1、药物在肝微粒体酶的体外代谢研究 色谱小组：汤明海 2016.04.28 药物研发过程中可能会遇到的 问题 在进行新药 （包括中药 ）研发的历程中 ，您可能会面临和解决这样的问题: 1. 新 药 前 体 是 否 被 肝 脏 药 物 代 谢 酶 系 统 代 谢 ， 造 成 口 服 生 物 利 用 度 低 下 ？ （ 即体外代谢稳定性评价,In vitro metabolic stability study ） 2. 如 果 新 药 前体 被 肝 脏 显 著代 谢 ， 是 何 种酶 系 参 与 该 新药 前 体 的 代 谢 ？ （ 即 体外代谢表型的鉴定, In vitro metabolic ph
2、enotype identification ） 3. 如 新 药 前 体 被 肝 脏 显 著 代 谢 ， 其 代 谢 产 物 是 什 么 ， 其 毒 性 或 药 效 如 何 ？ （ 即体外代谢产物的鉴定, In vitro metabolite identification ） 4. 新 药 前 体 是否 能 抑 制 或 诱导 肝 脏 药 物 代谢 酶 系 ， 进 而影 响 其 它 药 物的 药 效 和安全 ？（即体外抑制评价和诱导评价, In vitro inhibition or induction study ） 5. 新 药 前 体 在何 种 动 物 代 谢特 征 与 人 相 似 ，
3、 进 而 为 临 床前 研 究 的 动 物选 择 提 供依据 ？ （ 即 体 外 人 和 动 物 代 谢 特 征 研 究, In vitro metabolism profiling in animals and humans ） P450 酶 肝微粒体酶中最主要的是细胞色素P450(Cytochrome P450) 氧 化 酶 ， 简称P450 酶 ， 酶 蛋 白 中 所 含 血 红 素 与 一 氧 化 碳 （CO ） 的 结 合 体P450- CO 在450 nm 处 有 特 征 性 强 吸 收 峰 而 得 名 。 它 存 在 于 肝 细 胞 内 质 网 中 ， 是一个酶系统 。可催化数
4、百种药 物的氧 化过程 。 P450酶氧化药物的过程 复合 ：药物首先与氧化型 细胞色 素P450 Fe 3+ 结合成复合物。 还原 ：P450 Fe 3+- 药物接受还原辅酶 提供的 电子 ，由辅 酶 细 胞色素 C 还原酶传递，还原成P-450 Fe 2+ 药物。 接受一分子氧 ：P450 Fe 2+ 药物中的低铁血红素能与分 子氧结 合。 再接受电子还原 ： O 2 P Fe 2+ 药物再接受两个电子，由NADPH 提供 或由还原辅酶 供给，NADH- 细胞 色素b 5 还原酶传 递，激 活分子 氧成 两个离子氧。 氧化 ：一个离子氧使药物 氧化， 另一个 与氢结 合成水 。同时 ，P4
5、50- Fe 2+ 失去一个电子，而氧化再生 成P450- Fe 3+。因此可被反复利用用而 起催化作用。 药物与P450 酶的关 系 酶的底物 （substrates ） ：由P450 酶代谢 酶的抑制剂 （inhibitors ） ：药酶活性减弱，使其他药物或 本身代谢减慢, 占代谢性相互作用的70% 酶的诱导剂 （inducers ） ：药酶活性增强，使其他药物或 本身代谢加速，占代谢性相互作用的23% 主要的P450 酶 涉 及 药 物 代 谢 的CYP 主 要 为CYP1 、CYP2 、CYP3 3 个 家 族 中7 种重要 的亚型：CYP1A2 、CYP2B6 、 CYP2C9 、
6、 CYP2C19 、CPY2D6 、 CYP2E1 和CYP3A4 常见P450 抑制剂和诱导剂 代谢稳定性评价 代 谢 稳 定 性 考 察 的 是 化 合 物 被 代 谢 的 难 易 程 度 和 体 外 清 除 率 的 大 小 ， 常用体外代谢半衰期 （T 1/2 ） 和固有清除率 （CL int ） 表示 。 一般通过定 量测定目标化合物在酶孵 育体系 中的清 除情况 来计算 。 孵育系统 每 个 孵 育 体 系 总 体 积 为 200 L ， 体 系 包 括 0.1 M 的 PBS 缓 冲 液 （pH=7.4 ）188 L ，NADPH 发生系统12 L 。 冰浴上 将1 2 L 的 药
7、 物 加入孵育体 系中 ， 在37 水浴中预 热5 min ；然 后 冰浴上加入5 L 的肝微粒体酶 ， 轻轻混匀 ，置于37 水浴 中 孵 育 ， 在0min 60min 设置5 、6 个 时间 点采 集样 品 。 待反 应完 毕之 后加 入400 L 含 内标的 冰 甲 醇 溶 液 终 止 反 应 。 实 验 中 加 入 孵 育 体 系 中 的 药 物 体 积 控 制 在1% 以 内 ， 以防止溶解药物的有 机溶剂 对肝微 粒体有 灭活作 用 。 结果计算 将 孵 育0 min 时 间 点 待测化 合 物 的 浓 度 作 为100% ， 其 他 孵 育 时 间 点 的 浓 度 转 换 为
8、百分 剩 余 量 ， 将 各 时 间 点 的 百 分 剩 余 量 的 自 然 对 数 对 孵 育 时 间 作 线 性回归 ， 求算 得斜 率k ， 根据 公 式 ，T 1/2= - 0.693/k 可 以计 算 得到体外 半衰 期 。 肝微 粒体 中的清除 率 （CL, mL min 1 mg 1 ）= 0.693 / t 1/2(min) 孵育 液 (mL) / 肝微粒体 (mg)。 代谢表型 代 谢 表 型 指 特 定 代 谢 酶 对 目 标 化 合 物 代 谢 相 对 贡 献 的 测 算 ， 以 确定 参 与药物 代谢的 主要酶 ， 为预 测个体 差异和 药物- 药物相 互作用 提供 依
9、 据 。 理 想 的 候 选 化 合 物 的 代 谢 转 化 是 由 多 种 酶 介 导 ， 并 且 不是 由 一 个 高 度 多 态 性 的 酶 介 导 。 代 谢 表 型 主 要 测 定 方 法 包 括 重 组 酶 、 选 择 性 化 学 抑 制剂 、 抗 体 抑 制 剂 三 种 方 法 ， 其 中 选 择 性 化 学 抑 制 剂 法 以 其 操 作 简 单 、 成本低等优势被广泛应用 。 代谢表型实验和结果计算 本研究的目的是利用肝微粒体体外代谢孵育体系，通过底物消除法， 测定加 入不同选择性化学抑制剂后对药物的代谢消除的影响 ，考察在肝微粒体中参 与 代谢 化合物的主要CYP450 酶
10、。 数据计算：用待测物的消除速率表示 药物 在微粒体孵育体系中的代谢速率； 抑制率(%)= （1- 加入抑制剂样品代谢速率/ 阳性对照样品代谢速率） 100%=1-（阴性对照组浓度-实验组浓度）/（阴性对照组浓度-阳性对照组 浓度） 100% 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 CYP1A2 CYP2A6 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP3A4 抑制率% 表型 代谢产物的鉴定 采用代谢稳定性一致的孵育体系 ， 通过加一定浓度的药物孵育一定时 间 ，没有加药物的孵育体系作为空白对照
11、进液质分析 ， 分析鉴定代谢 产物 。 药物对P450主要酶的抑制和诱导 酶 抑 制 和 诱 导 作 用 是 代 谢 研 究 的 关 键 ， 是 预 测 药 物- 药 物 相 互 作 用 ， 评 估 药 物 安 全 性 的 主 要 指 标 。 一 般 通 过 考 察 药物对各种酶特异性底物 的 代 谢 速 率 的 影 响 ， 得 到 抑 制 参 数IC 50 ， 预 测 目 标 化 合 物 对 酶 的 抑 制 和诱导 作用。 CYP450 亚酶的特异性底物 及反应条件 参 照 文 献 ， 选 用 的CYP450 亚 酶 的 特 异 性 底 物 及 对 应 的 代 谢 产 物 、 孵育 浓度和时
12、间如下：非那西丁- 对乙酰氨基酚 (50 M非那西丁孵育30 min ，CYP1A2 ， 脱 烷 基 反 应) ； 甲 苯 磺 丁 脲-4- 羟 基 甲 苯 磺 丁 脲 （100 M 甲苯 磺丁 脲孵育30 min ，CYP2C9 ，4- 羟基化） ； 奥美 拉 唑-5- 羟基 化 奥美拉唑 （20 mM 奥美 拉唑 孵 育20 min ，CYP2C19 ，4- 羟基化） ； 右 美沙芬- 右啡烷 （150 M 右美沙芬孵育10 min ，CYP2D6 ，O- 去甲基 ） ； 右美沙芬-N- 去甲右啡烷 （50 M 右美沙 芬孵育10 min ，CYP3A4 ，N- 去 甲基 ） ， 氯 唑
13、沙 宗-6- 羟 基 氯 唑 沙 宗 （100M ） 。 氯 唑 沙 宗 孵 育30min ， CYP2E1) 。 药物相互作用实验过程 采用与代 谢稳 定性一致 孵育 体系 ， 冰浴 上加 入1 L 的一 系 列 浓 度的 待 测 化合物 （1 、10 、100 、1000 、10000 M ） 和1 L 的 各 特 异 性 探 针 底物 （ 空 白 对 照 样 品 不 加 待测化 合 物 ， 只 加 等 量 溶 剂 ） ， 在37 水 浴中预热5 min ， 然 后冰浴 上加入5 L 的 肝微粒体 酶 ， 轻轻混匀 ，根据 不 同 的 探 针 底 物 在37 水浴 中 孵 育1030 mi
14、n ， 加入有机溶剂混匀 终 止反应 ， 每个浓度组设3 个平行样品 。 其中待测化合物浓度为0.01 、 0.1 、1 、10 、100 M 。 反应结束后 ， 采用LC-MS/MS方法测定各特异 性底物对应的代谢产物的生成量 ， 考察不同浓度的药物对各个特异性 探针底物代谢速率的影响 。 数据处理 用各模型底物的代谢物的生成量反映肝微粒体孵育体系中各CYP450 亚型酶的 活性 ； 设 定 不 加 待测化合物的代谢底物的孵育体系中各同工型酶活性为100% ， 作 为 对 照 组 ； 将 含 不 同 浓 度 抑 制 剂 时 反 应 中 代 谢 产 物 的 生 成 量 与 不 含 抑 制 剂
15、时 反 应 中 代 谢 产 物 的 生 成 量 相 比 得 出 酶 剩 余 活 性 ， 以 酶 剩 余 活 性 为 纵 坐 标 ， 抑制剂浓度 的 对数值为横 坐 标绘制抑制 曲 线 ，并用SPSS statistics17.0 软件计算 相应的半数抑制浓度(IC50 值) 。 不同种属的代谢性质评价 本 研 究 的 目 的 是 采 用 肝 微 粒 体 体 外 代 谢 孵 育 体 系 研 究 待测 化 合 物 在 人 、 beagle 犬 、 食 蟹 猴 和SD 大 鼠 肝 微 粒 体 中 的 代 谢 稳 定 性 ， 分析待测 化合 物 在 不 同 种 属 肝 微 粒 体 酶 中 的 代 谢
16、半 衰 期 和 清 除 率 ， 并进行CYP450 酶 代 谢 种 属 差 异 比 较 ， 为 后 期 临 床 前 体 内 实 验 的 动 物 选 择 提 供 依 据 。 （ 实 验 过 程 和 代 谢 稳 定 性 实 验 一 致 ， 只 是 选 用 的 肝 微 粒 体 为 几 种 不 同 种属 ） 不同种属的代谢稳定性实验 采 用 跟 前 面 代 谢 稳 定 性 一 致 的 代 谢 体 系 ， 一 致 的 实 验 过 程 ， 分 别 加 不 同 种 属 的 肝 微 粒 体 酶 孵 育 ， 通 过 不 同 种 属 中 药 物 剩 余 量 的 百 分 比 的 对 数 与 反 应 时 间 做 曲
17、线 ， 求 斜 率 ， 计 算 不 同 种 属 的 代 谢 半 衰 期 和 清 除 率 ， 比 较 不 同 动 物 种 属 的 肝 微 粒 体 的 代 谢 性 质 和 人 肝 微 粒 体 代 谢 性 质 的 接 近程度 ， 最终为 后期的 体 内药代 动力学 评价动 物选择 提供参 考 。 -1 0 1 2 3 4 5 0 10 20 30 40 剩余% （LN ） 反应时间（min ） 人 犬 猴 大鼠 小结 通 过 肝 微 粒 体 酶 完 成 上 述 实 验 我 们 能 够 大 概 预 测 一 个 化 合 物 的 半 衰 期 T 1/2 、 清除率Cl int ， 代谢药物的P450 酶 亚 型 ， 代 谢 产 物 鉴 定 以 及 共 同 用 药 的 时 候 是 否 存 在 药 物 相 互 作 用 等 ， 为 药 物 的 前期筛选 、 结构改造以 及后期的动物实验 提供参考 。 谢谢大家
