1、第二章 微生物发酵制药技术,学习目标,知识要求： 1.掌握制药微生物菌种的选育及保藏技术，发酵方式、工艺条件、主要控制参数 ； 2.熟悉培养基制备及灭菌操作技术； 3.熟悉微生物代谢产物的生物合成； 4.了解微生物发酵药物的分类 能力要求： 1.熟练掌握菌种选育及保藏技术、发酵工艺条件； 2.学会培养基制备技术，灭菌操作技术。,第一节 概 述,一、微生物发酵制药的发展简史,微生物发酵制药的历史悠久。免疫学方面，我国宋朝真宗年间（公园998-1022年）就开始利用接种人痘的免疫技术预防天花病。1796年英国医生E.Jenner利用接种牛痘苗预防天花并获得成功。到19世纪末，陆续发明了预防或治疗各
2、种细菌性传染病的疫苗和类毒素。此后，利用微生物生产疫苗的研究获得了蓬勃的发展。,第一节 概 述,一、微生物发酵制药的发展简史,第一节 概 述,一、微生物发酵制药的发展简史,直到第二次世界大战初期，随着人们对抗生素，尤其是对青霉素重要事件的认识，才大大推动了微生物发酵制药的发展。1929年Fleming在研究金黄色葡萄糖球菌时偶然发现了青霉素，但是当时人们认为动物实验的结果不能指导人的医学实践。,第一节 概 述,一、微生物发酵制药的发展简史,直到10年后，才通过动物实验，把青霉素从细菌学家好奇的物质转变为医学上具有活力的物质。1941年Florry利用发酵技术制备大规模青霉素获得成功。,第一节
3、概 述,一、微生物发酵制药的发展简史,1939年Waksman开始系统地有计划地筛选新抗生素。,1940年 放线菌素 1947年 链霉素 1948年 金霉素 1951年 红霉素,第一节 概 述,一、微生物发酵制药的发展简史,随着细胞融合技术和基因工程的问世，为微生物制药来源菌的获得提供了一种有效的手段。工程菌和融合子经发酵后生产原料微生物所不能产生的药物或提高生产效率。同时近年来发酵工艺及其控制研究也得到了发展，利用计算机在线控制以及固定化细胞技术为微生物发酵制药工艺带来了新的发展空间。,第一节 概 述,一、微生物发酵制药的发展简史,我国微生物发酵制药工业起步较晚。 1949年 上海建立了青霉
4、素实验所；1953年 5月1日上海第三制药厂正式投产青霉素；1958年 建成华北制药厂，投产了青霉素、链霉素、土霉素和红霉素等品种；,第一节 概 述,一、微生物发酵制药的发展简史,我国微生物发酵制药工业起步较晚。 1957年 我国开始氨基酸发酵的研究，1964年谷氨酸发酵成功；50年代 开始核酸发酵生产；70年代 成功研究出“二步发酵法”生产维生素C技术。目前 基因工程药物已经成为研究热点。,第一节 概 述,二、微生物发酵制药研究的内容,微生物发酵制药是利用微生物进行药物研究、生产和制剂的综合性技术科学。内容包括：1.微生物制药用菌的选育2.发酵3.产品的分离、纯化工艺,第一节 概 述,三、微
5、生物发酵药物的来源,微生物菌体发酵：蜜环菌、酵母菌微生物酶发酵：微生物代谢产物发酵：微生物转化发酵：,第一节 概 述,三、微生物发酵药物的来源,微生物菌体发酵：微生物酶发酵：天冬酰胺酶、链激酶微生物代谢产物发酵：微生物转化发酵：,第一节 概 述,三、微生物发酵药物的来源,微生物菌体发酵：微生物酶发酵：微生物代谢产物发酵：氨基酸、抗生素微生物转化发酵：,第一节 概 述,三、微生物发酵药物的来源,微生物菌体发酵：微生物酶发酵：微生物代谢产物发酵：微生物转化发酵：,C-1,2脱氢,简单节杆菌,醋酸可的松,醋酸泼尼松,第一节 概 述,四、微生物发酵药物的分类,1.抗生素类药2.氨基酸类药3.核苷酸类药
6、4.维生素类药5.甾体类激素6.治疗酶及酶抑制剂,第二节 制药微生物与产物的生物合成,一、制药微生物的选择,1.样品采集与处理2.分离方法3.活性测定,第二节 制药微生物与产物的生物合成,二、制药微生物菌种的选育,菌种选育的目的：改良菌种的特性、开发新产品药物高产菌株或分泌型特效药物菌株的选育包括：自然选育和人工育种。人工育种：1.诱变育种2.杂交育种3.基因工程育种,第二节 制药微生物与产物的生物合成,二、制药微生物菌种的选育,（一）自然选育注意：遗传特性不稳定，容易继续变异；需要经常进行选育工作；能提高平均生产水平，但不能大幅提高。,第二节 制药微生物与产物的生物合成,二、制药微生物菌种的
7、选育,（一）自然选育,制备单孢子悬浮液,分离出单菌落,斜面种子,高产菌株,沙土管菌种,斜面种子,摇瓶复筛,高产纯化株,生产菌种斜面,第二节 制药微生物与产物的生物合成,二、制药微生物菌种的选育,（二）诱变育种定义：采用诱变剂处理可以大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出只有优良特性的变异菌株。 特点：速度快、收效大、方法简便缺乏定向性 三个环节：突变的诱发突变株的筛选突变高产基因的表现,第二节 制药微生物与产物的生物合成,二、制药微生物菌种的选育,1.制定筛选目标 2.制定筛选方案 2）留种保藏菌种（1）诱变过程 3）筛选高产菌株1）出发菌种的斜面2）单孢子悬浮液制备3）孢子计数4）单
8、菌落分离（2）筛选过程1）传种斜面,第二节 制药微生物与产物的生物合成,二、制药微生物菌种的选育,3.突变的诱发（1）出发菌株的选择1）选择纯种：产量稳定、波动范围小2）选择具有优良性状的出发菌株：生命力旺盛3）对诱变剂敏感（2）诱变剂的选择,第二节 制药微生物与产物的生物合成,二、制药微生物菌种的选育,3.突变株的筛选（1）随机筛选1）摇瓶筛选法2）琼脂块筛选法：需经摇瓶复筛验证3）筛选自动化和筛选工具微型化（2）理性化筛选,第二节 制药微生物与产物的生物合成,三、制药微生物菌种的保藏,保藏目的：保持菌种的活力，防止退化 保藏环境：低温、干燥、缺氧 （一）定期移植保藏法 斜面培养、液体培养、
9、穿刺培养 特点：菌株有代谢活性，保存时间不长， 传代多，菌种易变异 （二）砂土管保藏法 特点：保存抗生素生产菌，操作简便、 效果好，长达1年、变异率低、死亡少,第二节 制药微生物与产物的生物合成,三、制药微生物菌种的保藏,（三）液状石蜡保藏法斜面保藏的改进型 （四）液氮保藏法防止菌种退化的最佳方法 （五）冷冻干燥保藏法 （六）低温冷冻保藏法存活率高，变异率低，实用方便 （七）谷粒（麸皮）保藏法适用于产孢子放线菌和真菌 四、微生物代谢产物的生物合成（自学）,第三节 发酵工艺条件的确定,一、培养基及其制备,培养基是专门用于提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质
10、的混合物。 （一）培养基的成分1.碳源 供给菌生命活力所需要的能量，构成菌体细胞成分和代谢产物。葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、淀粉,第三节 发酵工艺条件的确定,一、培养基及其制备,2.氮源 构成微生物细胞和代谢产物中的氮素来源的营养物质，补充碳源。 分为：有机、无机氮源两类无机氮源成分单一、 有机氮源成分复杂， 质量稳定、易被菌体吸收 被菌体利用的速度不同 利用，铵盐为速效氮源。 不同比例可调节发酵液的pH。,第三节 发酵工艺条件的确定,一、培养基及其制备,3.无机盐和微量元素 磷：菌体核酸、核蛋白的组成成分，辅酶和高能磷酸键的成分，也是氧化磷酸化的必需元素，还可调节pH。硫：含硫氨基酸的成分，
11、也是某些产物成分。铁：细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化酶的组成元素。锌、镁、钴：酶的辅酶或激活剂。钠、钾、钙4.水5.前体：内源性、外源性,第三节 发酵工艺条件的确定,一、培养基及其制备,（二）培养基的种类与选择1.培养基的种类（1）孢子培养基：制备孢子（2）种子培养基：孢子发芽、菌体生长繁殖（3）发酵培养基,第三节 发酵工艺条件的确定,一、培养基及其制备,（三）影响培养基质量的因素1.原材料质量的影响2.水质的影响3.灭菌的影响4.pH的影响5.其他影响因素：黏度,第三节 发酵工艺条件的确定,二、灭菌操作技术,（一）灭菌原理和灭菌操作灭菌是指用化学或物理学放入方法杀死或除掉物料或设备中所有生
12、命的有机体的技术或工艺过程。高温快速灭菌法 （二）无菌检查与杂菌的处理1.无菌检查： 无菌试验、发酵液直接 镜检、发酵液生化分析2.染菌的判断,第三节 发酵工艺条件的确定,二、灭菌操作技术,3.染菌的防治技术 （1）污染杂菌的处理 （2）污染噬菌体的发现与处理噬菌体是由D.Herelle和Twort各自 独立发现的。噬菌体是感染细菌、真菌 、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总 称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称 为噬菌体。 （3）防止染菌的措施 设备、空气,第三节 发酵工艺条件的确定,三、微生物发酵的三种主要操作方式,1.分批发酵2.补料分批发酵3.连续发酵,第三节 发酵工艺条件的确定,四、发酵
13、过程中的主要参数及控制,（一）发酵过程的主要控制参数1.温度2.压力3.空气流量4.黏度5.pH6.基质浓度7.溶解氧浓度8.产物浓度9.菌体浓度,第三节 发酵工艺条件的确定,四、发酵过程中的主要参数及控制,（二）基质对发酵的影响及补料的影响1.碳源的影响和控制2.氮源的影响和控制3.磷酸盐的影响和控制（三）温度对发酵的影响及其控制1.影响发酵温度变化的因素2.温度的控制（四）pH对发酵的影响及其控制1.pH对发酵的影响2.最适发酵pH的确定与pH的控制,1、碳源对发酵的影响及控制不同碳源对毛霉产蛋白酶的影响,2、氮源的种类和浓度对发酵的影响及控制 不同氮源对毛霉产蛋白酶的影响,3、磷酸盐浓度
14、对发酵的影响及控制,最适温度的控制 1、根据菌种及生长阶段来选择 微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。 如黑曲霉生长温度为37， 谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为3032 ， 青霉菌生长温度为30 。,2、根据培养条件选择 温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。 通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。 培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。,3、根据菌生长情况菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。总
15、的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度,发酵过程pH值的调节及控制 1、调整培养基的组分 2、在发酵过程中进行控制 添加CaCO3： 氨水流加法 尿素流加法 3、通过补料调pH 4、当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH,第三节 发酵工艺条件的确定,四、发酵过程中的主要参数及控制,（五）溶氧对发酵的影响及其控制1.溶氧对发酵的影响2.发酵过程的溶氧变化3.溶氧浓度的控制（六）二氧化碳的影响及其控制1.二氧化碳对发酵的影响2.二氧化碳浓度的控制（七）泡沫的影响及其控制,泡沫的性质 1、泡沫产生 通气搅拌；微生物代谢产生 2、泡沫带来的危害 减少发酵的有效容积 液体溢出，增加染菌机会 降低菌体利用率 影响通气搅拌 3.消泡方式：消泡剂消泡、机械消泡,第三节 发酵工艺条件的确定,四、发酵过程中的主要参数及控制,（八）发酵终点的确定1.考虑经济因素2.考虑对产品质量的影响3.特殊因素（九）异常发酵的处理1.种子异常的分析和处理2.异常发酵的处理,休息一下， 马上回来！,
