1、77第二部分 生物药物制备实验第一节 氨基酸及其衍生物类药物实验二十二 固定化细胞法生产 L-天冬氨酸和L-丙氨酸注：此实验来自项目固定化细胞生产天冬氨酸，丙氨酸（国家攻关课题）的成果【实验目的】1学习 L-天冬氨酸和L- 丙氨酸的制备方法。2了解酶法生产这两种氨基酸的原理和细胞固定化的原理及优点。3掌握固定化细胞的技术。【实验原理】固定化细胞（Immobilized cell）技术，就是利用物理或化学手 段将游离的微生物细胞、动物细胞，定位于限定的空间领域，并使其保持活性且能反复利用的一项技术。固定化细胞的制备方法主要有以下几种：吸附法、共价交联法、絮凝法、包埋法；交联可以是细胞通过离子相互
2、作用或共价连接到一个表面，也可以是细胞与细胞之间用过天然或化学试剂诱导产生连接；吸附法是细胞通过静电相互作用（范德华力、离子键和氢键）吸附到支持物表面，此法简单价廉，但经常发现有细胞泄露；絮凝法是利用某些微生物细胞具有絮凝形成颗粒的能力而对细胞进行固定化的方法；包埋法是近年来发展迅速的一种新兴固定化细胞技术，它是将细胞捕获在一个保护性基质结构或胶囊中，减少了细胞泄露，因此具有操作简单，对细胞活性影响较小，效率高等特点，是目前细胞固定化研究和应用最广泛的方法之一。L-天冬氨酸（L-Aspar tic acid）是天然存在的重要氨基酸，在食品、医药、日用化工、纺织等行业有着广泛的应用。L-天门冬氨
3、酸钾、镁盐在细胞代谢中起着重要作用，是钾、镁的有效补充剂，适用于各种心脏病。在食品方面，L-天冬氨酸作为食品添加剂可改善食品风味，L-天冬氨酸与D- 丙氨酸可合成 L-天冬酰-D-丙氨酸甲酯（其甜度为蔗糖的 150倍） ，是一种新型甜味剂。在化工方面，L-天冬氨酸还可以作为制造合成树脂的原料，其衍生物还可以合成量型表面活性剂以及制造化妆品。工业上生产L-天冬氨酸以往采用化学合成法和微生物发酵法。随着固定化酶和固定化细胞技术的不断完善和发展，人们开始改用含有天冬氨酸酶的固定化细胞直接将延胡索酸铵转化成L-天冬氨酸来实现工业化生产。L-丙氨酸（L-Alani ne）是一种脂肪族的非极性氨基酸，是丙
4、酮酸代 谢体系的非必需氨基酸，在血液中含量最多，与糖代谢密切相关，使转氨反应中重要的氨基供体，具有重要的生理功能；同时又是一种重要的氨基酸类药物，为多种复方氨基酸输液的重要组成成分，并可作多种医药中间体。本实验用卡拉胶包埋天冬氨酸酶产生菌和 L-天冬氨酸 -脱羧酶产生菌制成固定化细胞，利用生物反应器，可连续生产L-天冬氨酸和L-丙氨酸。78【实验材料】1器材（1）水浴振摇培养箱 1 台（2）磁力搅拌器 1 台（3）HPLC 1 台（4）三角烧瓶 250 ml 5 个（5）抽滤瓶 1 个（6）离心机 1 台（7）布式漏斗 2 只（8）恒温水浴锅 1 台（9）酶柱 1 根（10）烧杯 1 000m
5、l 1 个（11）烧杯 500ml 2 个（12）烧杯 250ml 2 个（13）超级恒温水浴 1 台（14）恒流泵 1 台（15）高压灭菌锅 1 个（16）锋利小刀 1 把（17）试管 12 支2试剂（1）菌种（2）玉米浆（3）延胡索酸铵（4）PLP （5- 磷酸吡哆醛）（5）牛肉浸膏（6）KH2PO 4（7）MgSO47H 2O（8）浓氨水（9）氯化钾（10）氯化镁（11）浓硫酸（12）95乙醇（13）-天冬氨酸标准品（14）延胡索酸标准品（15）-丙氨酸标准品【实验方法】1细菌的培养及菌体制备79接种 1ml对数生长期天冬氨酸酶产生菌种至250ml三角烧瓶中，内含 50ml 已经灭菌的培
6、养基(1%延胡索酸铵 ， 2%玉米浆，2% 牛肉浸膏，0.5%KH2PO4，0.05%MgSO4 7H2O，pH7.0) ，37振摇培养 24h，培养液离心（3 000r/min，20min）倾出上清液，再用生理盐水洗涤 1 次，离心收集菌体，置冰箱备用。接种 1ml对数生长期L-天冬氨酸 -脱羧酶产生菌种至 250ml 三角烧瓶中，内含 50ml已灭菌的培养基（1.5%L-谷氨酸钠，0.5% 富马酸铵，1% 富马酸钠，3.0%玉米浆，2% 蛋白胨，0.05% KH2PO4，0.01%MgSO47H 2O，pH7.0） ，37振摇培养 24h，培养液离心（3 000r/min，20min）倾出
7、上清液，再用生理盐水洗涤一次，离心收集菌体，置冰箱备用。2固定化细胞的制备（1）天冬氨酸酶产生菌的固定化将 4g 湿菌体悬浮于 4ml 生理盐水中，置 45恒温水浴保 温，0.8g 卡拉胶于 17ml生理盐水中，加热至 70-80使之溶解，再降温至 45，两者于 45混匀，混合物置 4冰箱放置 30min，将凝胶在 100ml 0.3mol/L KCl 溶液中浸泡 4h，然后切成 3mm3mm3mm 的立方体颗粒。经生理盐水洗涤后，将固定化细胞置于 1mol/L 延胡索酸铵中，于 37活化24h，即可使用。（2）L-天冬氨酸 - 脱羧酶产生菌的固定化将 5g 湿菌体悬浮于 5ml 生理盐水中，
8、置 45恒温水浴保 温，0.8g 卡拉胶于 17ml生理盐水中，加热至 70-80使之溶解，降温至 45，两者于 45混匀，混合物置 4冰箱放置 30min，将凝胶在 100ml 0.3mol/L KCl 溶液中浸泡 4h，然后切成 3mm3mm3mm 的立方体颗粒。用 0.1mol/L 甘氨酸充分洗涤，在 1mol/L 天冬氨酸铵（含 0.1mol/LPLP）底物中，于 37活化 24h，即可使用。3酶活力测定（1）湿菌体天冬氨酸酶活力的测定取 0.5g 湿细胞悬浮于 2ml 蒸馏水中，加入 30ml 1.0mol/L 延胡索酸铵，内含 1mmol/L MgCl2，1%Triton pH 9
9、.0，37 搅拌反应 30min，煮沸终止反应，1200rpm,5min 离心后，稀释反应上清液于 240nm 处测 定吸收值，按延胡索酸残余量计算酶活力，一个酶活力单位定义为在测定条件下，每小时每克细胞转化生成 1mol 天冬氨酸 所需的酶量。（2）固定化细胞的天冬氨酸酶活力的测定取相当于 0.5g 天然细胞的固定化细胞， 置于 30ml 1.0mol/L 延胡索酸铵，内含1mmol/L MgCl2，37搅拌反应 30min，迅速过滤除去固定化细胞，分离反应液，经稀释后于240nm处测定延胡索酸残余量 ，并计算每克固定化细胞 的酶表现活力。总活力用每克固定化细胞，单位小时内所产生的 L-天冬
10、氨酸的微摩尔数表 示（mol/hgcell ） 。（3）延胡索酸（即富马酸）标准曲线的绘制延胡索酸在240nm处有特征峰 吸收，在一定范围内与延胡索酸含量成线性关系，且反应系统中无干扰。标准曲线的绘制试管号 1 2 3 4 5 6延胡索酸标准液（50g/ml）0 1 2 3 4 5蒸馏水 5 4 3 2 1 0OD240nm80根据测定的吸收值，作出标准曲线或回归方程。（4）湿菌体 L-天冬氨酸 -脱羧酶产生菌活力的测定取 1g 湿菌体悬浮于 10ml 生理盐水中，取 0.5ml 悬浮液，加入含 0.1mmol/L PLP 的1mol/L 天冬氨酸铵的底物 2ml（pH6.0 ）于 37反应
11、30min，煮沸终止反应。生成的 L-丙氨酸用纸层析法定量测定。展开剂选用正丁醇:醋酸:水=4:1:1，显色剂用 0.5%茚三酮溶液，烘干后，将显色斑点剪下用 0.1%CuSO45H2O:75%乙醇=2:38 洗脱后，于 520nm 处比色，再从标准曲线上读得 L-丙氨酸的含量。L- 天冬氨酸 - 脱羧酶产生菌活力的的定义为：每克细胞每 小时生成 1mol /L-丙氨酸为 1个酶活力单位（U ） 。（5）固定化细胞的 L-天冬氨酸 -脱羧酶活力的测定取 6g 固定化细胞（相当于 1g的湿细胞）加入 20ml 生理盐水 ，于 37保温，加入含0.1mmol/L PLP 的 1mol/L L-天冬
12、氨酸铵4ml，pH6.0，于 37反应 30min，迅速过滤除去固定化细胞，分离反应液，生成的 L-丙氨酸用纸层析法定量测定。（6）L-丙氨酸标准曲线的绘制按（5）法用纸层析法定量测定L-丙氨酸的含量与显色斑点脱色后在520nm处比色的关系。标准曲线的绘制试管号 1 2 3 4 5 6L-丙氨酸标准液（40g/ml）0 1 2 3 4 5蒸馏水 5 4 3 2 1 0OD520nm根据测定的吸收值，作出标准曲线或回归方程。4L-丙氨酸的制备分别将 6g天冬氨酸酶和 L-天冬氨酸 -脱羧酶的固定化细胞装 入带夹套的固定化生物反应器内（1.5cm30cm ） ， 1.0mol/L 延胡索酸铵（含
13、1mmol/L MgCl2，pH9.0 ）底物，以恒流速度通过天冬氨酸酶固定化细胞柱，SV=0.87h -1，然后将流出液通过 L-天冬氨酸 -脱羧酶固定化细胞柱，并加 0.1mmol/L PLP 和 28%的氨水，使 pH6.0，流出液用纸层析法计算L-丙氨酸的量 ，并计算转化率（L-丙氨酸转化率=L- 丙氨酸浓度 /延胡索酸铵浓度100%） 。【思考题】分别求出湿菌体天冬氨酸酶活力、固定化细胞的天冬氨酸酶活力及湿菌体 L-天冬氨酸-脱羧酶产生菌活力、固定化细胞 的 L-天冬氨酸 - 脱羧酶活力。分别求出两种菌体包埋后的活力回收率。分别求出 L-天冬氨酸和 L-丙氨酸的转化率。81第二节 多
14、肽及蛋白质类药物实验二十三 重组水蛭素的制备注：此实验内容来自校企合作课题，部分成果已申请专利【实验目的】1了解以基因工程菌种 E.coli/pHV3 为材料进行工程菌发酵培养、外分泌表达小分子多肽类药物重组水蛭素及表达蛋白制备和抗凝血酶活力测定、SDS-PAGE 电泳分析鉴定的工作原理。2掌握基因工程菌发酵培养条件、分泌表达目的蛋白及表达蛋白分析鉴定的操作技术方法。【实验原理】水蛭素(hirudin)是一类由医用水蛭(Hirudo)唾液腺中分泌出的低分子量的酸性单链多肽，1904 年，Markw ardt 首先将其分离纯化，并于 1970 年确定它是迄今发现的最强的凝血酶特异性抑制剂，即使在
15、较低的浓度也可充分地阻止血液的凝固。药理学及临床研究表明，水蛭素能有效地预防静动脉血栓的形成及弥散性血管凝结，不引起过敏、免疫反应，不会造成循环功能障碍。可用于治疗不稳定性心绞痛(USA)、急性心肌梗死(AMI) 、血管成形术、术后血栓形成、血液透析、体外循环、弥散性血管内凝血(DIC)等，是很好的抗凝抗栓药物。水蛭素的分子质量约为7 000Da，含有 6566 个氨基酸残基，水蛭素肽链的二级和三级结构对其抗凝活性起决定性作用，其 N 端的 3个二硫键则 是决定分子二级和三级结构及其稳定性的关键，将二硫键氧化，或分子发生蛋白降解，则失去抗凝活性。若端羧基被酯化，或失去端氨基酸，也会失去与凝血酶
16、结合的能力。水蛭素干燥状态下稳定，室温下水中可稳定存在6 个月，80下加热 15 min 不被破坏。pH 值升高则稳定性下降，在 0.1 mol/L 盐酸溶液或 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液中可稳定 15 min。水蛭素不被胰蛋白酶水解，对 -糜蛋白酶也有一定的耐受性，但番木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶 A 则可使之失去活性。由于天然水蛭素来源非常困难，每条水蛭只含 20g的水蛭素，不能满足临床应用。为此，国外多家公司及研究单位从 80 年代末就开始研究采用基因工程技术生产重组水蛭素。目前，在国外已上市的水蛭素产品有 Hoechs 公司的重组水 蛭素(Lepir udin,商品名 R
17、efludon)，Novartis 公司的重组水蛭 素产品 (Desirudin)。1997 年，本院合成了重组水蛭素基因并构建了大肠杆菌外分泌表达体系，分泌型重组水蛭素基因工程菌的表达产物重组水蛭素（recombine hirudin , 简写为 rHV3）相对分子质量为 7 010.8Da。此工程菌为外分泌表达体系，其基因表达产物 rHV3 易于纯化。但该表达系统会产生一些杂质蛋白和色素，影响下游的分离纯化。提取纯化工艺采用了大孔吸附树脂疏水层析和离子交换层析方法较好地解决了杂质蛋白和色素的分离。大孔吸附树脂作为 rHV3 的第一个提取步骤，高分子量杂蛋白被基本去除，而离子交换则是去色素的
18、关键。吸附及离子交换时采用合适的洗脱条件是提高活力收率的重要因素。该纯化方法工艺简单、rHV3 收率和纯度均较高，适用于 rHV3 的大规模制备。本实验以此工程菌为材料，先进行工程菌发酵培养，再将发酵液经离心，从工程菌发酵液上清中分离纯化 rHV3。发酵上清液经过大孔吸附树脂 HP20 处理后，用 DEAE-52 阴离子纤维素交换层析，得到较高纯度表达产物rHV3。rHV3 进行抗凝血酶活力分析和8215%SDS-PAGE 电泳分析。rHV3 生物活性的测定参照 Markwardt 的凝血酶滴定方法进行。比活力测定方法为：精确称取纯化产物 10mg，溶解于 1 ml H2O 中，采用 Lowr
19、y 法测定蛋白质含量，并测定抗凝血酶活力，rHV3 比活力=抗凝活力 (ATU)/蛋白含量。【实验材料】1器材（1）玻璃层析柱：1.6 cm20cm 或/和 2.6 cm40cm 1 套（2）恒流泵 1 台（3）自动部分收集器 1 台（4）记录仪 1 台（5）恒温水浴锅 1 台（6）高速台式离心机 1 台（7）冷冻离心机 1 台（8）旋涡混合器 1 台（9）752 紫外分光光度计 1 台（10）稳压电泳仪 1 台（11）摇床 1 台（12）垂直板式电泳槽 1 套（13）电炉 1 只（14）秒表 1 只（15）高压灭菌锅 1 台（16）电磁搅拌器 1 台（17）酸度计 1 台（18）发酵罐 1
20、台（19）微量移液器（20l，200l，1 000l ） 各 1 支（20）标准净化工作台 1 台（21）真空泵和真空干燥器 1 套（22）电子天平(精确到 10mg) 1 台（23）照相器材 1 套（24）基因工程菌菌种：E.coli/pHV3 为本实验室保存（25）大孔吸附树脂 HP20 若干（26）DEAE-52 阴离子纤维素 若干（27）Eppendorf 离心管架 1 只（28）96 孔酶标板 1 只（29）脱色摇床 1 台（30）灭菌的移液器枪头 若干（31）灭菌的 Eppendorf 管（1.5ml 微量离心管） 若干（32）试剂瓶（5 000 ml，1 000 ml，500 m
21、l，250 ml，100 ml ） 若干（33）量筒（2 000 ml，1 000 ml，100 ml，10 ml） 各 1 只（34）烧杯（2 000 ml，1 000 ml，500 ml，250 ml，50 ml ） 各 3 只（35）布氏漏斗（8 cm 1 只）和吸滤瓶（1 000 ml） 各 1 只（36）滤纸 若干（37）玻棒 2 根83（38）试管(5ml，150 支；15ml，16 支) （39）三角瓶（250 ml） 2 只（40）大塑料桶 1 只（41）石英比色杯 1 对2试剂重组水蛭素制备和抗凝血酶活力：（1）培养基：种子培养基（LB 液体培养基 ）：1% 胰蛋白胨（Try
22、ptone），0.5% 酵母提取物（Yeast Extract），1% NaCl，加蒸馏水配制，pH 7.0，分装，高压蒸汽（ 1.03105Pa）灭菌 20 min。接种前在无菌条件下加入抗生素，氨苄青霉素 的终浓度为100g/ml 。发酵培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，4%谷氨酸钠，10%麦芽汁。pH6.5，摇瓶装液量为 12%；（2）氨苄青霉素(Amp)；（3）0.5%牛血纤维蛋白原： 0.05 mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH7.4) 配制；（4）凝血酶溶液：500 NIH 单位加 5 ml 蒸馏水；（5）低分子量标准蛋白(17. 594 K Da)；（6）20 mm
23、ol/L 乙酸；（7）盐酸；（8）异丙醇；（9）20 mmol/L 哌嗪；（10）氯化钠；（11）三（羟甲基）胺基甲烷（Tris） ；（12）乙醇；（13）氢氧化钠；（14）谷氨酸钠（或含 99%谷氨酸钠的味精） ；15%SDS-PAGE 电泳分析：同实验九。 【实验方法】1工程菌发酵培养（1）从平板上挑取菌种接种于新鲜的含氨苄青霉素(终浓度为 60 g/ml)的 LB 液体培养基中，37，摇床转速 220r/min，培养 18h。（2）摇瓶培养：再按 3%接种量转接 于发酵培养基中，37，250 r/min，30h，离心收集上清。（3）补料-批式发酵：30L 的发酵罐装入 15L 发酵培养基
24、，初始 pH 值为 6.5，121 下灭菌 20 min，待温度降至37时加氨苄青霉素至最终浓度为 60g/l，接入种子液1 000ml，37培养，调节搅拌速度及通气量，控制溶氧在 1020% ，通过补充酸、碱物质控制pH 在 6.07.5，同时通过流 加葡萄糖或蛋白胨调节培养基中营养成分，延长活力表达时间。培养 916h。2重组水蛭素分离纯化制备（1) 发酵上清液制备下罐后发酵液经 12 000 r/min 高速离心除去菌体，收获发酵上清液。采用 Lowry 法和Markwardt 的凝血酶滴定法分别检测目的蛋白重组水蛭素含量和活性及进行 15%SDS 84PAGE 电泳分析。计算收率。（2
25、) 大孔吸附层析大孔吸附树脂 HP20处理装柱，用 20 mmol/L 乙酸平衡 。调节发酵上清液 pH 值至5.06.0，于抽气泵中脱去气泡，以 1ml/min 的流速将样品上柱。依次用 20 mmol/L 乙酸洗涤和 50 mmol/L pH8.5 Tris-HCl 洗涤，再用含 1040%异丙醇的 20 mmol/L 乙酸梯度洗脱，分部收集器收集，1.5ml/min，每管收集 6ml， 测定每管的 A280 值和重组水蛭素活性，绘制洗脱曲线。收集显示活性组分，检测重组水蛭素含量和活性及进行 15%SDS-PAGE电泳分析。计算收率。大孔吸附柱处理方法：首先用蒸馏水漂洗，去除漂浮的细小颗粒
26、，再用 95%乙醇反复浸泡使其充分溶胀和初步除杂。然后用 95%乙醇在布氏漏斗中淋洗至乙醇在 254nm 的紫外吸收值小于 0.03 为止。再用蒸馏水洗尽乙醇。最后分别用5%盐酸和 5%氢氧化钠浸泡 3h，均分别洗至pH 值为中性。（3) DEAE-52 阴离子交换柱层析DEAE-52 阴离子 纤维素柱经 20 mmol/L 哌嗪平衡。 大孔吸附层析产物液样品经 10 mmol/L 哌嗪调节至 pH6.0 后上样。用平衡缓冲液洗涤至基 线平稳。再用含 0.10.4 mol/L NaCl 的 20 mmol/L 哌嗪(pH6.0) 溶液梯度洗脱，分部收集器收集，1.5ml/min，每管收集6ml
27、， 测定每管的 A280 值和重组水蛭素活性，绘制洗脱曲线。收集显示活性组分，冷冻干燥后即得高纯度的重组水蛭素冻干粉。检测重组水蛭素含量和活性及进行 15%SDS-PAGE 电 泳分析。计算收率。3重组水蛭素生物活性测定 于酶标板小孔中加 0.5% 牛血0.05 mol/L Tris-HCl 缓冲液 (pH7.4)配制200l，再加入重组水蛭素溶液 10100l，充分混匀。用微量进样器吸取标准的凝血酶溶液(100 NIH 单位)，时间间隔为1 min，若在 1 min 内纤维蛋白原发生凝固，即说明已达滴定终点。由凝血酶的消耗量换算出重组水蛭素的单位数。由于水蛭素与凝血酶是1:1 结合，故每消耗
28、一个凝血酶单位(NIH)相当于一个抗凝血酶单位(ATU)。4重组水蛭素比活力测定方法精称纯化产物 10mg，溶解于 1 ml H2O 中，采用 Lowry 法测定蛋白质含量，并测定抗凝血酶活力，经以下公式换算即得单位质量的 rHV3 比活力。rHV3 比活力=抗凝活力(ATU)/蛋白含量。515%SDS-PAGE 电泳分析样品 纯度电泳方法同实验九。（1) 按常规制备电泳用聚丙烯酰胺凝胶，浓度 15。（2) 将发酵液上 清、解吸液和离 子交换洗脱液样品处理后，进行 15%SDS-PAGE 电泳析。 （3) 电泳 23h 后，取出凝胶，用 0.15%考马斯亮兰-R250 进行染色。过夜后倾出染液
29、，不断脱色，起初每 20min 换液1 次，1h 后每小时换液 1 次，直到区带明显，画出电泳区带图谱。6结果处理（1）用箭头图表示重组水蛭素制备的操作流程。（2）绘制洗脱曲线。（3）重组水蛭素的纯化过程分析85重组水蛭素的纯化过程分析纯化步骤 总蛋白(mg) 总活力(ATU) 比活(ATU/mg) 纯化倍数 收率(%)A.发酵上清液B.大孔吸附层析 C.DEAE-52纤维素柱层析（4) 电泳图谱分析【思考题】1影响重组水蛭素纯度和收率的因素有哪些？如何加以控制？2试说明电泳图谱，并用电泳图谱判断所制得的重组水蛭素的纯度。3如何在原核内成功表达小分子多肽类药物而不被宿主内蛋白酶水解？86实验二
30、十四 酸醇提取法制备猪胰岛素注：此实验内容来自校企合作课题 【实验目的】1学习胰岛素的制备方法2了解胰岛素的理化性质及其在制备方面的应用3掌握酸醇提取法制备猪胰岛素的技术【实验原理】胰岛素（insul in）是动物胰腺中兰氏小岛-细胞所分泌的一种动物激素，在体内具有降低血液中葡萄糖含量和调节血糖平衡的作用。医疗上主要用于治疗糖尿病， 也是生化工程中作为研究蛋白质结构与功能的常用材料。胰岛素共51个氨基酸，由A、B两条肽链组成。A链含21个氨基酸，B链含30个氨基酸，两条肽链之间借两个二硫键联结，A链的第6与第11位氨基酸之间也有一个二硫键。人胰岛素分子量为5 734Da，等电点为pH5.6 。
31、在酸性环境（pH2.53.5）较稳定，在碱性溶液 中极易失去活力，可形成锌、钴等胰岛素结晶。又由于其分子中酸性氨基酸较多，可与碱性蛋白如鱼精蛋白等结合，形成分子量大、溶解度低的鱼精蛋白锌胰岛素。在显微镜下观察呈正方形或偏斜方形六面体结晶。胰岛素不溶于水和乙醇、乙醚等有机溶剂，但易溶于稀酸和稀碱的水溶液，也能溶于酸性或碱性的稀乙醇和稀丙酮中。胰岛素一般由动物脏器提取， 其生产方法有酸醇提取减压法、分级提取锌沉淀法和磷酸钙凝胶、DEAE-纤维素及离 子交换树脂吸附法。本实验介绍酸醇提取减压浓缩法由猪胰提取胰岛素的方法。【实验材料】1器材：（1）组织捣碎机 1台 （2）布氏漏斗 10cm 1个（3）
32、抽滤瓶 1 000ml 1个 （4）抽气泵 1台（5）剪刀 1把 （6）烧杯 400ml 2个200ml 2个100ml 1个（7）纱布 25cm25cm 1块 （8）玻璃棒（大） 2根玻璃棒（小） 2根（9）量筒 500ml 1只100ml 1只10ml 1只（10）容量瓶 100ml 1只 （11）分液漏斗 250ml 1只 （12）离心机 1台 （13）真空干燥器及真空泵 1套87（14）温度计 100量程 1根（15）pH试纸 各种量程规 格 1套2试剂：（1）86乙醇、68乙醇 （2）草酸 （3）6mol/L硫酸溶液 （4）浓氨水、2mol/L氨水、4mol/L氨水（5）氯化钠 （6
33、）冷丙酮 （7）20、6.5醋酸锌溶液 （8）2、10柠檬酸溶液（9）0.01mol/L 盐酸（10）0.1mol/L磷酸二氢钠溶液（11）乙醚（12）乙腈【实验方法】1操作方法：(1) 提取：取冻胰块100g用匀浆机绞碎后加入2.32.6倍的 86乙醇(w/w)，5冻胰重的草酸（少许硫酸调至pH2.5 3.0），在1015 温度下搅拌提取3h。过滤或离心取上清，滤渣再用l倍量68乙醇和0.4 冻胰重的草酸及少许硫酸按上法提取2h，同上法分离合并乙醇提取液。(2) 碱化、酸化：提取液在不断搅拌下加入浓氨水调溶液 pH为8.08.4（液温1015 ），立即压滤或离心除去碱性蛋白。澄清液及时加6M
34、硫酸酸化至pH为3.43.8，降温至05 ，静置 4h以上，使酸性蛋白充分沉淀。(3) 减压浓缩：离心取上清液，在30 以下真空浓缩除去乙醇，浓缩至浓缩液比重为1.041.06（约为原来体积的1/9 l/10 ）为止。(4) 去脂、盐析： 将浓缩液转入烧杯，于10min内加热至50，立即用冰盐水冷却降温至5 ，转置分液漏斗静置 34h，使油层分离。分出下层清液（上层油脂可用少量蒸馏水洗涤回收胰岛素），调pH 为2.32.5，于2025 在搅拌下加入23 (W/V)固体氯化钠，搅拌盐析， 静置数小时，盐析物即为粗品胰岛素（含水量约为40%）。(5) 精制： 除酸性蛋白： 取粗制胰岛素，按其干重加
35、入7倍量冰冷蒸馏水溶解 （7倍量水应包括粗制胰岛素中所含水量），再加入3倍量的冷丙酮（按粗品计）并用2mol/L 氨水调节pH 为4.24.3，然后按耗用的2mol/L氨水量补加丙酮使溶液中水和丙 酮的比例为7 : 3。充分搅拌后，低温放置过夜，使溶液冷至5以下，次日在5 以下用离心分离法或用布氏漏斗过滤法将沉淀分离。 锌沉淀： 在滤液中加入2mol/L氨水调pH 到6.26.4，按溶液体积加入3.6醋酸锌溶液（浓度为20），再用2mol/L氨水调节使最终pH 为6.0，低温放置过 夜，次日用布氏漏斗过滤，分离沉淀。 结晶： 经丙酮脱水后按每克精品（干重）加入2柠檬酸50ml 、6.5醋酸锌2
36、ml，丙酮16m1，并用冰水稀释至100ml，置冰浴中速冷至5以下，用2M氨水调pH8.0，迅速过滤。滤液立即用10柠檬酸溶液调pH6.0 ，然后补加丙酮使整个溶 液体系保持丙酮含量为l6%。88在10 下缓慢搅拌25h后放入35 冰箱72h使之结晶，前48h内需用玻璃棒间歇搅拌，后24h静置不动这一步骤关系到结晶优劣，须仔细操作。在显微镜下观察，外形为正方形或扁斜方形六面体结晶。结晶离心收集，并用毛刷小心刷去晶体上面所覆灰黄色无定形沉淀，用蒸馏水或醋酸铵溶液洗涤，再用丙酮、乙醚脱水，离心后，在五氧化二磷真空干燥箱中干燥，即得结晶胰岛素，效价每毫克应在25单位以上。(6) 检测：取对照品及供试
37、品适量，分别加 0.01mol/L 盐酸溶液制 1ml 中含40 单位的溶液，照高效液相色谱法试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(5m)；柱温 40；以0.1mol/L 磷酸二氢钠溶液（用磷酸调节pH 值为 3.0）- 乙腈(73:27)或适宜比例的混合液（含0.1mol/L 硫酸钠）为流动相；检测波长为214nm；流速为 1ml/min。取供试品溶液及对照品溶液各 20l 注入液相色 谱仪，记录主峰的保留时间，供试品的主峰保留时间应与同种属对照品的主峰保留时间一致。 (7) 效价测定：将效价确定的Insu lin标准品用0.01mol/L盐酸液配制并稀释成40、30、20、10、1和0.5
38、U/ml溶液。样品原料以0.01mol /L盐酸液配制并稀释成1.5mol/ml溶液进样测定。效价计算以主峰面积为纵坐标，Insulin 浓度为 横坐标进行线性回归，计算而得。【思考题】1提取过程中，影响胰岛素活性/效价的因素有哪些？如何提高提取率？2制备猪胰岛素的原理及其应注意的问题89实验二十五 多肽缩宫素的Fmoc固相合成法注：此实验内容来自校企合作课题 【实验目的】1学习多肽固相合成的方法及其分离纯化操作。 2了解多肽固相合成的基本原理以及合成中功能基团的侧链保护策略。 3掌握缩宫素Fmoc固相合成法的 基本原理及其注意事项。 【实验原理】1963年Merri field创建并发展了多
39、肽固相 合成（solid-phase polyp eptide synthesis）方法之后，多肽研究领域发生了划时代的变化。固相方法以快速简便的操作和高产率显示了无可比拟的优越性，应用该方法几乎可以随心所欲地合成任何多肽。缩宫素(oxytocin)是垂体后叶激素的主要成分之一，临床主要用于引产、产时子宫收缩乏力、产后出血、子宫复位不良及月经过多等，是由8种氨基酸按如下所示的顺序排列，通过肽键结合而成的9肽化合物。S S(C端)-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-(N端)Fmoc固相合成法制备缩宫素的 原理是：首先将其所含的8种氨基酸分别制成N -芴甲氧羰
40、基( Fmoc)氨基酸，然后从C 端开始，将氨基酸的羧基以共价键形式与一个不溶性高分子树脂相连，就以这一氨基酸的氨基作为合成的起点，使其同排列顺序中相邻的氨基酸的羧基发生酰化反应，形成酰胺键（肽键） ，然后再让这一包括两个氨基酸的树脂肽的氨基与下一个氨基酸上的羧基形成肽键，并不断重复这一过程，即可逐渐延长肽键，直至缩宫素的N 端形成 为止。用固相方法合成具有特定氨基酸顺序的多肽必须满足3个条件：一是通常把要合成多肽的羧基端键合到固相载体上，然后从氨基端逐步增长肽链；二是需要对暂不参与形成酰胺键的氨基加以保护，同时对氨基酸侧链上的活性基团也要保护，反应完成后再将保护基团除去；三是对参与形成酰胺键
41、的羧基必须进行活化。【实验材料】1器材（1）多肽合成反应器 1台（2）旋转蒸发仪 1台（3）高速冷冻离心机 1台（4）HPLC 1台（5）真空泵 1台（6）电子天平 1台（7）电动搅拌机 1台（8）电热恒温干燥箱 1台（9）圆底烧瓶 50ml 1个(10) 量筒 10ml 1个100ml 1个(11) 布氏漏斗 1个 2试剂90（1）Fmoc保护氨基酸: Fmoc-Cys(Trt)-OH； Fmoc-Tyr(tBu)-OH； Fmoc-Asn(Trt)-OH； Fmoc-Gln(Trt)-OH； Fmoc-Ile-OH； Fmoc-Pro-OH； Fmoc-Leu-OH； 注：Fmoc氨基酸(
42、Trt)-OH表示氨基酸的-氨基和侧链基团已分别被Fmoc和Trt（三苯甲基）所保护。（2）HOBt（3）DIC（二异丙基碳二亚胺）（4）TFA（trifluoroacetic aci）（5）DMSO（6）哌啶经重蒸后使用（7）DMF （二甲基甲酰胺）（8）茚三酮（9）Cys(Trt)-2-Chlorotrityl Resin （半胱氨酸-2-氯三苯甲基树脂）【实验方法】1粗品制备(1) 称取约含0.2mmol 半胱氨酸的半胱氨酸-2- 氯三苯甲基树脂，用10ml DMF溶胀30min，抽滤。活化Fmoc-氨基酸：向0.3mmol Fmoc-Tyr(tBu)-OH 中加入 10ml溶有0.33
43、mmol DIC和0.45mmol HOBt的DMF溶液，摇匀静置活 化20min。(2) 缩合：将活化好的Fmoc-氨基酸溶液加到盛有上述树脂的反 应器皿中，室温下缓慢摇动反应2h，抽滤，用DMF洗3次，每次5ml。(3) 脱除Fmoc保护： 将10ml含20%哌啶的DMF溶液加到盛有上述树脂的反应器中室温下反应30min除去Fmoc 保护基团，抽滤，然后用5ml DMF洗涤3次。采用同样的试剂用量和操作步骤，按缩宫素分子序列顺序依次用下一种保护型氨基酸重复上面的接肽反应，直到最终形成所需的多肽序列。(4) 侧链脱保护及多肽链脱离树脂：向肽- 树脂样品中按15ml /g树脂的比例加入K试剂三
44、氟乙酸/二氯甲烷/1，2-乙二硫醇/ 苯甲醚/水(80/10/5/3/2，v/v)，室温下摇动反应4h。抽滤后用1ml2ml TFA分两次洗涤树脂，洗涤液并入裂解液中。将裂解液旋转蒸发浓缩至小体积，然后将裂解液滴入100ml冷乙醚中得到多肽沉淀，将沉淀冷冻 离心分离。(5) 成键反应：将上述沉淀溶解于10ml 25的DMSO水溶液中，摇匀并在室温下静置24h形成二硫键，然后将溶液冻干得到粗品氧化产物。2精制缩宫素粗品产物通过Sephad ex G-15凝胶过滤层析，用25%的醋酸水溶液洗脱进行纯化。洗脱产物采用制备型高效液相，经反相键合C18柱进行梯度洗脱最终纯化。色谱条件为：流动相由含0.1
45、%TFA 的10%-75%的乙腈溶液在35mi n内进行梯度洗脱，流速为1.5ml/min，检测波长为220nm 。3 检测粗品作为供试品溶液进行薄层层析检测，应只有一个清晰的斑点，薄层板采用G60-F254型硅胶板，溶剂展开系统取丁醇:醋酸: 水=4:1:5的混合液的上清，或乙腈:水=5:1 的混合溶剂。取本品作为供试品溶液，另取合成缩宫素对照品，加 0.9%氯化钠溶液制成每 1ml 中含5 个单位或 10个单位的对照品溶液。照高效液相色谱法，以辛基硅烷键合硅胶为填充剂，0.1mol/L 磷酸二氢钠溶液-乙腈(82:18)为流动相，流速为 0.8ml/min，检测波长为220nm。取91供试品溶液与相同浓
