1、1 / 37中国特有药用植物铁破锣化学成分及生物活性的研究摘 要 铁破锣BeesiacalthaefoliaUlbr.系毛茛科铁破锣属植物；广泛分布于我国云南西北部，四川、贵州、广西北部，湖南、湖北西部和陕西、甘肃南部，是一种民间常用草药，也是我国特有的药用植物。其根茎或全草药用，具有清热解毒，凉血，活血，消肿，镇痛，散风寒的功效；民间用来治疗风寒感冒，风湿关节痛，红白痢疾，咽喉肿疼，头痛，牙痛等病，外敷治疗疮疗和毒蛇咬伤。铁破锣在民间有广泛的用药基础，常和其它中药组成方剂，在不同地区有不同的别名，又称山豆根、滇豆根，猴儿七、白细辛，定木香，一口血、葫芦七，土黄连、单叶升麻，是一种民间常用草药
2、。为了探讨其生理活性成分，为合理用药和新药开发提供科学依据和物质基础，我们对其化学成分进行了系统的研究。 利用多种吸附材料和分离方法对贵州产铁破锣全草和甘肃产铁破锣根茎的乙醇提取物进行了卓有成效的分离工作，共分离得到四十个化合物，并通过经典的化学方法和各种先进的波谱学技术，鉴定了其中三十三个化合物，已鉴定的化合物中，有 18 个为新化合物，12 个系首次从该植物中分离得到。2 / 37新化合物包括 16 个环菠萝蜜烷型三萜皂甙、一个齐墩果酸型三萜皂甙和一个有机酸，分别命名为：铁破锣皂甙ABC-ll，201-242-epoXy-9，19-cyclolanostane-3，16，18，25-tet
3、raol-3 一 O-D-xylopyranoside，铁破锣皂甙 BBC-12，epoxy 一 9，19-cyclolanostane3，13，16，25tetraol-3-O-D-xylopyranoside；铁破锣皂甙 CBC 一 10,-16acetoxy-20，24-epoxy-9，19-cyclolanostane-3，12，25-teriaol-3-0-D-xyloPyranoside；铁破锣皂甙 DBC-14，-epoXy-9，19-cyclolanostane-3，12，16，18，25-Pentaol-3-O-D-xylopyranoside；铁破锣皂甙 EBC-15，20
4、l-242-epoxy-9，19-cyclolanostane-3，12，16，18，25-pentaol-3 一 O-D-xylopyranoside；铁破锣皂甙 FBC-13，-16-acetoxy-epoXy-9，19-cyclolanostane-3，12，18，25-tetraol 一 3 一 O-；铁破锣皂甙 GBC一 16，201 一 242 一 epoxy 一 9，19 一cyclolanostane-3，15，16，18，25-pentaol-3-O-D-xylopyranoside；铁破锣皂甙 Hgbc-23，一15，16-diacetoxy-epoxy 一 9，19 一c
5、yclolanostanostane 一 3，18，25 一 triol-3 一 O-D-xylopyranoside；铁破锣皂甙 Iagbc-22，-16-3 / 37acetoxy-18，24；20，24-diepoXy-9，19-cyclanostane-3，15，25-triol-3-O-D-xylopyranoside；铁破锣皂甙 Jgbc-20，-16-acetoxy 一 18，24；20，24-diepoxy 一 9，19 一 cyclane-3，25-diol-3 一 O-D-xylopyranoside；铁破锣皂甙 Kgbc-18，-15-acetoxy-16，24；20，2
6、4-diepoXy-9，19-cyclolanostane-3，25 一 diol-3-O-D-xylopyranoside；铁破锣皂甙Lgbc 一 19，15-acetoxy 一 201 一 242 一 epoxy 一9，19 一 cyclolanostane 一 3，16，25 一 triol-3-O-D-xylopyranoside；铁破锣皂甙 Mgbc-26，-15-acetoxy-9，19-cyclolanestane-3，6，20，24，25-pentol-3-O-P-D-xyloPyranoside；铁破锣皂甙 Ngbc-27，201-242eqoxy-9，19-cyclolan
7、ostane-3，12，15，16，25-pentaol-3-o-p-D-Xylopyranoside；铁破锣皂甙 ogbc-30，201-242-epoxy-9，19-cycldanostane-3，16，18，25-tetra01-3-o-D-glucopyranoside；铁破锣皂甙 Pgbc-31，20l-242-epoxy-9，19-cyclolanostane-3，16，18，25-tetraol-3-O-D-glucopyrasy1 一一 -D-glucopyranoside；铁破锣 Qgbc-33，oleanolicacid 一 3 一 o 一 一 L 一rhamnopyran
8、osyl 一一 -D 一 glucopyran03y2-D-4 / 37glucopyranosyleste和铁破锣酸BC-07，9-苯基一2E，4E，6E，8E-壬-四烯酸。已知化合物包括 3 个三萜，即：蒲公英萜酮，蒲公英萜醇，表木栓醇；2 个甾醇，即：E-24-ethyl-ch01est-22 一 en 一 3 一 ol， 一谷甾醇；3 个有机酸，即：香草酸，阿魏酸，硬脂酸；4 个环菠萝蜜烷型三萜皂甙，即：升麻醇-3-o-D-吡喃木糖甙，25-脱水升麻醇-3-O-D-吡喃木糖甙，beesideI)beesioside；2 个齐墩果酸型三萜多糖皂甙，即：铁破锣皂甙 Roleanolicac
9、id 一 3 一 o 一 一 L-rhamnopyranosyl 一 一 L 一 rhaminopyranosyl一一。-L-arabinopyranosyl-L-arabinoyranosyl-28-O-L-rhamnopyranosyl-D-glucopyranosyl-D-glucopyranosylester；铁破锣皂甙 Sgbc-35，oleanolicacid 一 3 一 o-D-glucoPyranosyl 一 一 L-arabinoPyranosyl-28 一 o 一 一 L 一rhamoopyranosy1 一一 -D-g1ucoPyranosyl 一 -D-g1ucopyr
10、anosylester3 和胡萝卜甙。对铁破锣中分离鉴定的部分单体化合物进行了初步的生物活性筛选试验。受体结合试验表明部分单体化合物对三种受体具有一定的拮抗活性。在较低浓度时，化合物gbc021-23 和 gbc-25 对淋巴细胞增殖具有显著的促进作用；在一定浓度范围 20-100gml)时，化合物 BC-11、BC-125 / 37和 BC-14 对 GLC-82 细胞株显示一定的抗肿瘤活性并且成一定的量效关系。首次发现两个结构较为独特的化合物，显示出了较好的药理学活性，有一定的应用和开发前景。这两个化合物是：铁破锣皂甙 M 在低浓度时对钙通道的拮抗活性达 7955，是一种钙拮抗剂，有望在防
11、治心血管系统疾病方面有所突破。铁破锣皂甙 K 在小鼠体内试验可明显抑制由 ConA 诱导的 T 细胞增殖，具有免疫抑制作用，是一种免疫抑制剂；鸡胚尿囊膜试验还显示铁破锣皂甙 K 还有抑制微血管生成方面的活性；其作用机理值得深入研究。这项研究工作为寻找开发新药的先导化合物及进一步开发和利用铁破锣这一丰富的药用植物资源奠定了坚实的基础。关键词 铁破锣属铁破锣化学成分环菠萝蜜烷型三萜皂甙齐墩果酸型三萜皂甙铁破锣皂甙 A-Q 铁破锣酸药理活性钙离子受体拮抗活性免疫抑制活性抑制血管生成活性化学成分与民间疗效关系结果与讨论一、结构解析举例1铁破锣皂甙 B 的结构测定化合物 BC-12，白色无定型粉末，D2
12、0 十136。 ，Liebermann-Burchard 反应阳性，Molish 反应阳6 / 37性，薄层水解检识有木糖。FAB-MS 显示 mz 623M 十 H+，结合 1H 和 13CNMR 谱数据推测其分子式为 C35H58O9，不饱和度为 7。BC-01 BC-02 BC-03BC-04 BC-05 R=H *BC-07gbc-24 R=Gic gbc-08 bgc-09 *BC-14*BC-10 R=COCH3 *BC-13 R=COCH3 *BC-14*BC-10 R=H *BC-13 R=H BC-16 gbc-32 *gbc-18 gbc-19 R=H *gbc-20 gb
13、c-21 R=COCH3gbc-25 R=OH *gbc-22 R=H*gbc-23 gbc-26 *gbc-277 / 37Fig 1 Structures chemical constituents isolated fr1234下一页om beesia calthaefolia Ulhr.IR 谱在 3600-3100 及 1045，1065cm-1 出现强吸收，示甙类化合物；FAB-MS 和 EI-MS 出现基峰 mz143，及失水峰 mz125，提示分子中存在部分结构 A，这是 ocotillone型三萜的典型特征；1HNMR 谱中 393，o，58，七个叔甲基质子的单峰信号0294
14、， ， ， ， ，提示该化合物的骨架为环菠萝蜜烷型三萜。糖的端基氢信号出现在 ，说明甙键为 构型。低场区除了木糖质子和 H-24 信号外，还显示 2 个连氧碳上的质子信号，。13CNMR 谱共显示 35 个碳信号。一组碳信号10745，7553，7852，7126，6705可归属为木糖的 C-1C-5。低场区除了 C-3 和 A 部分结构碳信号外，还显示 2 个连氧碳信号，。1HNMR 谱中 17 位氢出现在 ，考虑化合物的不饱合度，说明 16 位有羟基取代；1H-1H COSY 谱中 与 276 相关，还与 和 193 两个氢相关 13C-HCOSY 谱中， 与相关 5 根据偶合常数大小可判
15、断 16 经基与 17 位侧链处于顺式位置，因此确定 16 位经基为 构型；NOESY 谱中，H-16 与 H-17 相关，证明了上述结论。8 / 37Fig 2 Structure of BC-1213CNMR 谱中，C-18 出现在高场区，提示 12 位有羟基取代，这是因为 C-18 处在 12 位羟基的 位引起高场位移所致。13C-1HCOSY 谱中， 与 相关；1H-1H COSY谱中 与 ll 位两个氢 255， ，及失水峰 mz125，提示分子中存在 A 部分结构，1HNMR 谱中 394 可以归属 A结构中的 H-24，其 13CNMR 谱数据同 beesioside比较一致，证
16、明 A 部分结构的存在。1HNMR 谱显示环丙烷质子信号039，七个叔甲基质子的单峰信号096，1，03，120， ， ， ，及276，349，4，82；另外还显示一对 ABX 系统质子信号258，143 和 416。13CNMR 谱共显示 30 个碳信号；其中 c-3 向高场移至 7798。12 位经基的构型是通过比较 H-12 和 H2-11 之间的偶合常数确定的。SakuraiN 等用 X 光衍射的方法测定了beesioside甙元的双乙酰化物的结构，其 c-c-c-c 间的拓扑角为-144。 ，若 12-OH 为 构型，则 H-12 和 H2-11之间的偶合常数 J1 约为 8Hz，J
17、24Hz；若 12-OH 为 构型，则 H-12 和 H2-11 之间的偶合常数 Jl 约为8Hz，J23Hz。在化合物 BC-12a 中 H-12 和 H2-11 之间的偶合常数 Jl89，J227Hz；化合物 BC-12 中 H-12和 H2-ll 之间的偶合常数 Jl88，J230Hz，因此确9 / 37定 12-OH 为 构型。NOESY 谱中，H-12/Me-30H-17之间存在相关，亦支持这一结论。BC-12 的 1HNMR 谱中 3 位氢出现在 347，根据其裂分方式和偶合常数大小可判断 3 位氢为 构型；NOESY 谱中H-28 和 H-3 相关，也支持上述结构；与化合物 BC
18、-12a 比较其 C-3 位苷化位移值，确定木糖连在 C-3 位。HMBC 谱 中 H-1和 C-3 远程相关，证明了这一结论。Key correlations observed from HNBC of BC-12Significant correlation observed from NOESY of BC-12Fig 3 HMBC and NOESY of bc-12BC 一 12 的 NOESY 谱中，H-16H-Me-21、Me-21H-22H-23H-24、H-22H-22、H-23H-23、H-22H-23、H-24Me-26Me-27之间检测到 NOE 相关信号，因此 A 部
19、分结构的构型确定为20S*，24R*。Data of BC- 12,BC-12a and gbc-26in pyridine-d5 PositionBC-1210 / 371H13CBC-12a 13CBeesioside M1H13C12345611 / 3778910; ;12 / 37; ;13 / 3711-11-12131415161718192014 / 37*s15 / 37#,# ; 16 / 372122-22-23-23-24252627282930*s17 / 37*18 / 37*; *19 / 37COCH3COCH312345*m20 / 37signals wer
20、e assigned by 1H-H COSY,13C-1H COSY，NOESY and HMBC spectrum. *，*Overlapped signal 结合 1H-1HCOSY，13C-1HCOSY，NOESY 和 HMBC光谱，所有的碳氢信号都得以归属。综合以上证据，测定该化合物 BC-12 为-epoxy-9，19-cyclolanostane-21 / 373,12,16，25-tetraol-3-O-D-xylopyranoside,命名为铁破锣皂甙 B2铁破锣皂甙 M 的结构测定化合物 gbc-26，白色无定型粉末，mp。274-276，Liebermann-Burcha
21、rd 反应阳性，Molish 反应阳性、薄层水解检识有木糖。FAB-MS 显示 mz683M 十 H+，结合1HH 和 13CNMR 谱数据推测其分子式为 C37H62O11，不饱和度为 7。IR 谱在 3600-3100 及 1040，1090cm-1 出现强吸收，示甙类化合物；在 1720，1260cm-1 显C-15，16 和 17 的立体化学是通过研究 1H-1H 偶合常数确定的。H-16 和 H-17 之间偶合常数为 83Hz，说明 16 位羟基与 17 位侧链处于顺式位置，即 16 位羟基为 构型；H-15 和 H-16 之间偶合常数为 35Hz，说明 15 位乙酰基 构型。天然界
22、中，17 位含八碳开环侧链的四环三萜类化合物在 20，24，25 位同时具有 3 个羟基取代的化合物并不多见，从紫云英属中曾报道过侧链含 24，25 双羟基取代的四环三萜皂甙，Hirotani M 等认为根据 C-24 的化学位移值可以判断 C-24 的绝对构型，24R 构型时，C-24 化学位移出现在5；24S 构型时，C-24 化学位移出现在 771-773；同时报道了 3 个 24S 构型的环菠萝蜜烷型四环三萜22 / 37皂甙类化合物，其 C-24 化学位移均出现在肝 71-773。Inada A 等报道了 3 个 24R 构型的环菠萝蜜烷型四环三花类化合物，其 C-24 化学位移均出
23、现在 797-800。化合物 gbc-26 中 C-24 化学位移值在 8035，因此推测其 C-24 的构型为 24R。在人参属植物中曾发现 C-20 含羟基取代的型化合物，文献报道，12-OH 取代的化合物，20-OH 与 12-OH 存在形成氢键的可能，此时 20R 或 20S 构型的化合物，其 C-20 的化学位移才有较大差别，可以根据 C-20 的化学位移判断 20位的构型；但 12 位无羟基取代时，其 C-20 的化学位移并无显著差异。化合物 gbc-26 的 1HNMR 谱中有一甲基单峰出现在较低场 183，根据 HMBC 谱应归属为 18-CH3，与化合物 gbc-19 比较，
24、其化学位移明显向低场位移，这显然是受到 C-20 羟基空间电负性作用的影响所致，说明 20-OH 与18-CH3 处于 位，因此 20-OH 确定为 构型，从推断 C-20 的绝对构型为 S。Significant correlations observed from HMBC of gbc-26 综合上述分析，测定化合物 gbc-26 的结构为-15。-23 / 37acetoxy-9，19- cyclolanostane-3，l6，20，24、25-pentaol-3-O-D-xylopyranoside，命名为铁破锣皂甙 M。二、铁破锣化学成分与民间疗效关系问题的讨论及其应用前景问题的展
25、望铁破锣分布于我国南北各省，其根茎或全草药用，在民间有广泛的用药基础，具有清热解毒，凉血，活血，消肿，镇痛，散风寒的功效。民间用来治疗风寒感冒，风湿关节痛，红白痢疾，咽喉肿疼，头痛，牙痛等病，外敷治疗疮疗和毒蛇咬伤等。因此，从现代药理学的观点来看其民间疗效体现在三方面，即：解热镇痛抗炎作用、对心血管系统的作用、解毒及潜在的抗肿瘤作用。我们通过对铁破锣进行系统的化学成分研究，从中分离出大致三种类型的化学成分，即：三萜及甾醇类、有机酸类和三萜皂甙类；全草中三类成分均有，根茎中只含后两类成分；无论全草或根茎，其三萜皂甙类化学成分都占绝对优势，是铁破锣的主要成分。文献报道，蒲公英萜醇具有抗溃疡及抗胃酸
26、分泌的作用。表木栓醇，有抗炎作用；腹腔注射 30mgkg，对交叉莱胶引起的大鼠足趾水肿可抑制。香草酸具有抗菌和抗真菌作用，体外实验还显示抗炎活性。阿魏酸具有抗菌、抗真菌、抗肝（细胞毒)、抗雌激素、抗肿瘤和抗有丝分裂24 / 37等活性；体外可激活吞噬作用，还能抗氧化和清除自由基，保护膜脂体不受氧化。我们从铁破锣中分离得到的以上化合物揭示了其解热镇痛抗炎等方面的作用。我们对铁破锣中含量较高的三萜皂甙类化学成分进行了精细的分离工作，结果显示大部分单糖甙及双糖甙均具有环菠萝蜜烷型四环三萜母核，而多糖甙则具有齐墩果酸型母核。我们对部分环菠萝蜜烷型皂甙类单体化合物进行了初步的活性筛选试验，结果显示其对
27、5-羟色胺受体有一定的抑制活性，5-经色肤是一种重要的炎症介质，提示此类化合物抗炎镇痛等方面的作用；部分单体化合物对钙离子受体显示了相对较强的拮抗活性，钙离子与 cAMP 共同组成第二信使，说明此类化合物在心血管)如扩血管、降压、促智等)方面的作用。对此类化合物的抗肿瘤实验结果表明多数单体化合物在低浓度时几乎不显示细胞毒作用，在一定浓度范围对某此瘤株显示一定的细胞毒活性。我们从中得到的升麻醇木糖甙，文献报道此化合物在较大剂量时，能有效的抑制小鼠 CCL4 诱导引导起的肝损伤。揭示了铁破锣在治疗疮疖和解毒方面的作用。铁破锣中齐墩果酸型三萜多糖皂甙的分出，体现出铁破锣在升麻族中的个性，已报道此种骨
28、架的皂甙具有广泛的药理学活性涉及到增强机体免疫力、镇痛、降血脂、降25 / 37血糖、降血压、保肝、抗癌及激素样作用等。日本学者曾报道过几个与铁破锣皂甙 Q-S 结构较为相近的化合物。这几个化合物可防止 CCl4 诱导引起的肝损另一个结构上较为新颖的化合物，铁破锣皂甙 K 在小鼠体内试验可明显抑制由 ConA 诱导的 T 细胞增殖，具有免疫抑制作用，是一种免疫抑制剂；另外铁破锣皂甙 K 还有抑制微血管生成方面的活性；化学结构上看，此化合物含有 20，24；16，24 双环氧的缩酮结构，其作用机理值得深入研究。天然产物在新药研制和人类卫生保健中占有重要地位，天然产物是大自然在漫长地进化过程中形成
29、的，凝结了朴素的哲学思想，其疗效肯定，已成为食品、药品、化妆品等研制与开发的广泛的物质基础。我们通过对铁破锣系统的研究工作为寻找开发新药的先导化合物及进一步开发和利用铁破锣这一丰富的药用植物资源奠定了坚实的基础。实验部分一、 仪器药品二、 提取分离三、 药理活性研究1 受体结合试验26 / 37材料及模型代号a 样品来源：从铁破锣中分离得到的单体化合物。B 模型代号：SHT5LSC、CA+channelLSC、CABALSC、M1 受体、A1 受体部分单体化合物对五种受体的拮抗活性 样品代号SHT5LSCCa+channelLSCCABALSCM1 受体A1 受体BC11BC12BC13BC1
30、4BC15gbc21gbc22gbc23gbc25gbc26BC0727 / 370-028 / 3700000000029 / 3700000注样品浓度均采用较低 10g/ml，在此浓度下实验结果具有较强的参考价值，以上数据为化合物对受体的抑制率。模型说明模开代号分子靶点阳性对照测 试 指 标5HT5LSCCa+channelLSCGABALSC5-HT 受体 5 亚型钙通道30 / 37GABA 受体5-羟色胺尼群地平GABA样品对 3H-LSD 同该受体结合的抑制率 样品对 3H-尼群地平同该受体结合的抑制率样品对 3H-GABA 同该受体结合的抑制率结论：5-羟色胺是一种重要的炎症介质；钙在维持心血管细胞功能方面极为重要，与 cAMP 共同起第二信使作用；GABA 是一种抑制性神经递质；以上多数单体化合物对三种受体具有一定的拮抗活性。其中化合物 gbc-26 在低浓度时对钙通道的拮抗活性达%，是一种钙拮抗剂，有望在心血管系统疾病方面有一定前景。 2 体外抗肿瘤试验实验材料及模型代号： a 样品来源：从铁破锣中分离得到的单体化合物，DMSO 溶解配置样品。b 模型代号：Bel-7402，kb，GLC-82 细胞株淋巴细胞。部分化合物对 BEL7402|、KB 细胞的抑制率和对淋巴细胞的增殖率* 样品代号浓度Bel7402 抑制率%KB 抑制率%
