力 semaphorins (Semas)信号素通过与破骨细胞和间质前体上的神经纤毛蛋白-1（neuropilin-1）相互作用，Sema3A能抑制破骨细胞的形成和成骨细胞的分化。 Bone morphogenetic proteins (BMPs) Glucagon like peptide 2 (GLP-2)抑制PTH分泌,七、骨、肾和淫羊藿,
25、中医观点： 补肾强骨 淫羊藿，味辛甘性温，入肝、肾经。具有温补肾阳,BMP-7能刺激成骨细胞的增生和分化，影响骨细胞的活性（是否受FGF23 调节不明） Calcitriol（生理水平）激活成骨细胞中的VDR受体，通过调节RANKLOPG直接影响骨细胞生成和活性。但是，如高生理水平对骨头是有害的。 PTH, 能促进破骨细胞形成,骨-肾-副甲状腺内分泌轴 受成纤维细胞生长因子（FGF23) 和klotho的调节。有活性形式的维生素D（钙三醇）结合到骨细胞中的维生素D受体（VDR）上，调节FGF23的表达和分泌， FGF23结合到在肾和副甲状腺中表达的Klotho-(FGFR）复合物上。在肾中FG
26、F23可抑制编码1-羟化酶的基因Cyp27b1的表达，从而可抑制25(OH)D3向钙三醇的转化；同时FGF23可增加编码24-羟化酶的基因Cyp24表达，该基因可抑制钙三醇的活性，降低血清中钙三醇的水平。在副甲状腺中，FGF23抑制PTH的表达。由于PTH是Cyp27b1基因表达的诱导者，通过FGF23抑制PTH，能降低Cyp27b1基因的表达，同时降低血清中钙三醇的水平。,FGF23/Klotho轴,FGF23作用需要klotho的帮助，没有它，将难以发挥作用。,FGF23 能刺激MSC的分化，诱导骨生成，在MSC中表达，决定着MSC细胞的谱系命运,调节Klotho表达的药物筛选,淫羊藿提取
27、物做为筛中物，意味着淫羊藿能调节Klotho基因表达可能是补肾强骨的基础。 是不是黄酮？不清楚！,如何做中药的抗骨质疏松的研究,基于骨质疏松的分子机制，研究中药的机制 1）是作用在骨重构的哪个阶段？骨吸收，还是骨形成？破骨细胞，成骨细胞的增值、分化，关键的标志分子等。 2）通过什么途经？关键的转录因子，ANKL信号，Wnt，TGF-家庭等蛋白质水平，磷酸化水平，蛋白质相互作用等 3）靶点是什么？（难！）文献分析，预测，顺藤摸瓜，验证，运气！,淫羊藿黄酮的抗骨质疏作用,从蛋白水平变化分析，能调节两条信号通路相关蛋白水平，最终调节Runx2这个骨生成的关键的转录因子的变化，说明药物能促进骨生成。 1）但为什么可以调节这些蛋白质的变化，不清楚，靶点？（性激素受体？） 2）在骨吸收方面，是否有功能，未知,THANK YOU,
