1、子計畫八 附件-生物實驗技術實驗手冊高雄醫學大學生物醫學暨環境生物學系張永福 編著2目錄實驗一 1.顯微測量2.動植物細胞觀察P.3P.9實驗二 1.細胞成分及生理 P.12實驗三 1.RNA 萃取2.細菌染色體 DNA 萃取P.18P.20實驗四 1.RT-PCR 及瓊膠電泳2.南北方點墨法示範P.22P.25實驗五 1.限制酶切割2.DNA 純化P.28P.29實驗六 1.質體建構2.轉型作用P.31P.32實驗七 1.快速質體 DNA 篩選2.質體 DNA 少量製備P.34P.35實驗八 1.蛋白質誘導表現及純化 P.37實驗九 1.蛋白質電泳分析2.組織蛋白質萃取與濃度測定P.40P.
2、42實驗十 1.酵母菌雙雜交2.西方點墨法示範及蛋白質電泳片乾燥處理P.44P.463實驗一: (1)顯微鏡的使用和顯微測量 實驗目的世界上的生物類類繁多，有些種類微小到肉眼無法辨識，其他物種雖然個體較大，但其內部構造細微而肉眼無法觀察，因此可以利用顯微鏡去認識這些微小的生物及構造。你將從本實驗中瞭解顯微鏡使用的正確方法，並學習如何正確使用顯微鏡來觀察及測量各種細胞大小。實驗原理雙目鏡複式光學顯微鏡（Binocular compound microscope）(圖 1) 的各部名稱及功能:1. 接目鏡(Ocular 或 Eyepiece)：裝在鏡筒的上端。放大倍率通常為為 10、15x，兩個目
3、鏡間的距離可因應各人的雙眼寬度來調整。接目鏡上有焦距調節輪，可因應各人焦距來調整最佳呈像。 2. 鏡筒(Body tube)：介於接目鏡與接物鏡之間，內有透鏡系統。 3. 旋轉盤(Revolving nosepiece)：接於鏡臂末端下方，可 360o旋轉。可接不同倍數的接物鏡，以便更換不同倍數的接物鏡。 4. 接物鏡(Objective)：裝於旋轉盤上，一般有 scanning power objective (4X)、low power objective (10X)、high power objective (40X)、oil immersion objective (100X) 四種倍
4、率，短者為低倍鏡，長者為高倍鏡。 5. 載物台(Stage)：為放置標本玻片的平台，上面有玻片夾和調節鈕可固定及調整玻片位置。中央有一圓孔，可供下方集光器聚集的光線通過。6. 集光器(Condenser)：位於載物台下方，由許多透鏡組合而成，用以集合反光鏡反射來的平行光線，增加標本的明暗對比。 7. 光圈(虹膜)(Iris diaphragm)：連接於集光器下方，可用以調整集光器光圈孔徑大小，而調節標本上之光線強弱。 48. 照明器(Illuminator)：位於鏡座上，內設光源為鎢絲燈，直接提供觀察所需之光源。 9. 鏡臂(Arm)：連接鏡筒及鏡座，並供握取顯微鏡。 10. 調節輪(Adju
5、stment knob)：位於鏡柱上，可調整載物台的升降，具有調節焦距的功能。本顯微鏡具有粗、細兩個調節輪。11. 鏡座(Base)：支持顯微鏡各部。右側有光源調整鈕，可調整照明器內光源亮度；後方接有電源線，有的廠牌尚有光源開關。 圖 1. 複式光學顯微鏡複式光學顯微鏡的使用與保養:A 顯微鏡的取用 1. 提取顯微鏡時，用一手緊握鏡臂，另一手托住鏡座。若長距離移動時，更應將鏡筒朝內，以免目鏡不慎掉落。2. 鏡臂向內輕輕將顯微鏡放置在桌上，距桌緣約 3 公分距離之處。53. 用拭鏡紙輕拭鏡面。4. 調整坐椅至適當高度，使自己可以輕鬆地使用顯微鏡。 B 低倍鏡的使用 1. 先將載物台降至最低點，轉
6、動旋轉盤使低倍鏡位於鏡筒正下方。 2. 打開光源，雙眼同時對準雙目鏡，調整集光器及光圈，使視野中之亮度均勻。 3. 將玻片標本放在載物台上，以玻片夾及調節鈕調整玻片位置。轉動粗調節輪，使鏡筒下降至物鏡離玻片約 0.1 cm（或直到無法再下降）為止。 4. 由接目鏡觀察，同時緩緩轉動粗調節輪，使鏡筒緩緩上升直至物像明晰，再用細調節輪微調，直到影像清晰為止。若視野太亮或太暗，可調整光源調整鈕及光圈，使視野中之亮度適當。 C 高倍鏡的使用 1. 先使用低倍鏡找到欲觀察的目標，並將它移至視野正中央。2. 轉動旋轉盤，將高倍鏡接於鏡筒下。3. 緩慢旋轉細調節輪，使視野中成像更加清晰。4. 若在高倍鏡下不
7、見物像時，應換回低倍鏡，依照之前的步驟重新找回物像並移至視野中心，再使用高倍鏡。 D 油鏡的使用 1. 先使用高倍鏡找到欲觀察的目標，將該部位調整至視野中央。 2. 將 40X 高倍鏡轉開，加一小滴油鏡專用油 (Immersion oil) 於所見物像範圍的蓋玻片上，換用 100X 接物鏡，小心將油鏡浸於油中，重新調整光圈，並緩慢轉動細調節輪，直到影像清晰為止。3. 使用完畢後，先以拭鏡紙單向擦拭油鏡鏡頭，然後以拭鏡紙沾取酒精或二甲苯擦拭，最後再以拭鏡紙擦拭一遍。鏡頭上切勿殘留油鏡油或藥劑，以免損害鏡頭。6E 注意事項1. 攜取顯微鏡，必須一手握緊鏡臂，另一手托住鏡座，切勿用單手提 取，以免造
8、成目鏡及反光鏡滑落破損。放置時應小心輕放勿使強力震動。2. 若須在桌上移動顯微鏡，務必將顯微鏡提起再放至適當位置，嚴忌推動顯微鏡（推動時造成的震動可能會導致顯微鏡內部零件的鬆動）。 3. 使用顯微鏡時應保持鏡體直立，避免傾斜時玻片滑落摔毀，或是觀察潮濕玻片時，水流入鏡體內。4. 接目鏡與鏡筒的承接鈕切勿任意旋開，以免提取時目鏡掉落。5. 更換玻片標本時，先將載物台下降至最低點，換好玻片後再依標準程序重新對焦，勿直接抽換標本，以免造成鏡頭刮傷或玻片損壞。6. 反光鏡、接目鏡、接物鏡等部份，只能用拭鏡紙 (Lens paper) 沿直線方向擦拭，不可旋轉摩擦。7. 使用顯微鏡時，必須坐正而座位高度
9、適宜，可避免眼睛疲勞。8. 用畢顯微鏡後，請將載物台轉至最低處，並將低倍鏡旋轉至對準中央圓孔處。9. 若長期不用時，應以 95%酒精清潔所有鏡頭。顯微測量1. 顯微鏡放大之倍數相當於接目鏡及接物鏡放大倍數之乘積，若接目鏡 10X，接物鏡 10X，則物體放大倍數應為 100X。2. 若想得到更大且清晰的物像時，可增加物鏡的放大倍數。3. 若想知道觀察物體的實際大小時，可先在目鏡之兩片鏡片之間加放一個目鏡測微器（圖 3），目鏡測微器，是一有刻度刻劃於表面的玻璃圓盤，刻度間距離會因使用的物鏡倍數大小而有所不同。4. 在載物台上放置一個物鏡測微器（圖 4）其為一長方形的特殊載玻片，上面刻有每 0.01
10、mm(10um)分隔刻度。75. 在使用目鏡測微器之前必需與載物台測微器校準。移動載物台測微器使兩測微器之一端刻度重疊為一直線，再檢視另一端刻度的重疊處，則目鏡每一小格間之大小即可計算：如果 30 個目鏡區域刻度重疊於載物台測微器的 7 個區域 （7X0.01mm=0.07），所以目鏡測微器的一個區域距離=0.07/30=0.0023mm 或 2.3m。 圖 3：目鏡測微器 圖 4：載物台測微器 實驗材料 載玻片 動植物細胞的玻片標本 目鏡測微器 載物台測微器 顯微鏡實驗步驟熟悉顯微鏡之各部份構造及使用方法，再依下列步驟，繼續觀察。1.英文字母“”方位變化的觀察：(1)將字母“”放在載玻片上，
11、以低倍觀察之。比較其位置與平常所見之不同。(2)轉換高倍鏡觀察，並移動載玻片看看視野下之變化。82.觀察三條不同顏色的線相交於一點的情形：在載玻片上放置紅、白、黑三種不同色的線，共同相交於一點，於低倍鏡下轉動調節輪觀察。找出三者各居上中下何種位置。3.顯微測量：(1)將刻有精確微細刻度的載物台測微器置於載物台上，量出目鏡測微器每一刻度在 40X，100X，400X 之下，相當於多少 m？(2)將載物台之測微器移去，分別改放頭髮、口腔黏膜細胞、蛙血 球細胞等玻片標本，並利用目鏡測微器量出它們的大小。問題討論1.物體在顯微鏡下成像的方向和實物有何不同？2.從低倍鏡轉到高倍鏡時，視野變化如何？3.頭
12、髮或口腔黏膜細胞之直徑各為若干 m？Back9實驗一: (2)動植物細胞觀察實驗目的細胞為生物體構造與功能的基本單位，從最簡單的細菌到構造最複雜的動植物體，都是由細胞構成。動植物的細胞基本構造可分為細胞膜(Cell membrane)、細胞質(Cytoplasm)、胞器(Organelles)、細胞核(Nucleus)等四大部分。細胞膜為分隔細胞質與外界的一層薄膜，細胞質是指存在細胞核與細胞膜之間的膠狀物質，胞器是存在細胞質中的微小單位，具特化的構造可執行特殊的生理功能，細胞核為細胞內最大的胞器是細胞內一切活動的控制中心。在此單元中，你將藉由顯微鏡去觀察動植物細胞的構造，並且觀察兩者之間有何不
13、同。實驗材料植物細胞 洋葱 馬鈴薯的塊莖 秋海棠的葉柄 鴨跖草的莖 印度橡膠樹或榕樹的葉片 紅辣椒動物細胞 青蛙 豬肝 魚鱗 肥肉1% 碘液 0.05% 甲基藍液 瑞特氏染料(Wright stain) 林格式液(Ringers solution)實驗步驟植物細胞1.表皮細胞(Epidermal cell)取洋葱一片鱗葉，利用鑷子將段成兩半的毛邊上，撕下小塊表皮組織，然後將它放在載玻片上並且滴上一滴水，使組織展開，最後覆上蓋玻片置顯微鏡下觀察。觀察後，試以碘液 (Iodine solution)10或甲基藍 (Methylene blue) 一滴加於蓋玻片之一側，然後以濾紙自蓋玻片之另一側吸之
14、，使洋蔥表皮細胞獲得均勻染色。2.澱粉粒(Starch grain)以刀片刮取馬鈴薯截面，塗抹於載玻片上，加水覆上蓋玻片，置顯微鏡下觀察。可見各細胞中有許多澱粉粒（呈圓形或卵圓形）。改用高倍鏡觀察，可發現澱粉粒在較小的一端有臍 (Hilum)；以臍為中心，其周圍有輪紋。加碘液一滴後，觀察有何改變。3.結晶及其他物質(Crystals and Others)將秋海棠葉柄橫切一薄片，置顯微鏡下觀察。細胞中可看到八面體、柱狀結晶，即為單晶，其成份為草酸鈣。另有一種簇狀的草酸鈣結晶，稱為簇晶。在鴨趾草莖的皮層細胞中則常見一種針狀的草酸鈣結晶，為針狀結晶。鐘乳體為葡萄穗狀的碳酸鈣結晶，常見於印度橡膠樹與
15、榕樹葉的上表皮細胞內。4.雜色體(Chromoplast)切取紅辣椒一薄片，於顯微鏡下觀察。在皮層或是果皮的細胞中有黃紅色小顆粒即為雜色體。動物細胞1.血球(Blood cell)將蛙用針刺法破壞它的中樞神經，然後剪開心臟，用吸管吸取一小滴蛙的血液，放在載玻片的一側，再用另一張載玻片作薄片 (Thin film) 塗抹，等自然乾後，加上瑞特氏染料，染 1-2 分鐘後，用水輕輕洗去染料，然後將載玻片置濾紙內以吸去水滴，待乾後置顯微鏡下觀察蛙的紅血球與白血球，並注意細胞核之有無及形狀。2.蛙的精子細胞(The sperm of frog)自雄蛙腹腔內取出睪丸，放入盛有林格氏液燒杯內，用解剖刀將蛙的
16、睪丸切碎，二分鐘後，自燒杯內吸取一小滴液體，滴在載玻片的中央，覆上蓋玻片，然後置顯微鏡下觀察細胞的形態。3.肝細胞(Liver cell)11將一小片豬肝置於滴有生理鹽水的載玻片上；塗抹後，加一滴甲基藍液，覆以蓋玻片，分別在低、高倍鏡下觀察。注意其細胞核的數目。4.色素細胞(Chromatophore)取魚鱗片 (勿除去鱗片表面之皮膚) 一枚，置載玻片上，加一滴水，覆上蓋玻片，置於低倍鏡下，觀察細胞內色素顏色。5.脂肪細胞(Fat cell)取肥肉少許在載玻片上塗成薄層，滴上蘇丹三號，置於低倍鏡與高倍鏡下觀察，細胞內染成紅色的部分即為油滴。問題討論1.任何細胞均具一個細胞核嗎？2.你所看到的精
17、細胞形狀如何？Back12實驗二: 細胞成分及生理實驗目的細胞成分主要是醣類、脂肪、蛋白質、核酸及水。本實驗目的在檢測細胞中的醣類、脂肪、蛋白質等物質，並觀察其利用擴散 (Diffusion)、滲透 (Osmosis) 與主動運輸等方式進出於細胞內外。實驗原理醣類(1)檢測單醣或雙醣利用本氏液 (Benedicts reagent) 測試單醣或雙醣。本氏液和含有葡萄醣的溶液混合後加熱，會產生氧化亞銅的紅色沉澱物。氧化亞銅沉澱的量與葡萄醣的量成正比。故反應後的顏色因葡萄醣量的多寡而呈現黃、綠、橘、或紅色。若溶液中無葡萄醣，反應之後不會出現有色沉澱。(2)檢測測澱粉(starch)。利用碘液 (i
18、odine reagent)，反應後若出現深藍色即代表有澱粉的存在。(3)檢測醣類分解。在多醣中的單醣跟單醣之間的鍵結斷裂的現象稱為水解 (Hydrolysis)。本實驗利用鹽酸 (HCl) 與澱粉，檢測澱粉的水解。蛋白質利用雙脲試劑 (Biuret solution) 來檢驗蛋白質。蛋白質是由多胜鍵所組成的，雙脲試劑中的銅離子會與胜肽鍵反應，產生紫紅色至藍色的反應。脂質13利用蘇丹三號 (Sudan III) 來檢驗脂質。蘇丹三號會與脂肪酸尾部的 hydrocarbongroup 結合，而產生橘色。滲透作用這是擴散作用之一，指某種濃度低的溶液中的溶劑，經過半透膜而進入濃度高的溶液中的現象。本
19、實驗是利用蛋膜作為半透膜，觀察滲透的情形。主動運輸中性紅 (Neutral red) 是一種染劑，在酸性的溶液中是紅色；在鹼性的溶液中是黃色。Na 2CO3使溶液成鹼性，但活酵母菌體內偏酸性。本次實驗所利用的細胞是酵母菌，觀察酵母菌主動運輸的情形。實驗材料 馬鈴薯汁 1M 葡萄醣液 本氏液(Benedicts reagent) 碘液(iodine reagent) 鹽酸 雙脲試劑(Biuret solution) 蘇丹三號(Sudan III) 蛋膜 中性紅(Neutral red) 10% KOH3% CuSO4 人造奶油(margarine)30 蔗糖溶液、80蔗糖溶液 酵母菌懸浮液、煮沸
20、的酵母菌懸浮液實驗步驟醣類(1)A.取 3 根試管，分別加入 1ml H2O、馬鈴薯汁和 1M 葡萄醣液。B.每管再加入 3ml 本氏液均勻混合。C.將混合好的溶液水浴加熱 5 分鐘。14D.加熱完畢後，靜置觀察溶液的顏色是否改變並紀錄。(2)A.取 3 根試管，分別加入 2ml H2O、馬鈴薯汁和 1%澱粉液。B.每管再滴入 5 滴碘液均勻混合。C.觀察這 3 根試管的溶液顏色變化並紀錄。(3)A.1、2 號試管加入：1ml 1% 澱粉 + 1ml 2N HCl。3、4 號試管加入：1ml 馬鈴薯汁 + 1ml 2N HCl。5、6 號試管同 1 號試管，但加熱 10 分鐘。7、8 號試管同
21、 3 號試管，但加熱 10 分鐘。B.1、3、5、7 號試管加入 3ml 本氏液加熱 5 分鐘。2、4、6、8 號試管加入 5 滴碘液。C.觀察並紀錄這 8 根試管的溶液顏色變化並紀錄。蛋白質A.將雞蛋底端敲出一個小洞，取出蛋白(含 egg albumin)。B.取 3 根試管，分別加入 0.5ml 蛋白、水、馬鈴薯汁。C.每管再加入 10 滴 10% KOH，5 滴 3% CuSO4溶液，輕微的混合均勻。2 分鐘後，觀察試管內溶液的顏色變化並紀錄。脂質A.分別用不同的滴管，取 4 種不同的溶液，各滴一小滴在一張濾紙上，並清楚標示 4 點名稱，分別為W(water)、G (glucose so
22、lution)、P(potato juice)、M(margarine)。B. 將濾紙晾乾。C. 晾乾後將濾紙放入培養皿中，加入蘇丹三號約 10ml，3 分鐘後將濾紙取出。D. 再將濾紙浸泡在清水，約 1 分鐘。E. 取出濾紙，觀察 4 個標示點的顏色及強度並紀錄。(紀錄時以0無顏色；1淡橘色；2橘色)滲透作用15A.在雞蛋底端敲一個小洞，將蛋白及蛋黃倒出。B.將蛋殼泡入 10%HCL 中約 5 分鐘。C.小心地將蛋膜與蛋殼分開。D.取 4 個蛋膜，每袋均加入 10ml 30的蔗糖溶液，加入後用棉線束緊袋口。E.分別將這 3 袋玻璃紙（透析袋）秤重並紀錄。F.將 3 袋透析袋分別放置在裝有水、
23、30蔗糖溶液、及 80蔗糖溶液的燒杯中。G.20 分鐘後，拿出透析袋，輕微擦拭後秤重並紀錄。比較數值的差異並討論原因。主動運輸A.取兩個微量離心管分別標示 A、B。B.離心管 A 中放入 1ml 煮沸的酵母菌懸浮液，再加入 4 滴 0.02中性紅，混合均勻後靜置 5 分鐘。C.離心管 B 中放入 1ml 的酵母菌懸浮液，再加入 4 滴 0.02中性紅，混合均勻後靜置 5 分鐘。D.將離心管 A、B 以 12000rpm 離心 1 分鐘，觀察酵母菌跟溶液兩者顏色的不同，並解釋其原因。實驗結果醣類(1)H2O 馬鈴薯汁 Glucose solution加入Benedicts reagent 前加入
24、Benedicts reagent 加熱後16(2)H2O 馬鈴薯汁 starch solution加入Iodine reagent 前加入Iodine reagent 後(3)1ml 2N HCl +starch 馬鈴薯汁 starch 馬鈴薯汁加熱時間 0 0 10 10試管編號 1 2 3 4 5 6 7 8Benedicts reagent Iodine reagent 蛋白質蛋白 水 馬鈴薯汁顏色脂質W G P M顏色滲透作用溶液 放入水杯前重量(g) 放入水杯後重量(g)水30蔗糖80蔗糖17主動運輸離心後顏色離心前顏色(加入中性紅後) 溶液 酵母菌離心管 A離心管 B問題討論1.
25、物質進出細胞膜的方式有哪些?2.何為滲透?與細胞生理有何關係?Back18實驗三: (1)RNA 萃取 實驗目的一個哺乳類細胞大約含 10-5 g 的 RNA，其中 80-85% 為 rRNA，其餘的 15-20% 主要是 tRNA，mRNA 只約佔全部 RNA 的 1-5%。 Total RNA的萃取及純化是可應用在一系列 RNA 分析實驗，如北方點墨法(Northern blotting)，反轉錄聚合脢連鎖反應(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)，cDNA 合成，活體外轉譯(in vitro translatio
26、n)。 本實驗將從實驗室培養細胞中抽取 total RNA，作為後續實驗如反轉錄聚合脢連鎖反應之材料。 你將從本實驗學習如何自細胞中萃取並純化 RNA。 實驗原理本 RNA 抽取原理，是利用高濃度之 guanidine salts 及 urea 等變性試劑，使細胞溶解，並立即破壞胞器所釋放之 RNase 的活性。所得之細胞溶解液再以酸性之 phenol/chloroform 萃取，會分成兩層，DNA 及蛋白質會在有機層或介面層，而只有 RNA 在水層，如此可有效分離出 RNA。再以isopropanol 將 total RNA 沉澱，且回溶於 RNase-free 的水中即可。最後，測波長 2
27、60 nm/280 nm 之吸光值，以計算所抽出 RNA 之濃度與純度。 純RNA 的 A260/A280比值約為 1.8-2.0。 RNA 濃度計算方式為 OD260=1 時，RNA濃度約為 40 g/ml。RNA 的萃取常因 RNase 的污染而失敗。 RNase 是很穩定的酵素，不易破壞其活性，因此為了避免 RNase 的污染，RNA 萃取時所用之水及溶液應該以 diethylpyrocarbonate (DEPC)處理。因為 DEPC 會與 RNase 形成共價鍵結，而破壞其活性。 而所使用之玻璃器皿要以高溫烘烤處理過，並使用未拆封之可棄式塑膠器材。 手亦是 RNase 污染的主要來源
28、，故操作時要戴上手套。實驗材料 RNA 分離試劑：本實驗使用的試劑為 Invitrogen 公司之 TRIZOL RNA分離試劑。19 Phenol/Chloroform(P/C) Isopropanol 75% ethanol DEPC 處理過的水(DEPC 可能會致癌，操作時須戴手套及在通風櫥內)。實驗步驟A. 取 5x106個培養細胞置於 1.5ml 微量離心管內，加入 0.25ml DEPC水打散細胞。B. 立刻加入 0.75ml TRIZOL，將細胞溶解液置於室溫下 5 分鐘，以使RNA 和蛋白質完全解離。C. 加入 0.25ml phenol/chloroform，劇烈搖盪 15
29、秒，置於室溫下 5分鐘。D. 4oC 12,000 g 離心 15 分鐘。E. 離心後，溶液會分層，RNA 會在上面無色的水層。小心吸取上層(約取其 4/5 體積)至另一微量離心管。F. 加入等體積(約 0.5ml)的 Isopropanol，混和均勻後置於室溫下 10分鐘，使 RNA 沉澱。G. 4oC 12,000 g 離心 10 分鐘。H. 小心倒掉上清液，留下底部少量 RNA 白色膠狀沈澱。I. 加入 1ml 75% 酒精清洗。4 oC 12,000 g 離心 3 分鐘。倒掉上清液，風乾或真空抽乾殘留的酒精。J. 取適量之 DEPC 處理過的水將 RNA 沈澱回溶。 若 RNA 不易回
30、溶時，可將其置於 60 oC 5 分鐘助其溶解。K. 取少量 RNA 溶液適當稀釋，以分光光度計測波長 260 nm 與 280 nm之吸光值並計算 RNA 之濃度與純度。結果討論1.計算出你所抽得之 RNA 濃度及總量，並評估所抽得之總量是否適當。若所得量太多或太少，討論可能之原因。 2.計算出 A260/A280的比值，並判斷所抽得之 RNA 的純度。 若純度過低，討論可能之原因。Back20實驗三: (2)細菌染色體 DNA 萃取實驗目的Chromosome DNA 是 Southern blot 與 footprinting 等方法之前置步驟。本實驗將學習如何從大腸桿菌中萃取細菌 ch
31、romosome DNA。由此方法可以讓學生體驗到抽取大量 DNA 的樂趣，並對大量 DNA 的巨觀形式有所認識。實驗原理將大腸桿菌回溶於 solution中 (若為革蘭式陽性的細菌則需加入lysozyme 以溶解細胞壁)，利用清潔劑如 sodium dodecyl sulfate (SDS)打破細胞膜，並使蛋白質變性 (也可加入 proteinase K 以分解蛋白質)。 Phenol/chloroform 則用以將蛋白質與 DNA 分層，DNA 會溶於上層的水層，最後再以 isoproponal 將 chromosome DNA 沉澱濃縮。實驗材料 Solution：25mM Tris(p
32、H8.0), 10 mM EDTA 10% SDS Phenol/chloroform (1:1)實驗步驟A.將隔夜培養之大腸桿菌倒入 1.5ml 微量離心管。12000rpm 離心 1 分鐘，倒掉上清並儘可能吸乾淨。B.加入 200l solution讓菌完全回溶。C.加入 15l 10% SDS，蓋上微量離心管蓋搖晃混合 30 秒。D.加入 0.2ml phenol/chloroform，用力搖晃混合 30 秒。12000rpm 離心 3 分鐘。E.小心吸取含有 chromosome DNA 的上層溶液至另一乾淨的微量離心管(務必緩慢小心抽取，盡量不要吸到介面層的白色蛋白質)。F.重複步驟
33、 D、E。G.加入 100l isoproponal 於 DNA 溶液中，蓋上微量離心管蓋緩和搖晃混合，則可見絲狀 DNA 產生，若仍不見絲狀 DNA 產生，再加入 100l isoproponal 混合即可。21H.以牙籤挑取絲狀 DNA 至另一裝有 100l 1X TE 的微量離心管中，並讓chromosome DNA 完全回溶。 問題討論1. 計算出你所抽得之 DNA 濃度及總量，並評估所抽得之總量是否適當。 若所得量太多或太少，討論可能之原因。 2. 計算出 A260/A280的比值，並判斷所抽得之 DNA 的純度。若純度過低，討論可能之原因。 Back22實驗四:(1)Reverse
34、 Transcription-Polymerase Chain Reaction-RT-PCR 及瓊膠電泳實驗目的聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, 簡稱 PCR)技術的發明，是分子遺傳學上的一大革命。它可以非常省時地從少量的 DNA 複製出特定的 DNA 片段。目前已廣泛地應用在許多領域上。本實驗將把 total RNA 以反轉錄酶(reverse transcriptase)作成 cDNA。此方法又稱為反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcription- polymerase chain reaction, 簡稱 RT-PCR)。瓊膠電泳是分
35、子生物實驗中相當基礎的材料，可依分子量大小來分開 DNA(或 RNA)。你將從本實驗中熟悉 PCR 實驗操作技巧及瓊膠電泳的製備。實驗原理反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)可用來分析少量特定的 mRNA。其是以mRNA 為模版，以 oligo(dT)或 random hexamer 為引子，用反轉錄酶複製出與 mRNA 互補的第一股 cDNA (first-strand cDNA)，再以此 cDNA 為模版，經由 PCR 放大作用後，再利用瓊膠電泳去確認產物片段大小是否正確。實驗材料 DEPC 處理過的水 下列試劑來自 Clontech 公司所售之 Advantage RT-for-PCR
36、Kit：* 5X reaction buffer：250mM Tris-HCl (pH 8.3), 375mM KCl,15mM MgCl2* Oligo(dT)18：20M* 四種 dNTP 混合液：每種 10mM* Recombinant RNase inhibitor：40 units/l* M-MLV reverse transcriptase：200 units/l 10XTaq reaction buffer：500mM KCl, 100mM Tris-HCl (pH 9.0), 1% Triton X-100, 15mM MgCl2 Taq DNA polymerase：5 un
37、its/l Primers：forward 跟 reverse 濃度為 10M 瓊膠粉末23 TAE buffer EtBr (10mg/ml)實驗步驟(1) Reverse transcriptionA.在一個 0.5ml 的微量離心管內加入 1g 的 total RNA，再以 DEPC 處理過的水補到總體積為 12.5l。 B.加入 1l Oligo(dT)18，70作用 2 分鐘，然後快速置於冰上。 C.加入以下物質混合： 5X reaction buffer 4l四種 dNTP 混合液(每種 10mM) 1lRNase inhibitor 0.5lM-MLV reverse trans
38、criptase (200U/l) 1l- 總體積為 20l D.42作用 1 小時。E.最後 94作用 5 分鐘，以停止 cDNA 的合成並破壞 DNase 的活性。快速離心後加入 DEPC 水 80l，cDNA 保存於 70。(2) PCRA.在一個 0.2ml 的薄壁微量離心管加入 10lcDNA。B.加入以下物質混合： 10X Taq reaction buffer 2.5l四種 dNTP 混合液(每種 10 mM) 1lPrimers(forward 跟 reverse) 各 0.5lTaq DNA polymerase 0.5lH2O 10l-總體積為 25l C.反應條件:95
39、5 分鐘2495 30 秒55 30 秒 40 個循環72 30 秒 D.跑 1%瓊膠電泳觀察 PCR 產物。E.其餘產物保存在-20。(3) 瓊膠電泳製備A.秤 1.5g 的瓊膠，加入 15ml TAE buffer，置於微波爐煮沸，小心勿使過分沸騰而濺出。B.稍微冷卻後加入 0.75l EtBr，混合均勻後倒入膠片製作盤，去除氣泡後插入齒梳。C.靜至冷卻後，去除齒梳即可使用。問題討論1.你是否得到單一條 PCR 產物？ 是否和預期之大小接近？ 對照組的結果為何？ 請解釋你的結果。Back實驗四:(2)南北方點墨法25實驗目的南、北方點墨法是是利用已標定的 cDNA 為探針去偵測一特定 DN
40、A 或RNA 的表現量及其大小，某些實驗也利用偵測特定 DNA 或 RNA 序列的強弱做特定基因數量的定量。你將從本實驗中學習如何進行南北方點墨法。實驗原理本實驗先以變性瓊膠電泳將 RNA (或 DNA) 依分子量大小分開。電泳後利用毛細原理將 RNA (或 DNA) 轉漬到 nitrocellulose 濾膜上，經過 UV照射將 RNA (或 DNA)固著在濾膜上。轉漬後的濾膜在與放射性標定後之特定 cDNA 探針進行雜交反應。然後將未雜合到的探針清洗掉，利用 X 光片顯影觀察 RNA (或 DNA) bands。實驗材料南方點墨法 Depurination solution：250mM H
41、Cl Denaturation solution：1.5M NaCl, 0.5M NaOH Neutralization solution：1.5M NaCl, 0.5M Tris-HCl (pH 7.5) 20x SSC：0.3M Na 3citrate2H20, 3M NaCl Primary Wash Buffer：6M Urea, 0.4% SDS, 0.5X SSC prehybridization solution：0.5M NaCl, 5%ECL blocking mix 北方點墨法 10X MOPS buffer：0.2M 3-Morpholino-propane-sulpho
42、nic acid, 0.05M Na acetate (pH7.0), 0.01M Na2EDTA formaldehyde(37%) formamide 20X SSC：0.3M Na 3citrate2H20, 3M NaCl prehybridization solution：20X SSPE 6.25ml100X Denhardts solution 1.25ml10% SDS 1.25ml5mg/ml salmon sperm DNA 0.25ml26(1000C 煮 5 分鐘) -總體積 25ml 20X SSPE：3.6M NaCl, 0.2M sodium phosphate,
43、 0.02M EDTA (pH7.7) 100X Denhardts solution：2% BSA, 2%Ficoll, 2% PVP (polyvinylpyrollidone)實驗步驟南方點墨法A.取 10l 的 genomic DNA 作限制酶切割，作用一整晚。B.以慢速跑 polyacrylamide gel。C.跑完後將 gel 移至塑膠盤內，倒入 depurination solution 並輕微搖晃，直到 loading dye 由藍轉黃(約十分鐘)。D.用無菌水將 gel 洗乾淨。E.將 gel 浸入 denaturation solution 並輕微搖晃，直至 loadin
44、g dye變回藍色，靜止 25 分鐘。F.用無菌水將 gel 洗乾淨。將 gel 浸入 neutralization solution，並輕微搖晃 30 分鐘。G.準備一玻璃板至於容器中，並將 20X SSC 倒入容器中。另將 3MM 濾紙以 20X SSC 浸濕跨在玻璃板上，使兩端浸入溶液中，小心清除濾紙與玻璃板之間的氣泡。H.將膠體置於步驟 G.的 3MM 濾紙上，小心清除濾紙與膠體之間的氣泡，並以保鮮膜圍住膠體四周。I.將 nitrocellulose 濾膜於水中浸濕，再浸泡於 20X SSC 中 5-10 分鐘。將濾膜置於膠體上，若有氣泡夾在其間，以玻璃棒滾動擠出。J.將三張 3MM
45、濾紙以 20X SSC 浸濕，將其置於 nitrocellulose 濾膜上。其上再放置一疊約 5 公分高的吸水紙，然後放上一片玻璃板，再壓上約 1 公斤重物。K.轉漬時間 24 小時，其間若吸水紙濕掉，則更換新紙。L.轉漬後用鉛筆作記號，再以鈍頭鑷子夾起濾膜，以 UV 照射(1000J of energy)將 DNA 固著在濾膜上。M.將濾膜放入雜交用玻璃管中，加入 25ml prehybridization solution，在 420C 作用 1 小時。N.取 25l 標定好的 DNA 探針(10 ng/l)加入 prehybridization solution，在 420C 作用 1
46、2 小時。27O.將濾膜取出並用 primary wash buffer 在 420C 清洗 20 分鐘。接著重複此動作 2 次各 10 分鐘。P.在室溫下用 20X SSC 清洗濾膜 5 分鐘 2 次。Q.將濾膜弄乾後加入 ECL detection solution，壓上 X 光片。30 分鐘後將 X 光片顯影。北方點墨法A.agarose/formaldehyde 膠體製備:1.2 克 agarose 加入 87ml 的水，煮沸後冷卻至 600C，加入 10ml 10X MOPS buffer 及 3ml formaldehydeB.準備 RNA 樣品，65 0C 培養 5 分鐘後，置於
47、冰上。Total RNA 10-30g, 加水至 4.5lFormamide 10l10X MOPS buffer 2l formaldehyde 3.5l-總體積 20lC.以慢速跑 agarose/formaldehyde。D.用無菌水將 gel 洗乾淨後(去除 formaldehyde)，將 gel 浸泡入 10X SSC。E.準備 transfer(同南方點墨 G-K) 。F.transfer 後用鉛筆作記號，再以鈍頭鑷子夾起濾膜，以 UV 照射(1000J of energy)將 RNA 固著在濾膜上。G.將濾膜放入雜交用玻璃管中，加入 10ml prehybridization solution，將玻璃管置於 650C 雜交烘箱旋轉至少 1 小時。H.從標定好的 DNA 探針，取約 500000cpm/ml hybridization solution的量，煮沸 5 分鐘使其變性，再將其加到玻璃管中的prehybridization solution。於 650C 雜交烘箱旋轉至少 12 小時。I.將濾膜取出放入 2X SSC, 0.1%SDS 中，清洗 15 分鐘後，重複步驟一次。再將溶液換成 0.2X SSC, 0.1%SDS，於 650C 清洗 15
