1、第 11 章 兽医生物制品制造的条件、监察制度和质量检验第一节 兽医生物制品制造的条件和要求一、制造生物制品的基本条件制造兽医生物制品必须具备以下基本条件：一定比例的专业技术人员；相应的厂房和动物舍；相应的生产设备；具有防止散毒的设施和隔离条件；具有良好的消毒和排污设施；保证水、电供应；具有稳定的合乎标准要求的菌、毒种；合格的实验动物及细菌、病毒的培养基质；经国家有关部门批准取得生产许可证。（一）机构和人员兽药生产企业应建立生产和质量管理机构，各类机构和人员职责应明确，并配备一定数量的与兽药生产相适应的具有专业知识和生产经验的管理人员和技术人员。从事生物制品制造的全体人员均应根据其生产的制品和
2、所从事的生产操作进行卫生学、微生物学等专业和安全防护培训。对从事高生物活性、强污染性及与人畜共患病有关的生产操作人员和质量检验人员，应经相应专业的技术培训。兽药生产管理部门和质量管理部门负责人均应由专职人员担任，并不得互相兼任。质量检验人员应经省级兽药监察所培训，经考核合格后持证上岗。质量检验负责人的任命和变更应报省级兽药监察所备案。生产企业主管兽药生产管理的负责人和质量管理的负责人，应具有制2药或相关专业大专以上学历，有兽药生产和质量管理工作经验。生产和质量管理负责人应具有兽医、药学等相关专业知识并有丰富的实践经验以确保在其生产、质量管理中履行其职责。（二）厂房和设施厂房建设应首先注意厂址的
3、选择，厂址应当远离闹市区。交通方便、地势高燥，有利于污水的排放与净化，具有电源和充足而质量良好的水源，而巨应当具有一定的发展余地。兽药生产企业必须有整洁的生产环境，其空气、场地、水质应符合生产要求。厂区周围不应有影响兽药产品质量的污染源；厂区的地面、路面及运输等不应对兽药生产造成污染；生产、仓储、行政、生活和辅助区的总体布局应合理，不得互相妨碍；厂房应按生产工艺流程及所要求的空气洁净度级别进行合理布局，同一厂房内以及相邻厂房之间的生产操作不得相互妨碍。此外， 兽药生产质量管理规范还规定：生物制品应按微生物类别、性质的不同分开生产。强毒菌种与弱毒菌种、生产用菌毒种与非生产用菌毒种、生产用细胞与非
4、生产用细胞、活疫苗与灭活疫苗、灭活前与灭活后、脱毒前与脱毒后其生产操作区域和贮存设备应严格分开；生产生物制品必须设置生产和检验用动物房；厂房及仓储区应有防止昆虫、鼠类及其它动物进入的设施；生物制品检验用强、弱毒操作间要分室进行。按照生产工艺和质量要求，根据洁净程度将厂区划分为三类：一生产区（辅助车间等） ，对洁净度无明确要求；控制区，要求比较清洁，菌落数（用 90mm 直径的培养皿平板培养基露置半小时，37C 培养 72h）平均 10；洁净区，如菌毒种工作间，菌落数应当平均3。在控制区和洁净区应当做到三防，即防动物、防昆虫和尽可能防灰尘。此外，还有一些重要原则性问题应予注意：生产区与行政区、生
5、活区严格分开，并互相之间问隔相当距离；处理烈性强毒的强毒区，必须单独设立，并且必须具有严密的隔离设施，绝对不得散毒；各种动物舍应与生产、研究等主体建筑分开，应设于僻静处，并有专用排污设备。（三）生产设备根据我国兽药生产企业应具备的基本条件规定，生产生物制品的企业3应有转瓶机、培养罐、过滤器、冻干机、孵化箱、压盖包装机、高压灭菌柜、烘烤箱及冷藏设备等。1无菌设备。无菌室、超净工作室或超净工作台是生物制品厂可缺少的重要设置，对生物制品厂来说，无菌室更为重要。对无菌设备总的要求是：严密，不能有缝隙；采光良好；有缓冲间；有紫外线灯，操作之前进行空气消毒；有条件的单位，应安装净化空气设备，使室内保持止压
6、，外界有菌空气不能进入。2. 空调设备。3培养设备，细菌培养装置（发酵罐，又称反应罐，由空气压缩机、空气贮存罐、滤器和反应罐组成） ；细胞培养装置（转瓶机，悬浮培养瓶） ；温室、温箱。4孵化设备（孵化箱） 。5，冻干设备（冻干机及其附属设备） 。6灭菌设备，包括于热火菌器、高压蒸气灭菌器及流通蒸气消毒器等，其中最重要的是高压蒸气灭菌器。高压灭菌器有圆形、方形、矩形，有卧式、立式、台式和手提式等多种形式，大小不一，种类繁多，生物制品厂不同于一般实验室，多半用大型卧式灭菌器。近年来，国内外己生产自动程序控制高压蒸气灭菌器。设备的性能和主要技术参数，应能保证生产和产品质量控制的要求，并定期经法定计量
7、部门校验。与设备连接的主要固定管道应标明管内物料名称、流向。设备应易于清洗、消毒，便于生产操作和维修、保养，并能防止差错和减少污染。生产设备的安装需跨越两个洁净度级别不同的区域时，应采取密封的隔断装置。生产、检验设备及器具均应制定使用、维修、清洁、保养规程，定期进行检查、清洁、保养与维修，并由专人进行管理和记录。主要生产和检验设备、仪器、衡器均应建立设备档案。（四）排污和防止散毒设施根据国家保护自然环境和自然资源，防止污染和其他公害的规定和兽医生物制品制造及检验规程的规定，生物制品的制造、检验及试验研究部门的污水必须经过无害处理后才能排放，粪便等带毒材料应就地消毒，厂体应全部化制或焚毁。41排
8、污处理设施 生物制品生 产及研究单位的污水中含有各种病原微生物及非病原微生物，必须经过工害处 理方准排放。无害 处理的方法包括： 物理法：如加热、沉淀、过滤和离心分离等；化学法：利用中和、氧化、还原、吸附或电解等化学反应以改变污染物的性质；生物法：利用微生物的作用，使 污 水的有机污染物转化为元害物质。污水的排放标准是：生化需氧量（biochemical oxygen demand， BOD），（5 天，20C）达到 60mg/L，生化需氧量越高，表示水中有机污染物越多； 化学需氧量（chemical oxygen demand，COD）：达到 100mg/L，氧化剂可用重铬酸钾或高锰酸钾，此
9、标准指重铬酸钾法；动物 检测：水中是否存在病原菌，应当用对该菌、毒敏感的 动物进行检验。2. 强毒室的防护 强毒室必须隔离，人畜不得任意出入。门窗等处设必要的防护设备，防止犬、猫、飞禽及野鼠进入。 强毒区各工作房舍 门口应设消毒池。凡有 车辆出入的，应设能使车轮全面消毒的消毒他。3带毒粪便及垫草的处理 带毒粪便及垫草等均采用生物发酵法处理，在生物发酵池中自然发酵二年以上方可作为肥料使用。4尸体处理 尸体应用焚尸炉焚烧或化制。在此情况下有的厂将尸体高压蒸气（121C 30min）灭菌后，按粪便处理办法进行生物发酵处理，亦很安全。（七）文件管理兽药生产企业应有完整的生产管理、质量管理文件和各类管理
10、制度、记录。文件管理是制药企业质量保证的重要工作内容。各类制度及记录内容应包括：1业管理、生产管理、质量管理、生产辅助部门的各项管理制度；2厂房、设施和设备的使用、维护、保养、检修等制度和记录；3物料验收、发放管理制度和记录；4生产操作、质量检验、产品销售、用户投诉等制度和记录；5环境、厂房、设备、人员、工艺等卫生管理制度和记录；6不合格品管理、物料退库和报废、紧急情况处理、三废处理等制度和记录；7兽药生产质量管理规范和专业技术培训等制度和记录。产品生产管理文件主要包括生产工艺规程、岗位操作法或标准操作规程、批生产记录等。产品质量管理文件主要包括：产品的申请和审批文件；物料、中间产品和成品质量
11、标准、企业内控标准及其检验操作规程；5产品质量稳定性考察；批检验记录，并附检验原始记录和检验报告单。兽药生产企业应建立文件的起草、修订、审查、批准、撤销、印刷和保管的管理制度，分发、使用的文件应为批准的现行文本，己撤销和过时的文件除留档备查外，不得在工作现场出现。生产管理文件和质量管理文件应符合以下要求：标题应能清楚他说明文件的性质；各类文件应有便于识别其文本、类别的系统编号和日期；文件数据的填写应真实、清晰，不得任意涂改，若确需修改，需签名和标明日期，并应使原数据仍可辨认；文件不得使用手抄件；文件制定、审查和批准的责任应明确，并有责任人签名。二、生物制品生产的申报与审批根据规定，我国新制品的
12、生产与审批需经以下步骤。（一）实验室试验菌（毒、虫）种的选育和鉴定毒力、抗原性、免疫原性、稳定性、特异性试验和生产工艺，制品的安全性、效力（对实验动物及使用对象动物） 。免疫期及保存期试验等。表 1-1 新制品实验室各项试验要求批数实验批数分类安全效力免疫期保存期第一类（我国创制，国外只有文献而未批准生产的制品） 5 5 3 3第二类（国外已批准生产，但我国尚未生产的制品）第三类（我国已生产使用，但对生产工艺有新的根本改进的制品） 3 3 3 2（二）田间试验应用 3-5 批实验室制造的新制品，对生产条件下的使用对象动物进行试验，观察其安全性和效力。表 1-2 田间试验供试动物的数量要求供试动
13、物的种类和数量生物制品类别 大动物 中小动物 禽类 鱼第一类疫苗第二、三类疫苗2001001000500100005000200010006诊断制剂 50-100 50-100 50-100注：大动物：牛、马、驴、骡、骆驼中动物：猪、羊、犬、狐，鹿小动物：兔、貂、獭（三）中间试验根据实验室生产工艺，在生物药品厂或国家认可的具备一定条件的中试车间试制 5-10 批（诊断制剂不少于 3 批）制品，定型生产工艺。（四）区域试验用工厂生产的 3 批以上中试产品在较大范围对不同品种的使用对象动物试验，进一步观察制品的安全性和效力。表 1-3 区域试验供试动物数量要求供试动物的种类和数量生物制品类别 大动
14、物 中小动物 禽类 鱼第一类疫苗第二、三类疫苗诊断制剂200010001000-200020000100001000-200040000200001000-20004000020000（五）申报新制品经过中间试验和区域试验之后，证明工艺完善，安全性和效力良好，研制单位可提出新制品制造及检验规程草案，连同有关技术资料报农业部。（六）审批审批手续包括：农业部进行预审；预审合格者，农业部组织专家进行初审；初审合格者，由兽药审评委员会进行审评；农业部进行最后批准，发给新兽药证书及批准文号。（七）新制品试生产获得新兽药证书和批准文号后，可以进行信纸品的试生产（八）正式生产试生产总结后，申请转为正式生产。
15、（九）发给正式生产批准文号经兽药评审委员会再评价后，建议列入规程，发给正式生产批准文号。7第二节兽医生物制品制造的条件、监察制度和质量检验一、 药品生产管理与质量检验标准自 1969 年世界卫生组织（WHO）宣布药品生产管理规范（ Good Manufacturing Practice，GMP） 以来，美国、日本、德国、瑞士等一百多个国家相继颁布了本国的 GMP，我国也在 1988 年公布了药品生产管理规范 。目前，GMP 已成为国际公认并遵守的药品生产管理与质量检验的基本准则。GMP 涉及的内容十分广泛，一方面要求每个药品生产厂家具有合格的硬件，即厂房、仓库、空气清洁装置、污水处理和绿地等；
16、另一方面还必须具有一系列能保证产品质量的软件，即人员素质、管理和技术等。GMP 的主要内容包括如下几个方面：1. 厂房和长区 厂址选择城镇郊外，环境幽静、空气清洁的地区。厂区绿地与建筑物地面比为 10:1.5 10:2.0。长内水泥路面，无露土地面。厂区与生活区分离，健康动物区与污染区分离，洁净区、控制区和污染区不得直接接触。水质符合卫生标准。长内照明充足，具有必要的通风、空调、净化等设备，生产工序衔接合理，人和物分流，并按生产工艺划分清洁区和清洁等级。2. 设备 所有设备应符合轻质、体积小、有惰性、耐磨损、防腐蚀和低噪音、易清洁和消毒等要求。全部设备应依工艺要求尽可能为联动操作或自动控制。3
17、. 工艺 工艺流程布局要科学、合理，工艺流程中的各种条件应予以保证。84. 实验动物 生物制品生产和检验用动物均应符合等级动物标准，至少要达到清洁级实验动物标准。生产和检验禽类生物制品的禽和卵应为SPF 标准。动物房的环境控制应符合等级动物标准。5. 人员素质 专业技术人员要按 GMP 标准进行专业训练，才能按GMP 标准生产出符合 GMP 的优质产品。二、兽医生物制品监察制度兽医生物制品是一种特殊药品，其质量优劣直接关系到对畜禽防病的有效性和安全性，也关系到人类的健康和可能给生态环境造成的影响。因此，世界各国对兽医生物制品的质量、生产、经营和使用都非常重视，不仅制订有严格的生产、检验技术法规
18、和质量标准（如药典、规程等） ，而且对制品的生产、经营和使用也进行严格的法制管理。目前包括我国在内许多国家都采用生产许可证制度，经营许可证、进口兽药的注册、登记管理制度。对于新生物制品的生产和使用，多采用根据申报资料由专家委员会审议，再经检验机构进行复核，经政府主管部门审批等制度。我国对兽医生物制品的全面管理始于 1952 年，由农业部颁布了第一部兽医生物制品制造及检验规程统一了兽医生物制品的质量标准，建立了兽医生物制品监察制度，设立了中国兽药监察所（原名为中央农业部兽医生物药品监察所，简称中监所） ，负责监督执行。当前我国兽医生物制品监察制度的主要内容包括以下几个方面。（一）兽医生物制品质量
19、管理体系国务院 1987 年发布了兽药管理条例 ，其中规定由国务院农牧行政管理机构主管全国的兽药管理工作，并对兽医生物制品的生产、质量、经营和使用施行监督。凡生产生物制品的单位必须经农业部批准，取得兽药生产许可证和当地工商行政管理机构批准发给的营业执照 。生产的各种制品还必须取得农业部或所在省、市、自治区农（牧）行政主管部门发给的批准文号 。生物制品生产企业均应设立监察室，业务由中监所领导。监察室的任务是：对成品进行检验和判定，并了解生产中执行规程情况和产品9使用情况与效果等。中监所是农业部领导下的兽医生物制品国家级的质量监督、检验、鉴定的专业技术机构，负责全国兽医生物制品质量监督，抽检制品和
20、对制品质量检验、鉴定的最终技术仲裁。负责检验用标准品、参照品和生产、检验用菌、毒、虫种的研究、制备、标定、鉴定、保管和供应。培训技术人员，开展学术交流活动等。新研制的生物制品必须经过农业部新药审评委员会审评通过后报农业部批准，才能投入批量生产。外国企业首次向我国出口生物制品，必须向农业部申请注册，并经质量复核合乎标准，取得进口兽药登记许可证，才能在我国境内出售。出口生物制品，须符合进口国的质量要求，并应报农业部批准。（二）菌毒虫种和标准品的营理用于兽医生物制品制造和检验用的菌种、毒种、虫种等均实行种子批和分级管理制度。种子分三级：原种、基础种子和生产种子。原种由研究单位和中监所负责保管；基础种
21、子由中监所或中监所委托的单位负责制备、鉴定、保管和供应；生产种子由生产企业自行制备，按各项规程的规定鉴定后使用；各级种子均应规定使用代次。各级菌（毒、虫）种的保管必须有专人负责，应分别保存于规定的条件下，有严密的登记制度，分类建立档案。寄发菌、毒、虫种和标准品时，必须装入金属筒内密封，妥善包装。一般菌、毒、虫种和标准品可以航寄，烈性传染病或人畜共患传染病的强毒茵（毒）种，必须派专职技术人员领取。非批准生产牛瘟、口蹄疫、狂犬病、猪瘟、炭疽、马鼻疽、破伤风、C 型肉毒梭菌、布鲁氏菌病、结核等产品的制造单位，需用上述强毒菌（毒）种，须经农业部批准后始可领用，并须专人领取。（三）防止散毒的原则与措施兽
22、医生物制品都是用病毒、病菌或其它病原体，有的还是用人畜共患的病原体；所以，兽医生物制品生产或研究单位防止散毒应作为监察制度的主要内容之一。防止散毒的措施包括厂内划定隔离区，建立隔离设施，制定污水的无害处理和畜粪与尸体的无害处理办法。在强毒区尤应注意勿10污染周围地区，所有进出人员及用具等都应经过一定的消毒处理。甚至对蚊、蝇、猫、狗、鼠、鸟等也要采取严格防范或消灭措施，以防止其传播某些病原体。（四）制品的贮容及运输根据兽医生物制品特性，在贮存、运输和使用方面需要特定的条件，各生产企业和使用单位必须设置相应的冷藏设备。指定专人负责，按各制品的要求严格管理，定时检查和记录贮存温度。运输生物制品应尽量
23、缩短运输时间。凡要求在 28C 贮存的灭活疫苗、诊断液及血清等，宜在同样温度下运送。若在严寒冬季运输，须采取防冻措施。凡须低温贮存的活疫苗，应按制品要求的温度进行包装运输。所有运输过程，必须严防日光曝晒。（五）新制品的管理新制品是指我国创制或首次生产用于畜禽等动物疾病预防、治疗和诊断用的生物制品。对已批准的生物制品所使用的菌（毒、虫）种和生产工艺有根本改进的，亦属于新制品管理范畴。新制品应经过实验室试验、田间试验、中间试生产及区域试验等研究过程取得完整数据。由研制单位提出新产品制造及检验试行规程草案，连同有关技术资料报农业部。预审合格后，组织有关专家进行初审。评审合格后，审评办公室将申报材料提
24、请兽药审评委员会进行审评。符合规定的，提出技术审评意见及规程草案、质量标准及使用说明书送农业部审批。农业部审查批准的新制品，发给新兽药证书 。持有此证书者，方可进行技术转让。接受转让的生产企业，经农业部审查批准后发给试生产批准文号。新制品的试产期按审批的一、二、三类制品，分别为五年、三年、二年。在试产期内，生产单位要会同原研制单位继续考核制品的质量，完善质量标准。当中监所抽样检查，发现有使用严重反应或效果不确者，向农业部报告，令其停止生产及使用。具有特殊用途的或紧急疫情防疫所需个别新产品，经农业部特别批准后，方能使用。（六）进口制品的管理随着国际交往的增加，为保证进口兽医生物制品质量，根据兽药
25、11管理条例的规定，对进口的兽医生物制品一律报农业部注册、审批。农业部将申报的品种及有关资料交中监所进行质量复核，然后交新兽药审评委员会审议，符合规定者，报农业部审批，发给进口兽药登记许可证 ，才能准许进口在我国销售。为科学研究试验或为积累临床资料进行试验而进口的生物制品可不需注册，但需报农业部批准。三、兽医生物制品的质量检验生物制品的质量检验，应从用于生产的菌种、毒种、虫种和原材料到半成品的检查，直至最终的成品检验，都属于质量检查范围，应贯穿于生产的始终，即全面质量管理（TQC） 。生物制品质量检验主要包括物理性状检验、无菌或纯粹检验、枝原体检验、鉴别检验、活菌计数或病毒含量测定、安全检验及
26、外源病原体检验、效力检验（效价或恃异检验） 、剩余水分检验、真空度测定，以及灭活剂、防腐剂的检查等。上述各项检验项目，主要是指成品检验，但有的只用于某些制品，如剩余水分检验和真空度测定，只用于冻干制品；活菌计数和病毒含量只用于弱毒活疫苗等。（一）无菌检验或纯粹检验生物制品（除另有规定者外）都不应有外源微生物污染。灭活疫苗不得含有活的本菌或本毒。因此各类生物制品必须按规定进行无菌检验或纯粹检验，全部操作应在无菌条件下进行。1. 抽样应随机取样，样品应有确切的代表性。我国兽药按灭活菌苗及血清批量在 50 万 ml 以下者每批抽样 5 瓶，50-100 万 ml 者每批抽样 10 瓶，100万 ml
27、 以上者抽样 15 瓶；同批冻干制品分几柜冻干者，应以柜为单位，每柜抽样 5 瓶；诊断液每批抽样 5 瓶。效力检验，同批菌苗分为若干组分装时应逐组随机抽样检验，抽取样品数依需要而定。2.检验用培养基厌氧性及需氧性细菌的检验用硫乙醇酸盐培养基（T.G）及酪蛋白胨12琼脂（G.A） ，霉菌及腐生菌检验用葡萄糖蛋白胨培养基（G.P） 。上述培养基均须用指定的需氧菌菌株、厌氧菌菌株及霉菌菌株做灵敏度测定，达到标准后方能使用。3. 检验方法及结果判定（1）含甲醛、苯酚、汞类等防腐剂和抗生素的制品：用 T.C 培养基50m1，接种供试品（冻于制品先做 10 倍稀释）1m1，置 361C 培养，3天后自小瓶
28、中吸取培养物，分别接种 T.C 小管和 G.A 斜面各 2 支，每支02m1，1 支置 361C， 1 支置 251C；另取 0 2m1 接种 1 支 G.P 小管，置 251C，均培养 5 天，应无菌生长。（2）细菌性活疫苗及不含防腐剂、抗生素的其它制品：将供试品（冻干制品加稀释液恢复原量）接种 T.G 小管、G.A 斜面或适于本菌生长的培养基各 2 支，每支 0.2m1，1 支置 361C，1 支置 251C。另用 1 支G.P 小管，接种 02m1，置 25-361C，均培养 6 天。细菌性活疫苗应纯粹。（3）血液制品和混浊制品：如未加防腐剂或抗生素，可直接用不加琼脂的 T.G 小管和
29、G.A 斜面，接种量、培养条件、时间和判定标准同 2 项，如加有防腐剂或抗生素，检验方法和判定同 1 项。如培养后混浊不易判定时，可移植培养后再判定。（4）判定结果：每批抽检的样品（除允许含一定数量非病原者外）应全部无菌或纯粹生长。如发现个别瓶有杂菌或结果可疑时，可重检原瓶（如为安瓶或冻干制品，可重抽样品） ，如无菌或无杂菌生长，可作无菌或纯粹通过。如仍有杂菌，可抽取加倍数量的样品重检，个别瓶仍有杂菌，则作为污染杂菌处理。4. 杂菌计数及其病原性鉴定（1）杂菌计数：每批污染制品至少抽样 3 瓶，用肉汤或蛋白胨水分别作 50 倍稀释，接种于含 4血清及 0.1血红素的马丁琼脂（或 G.A）平板上
30、，每个样品接种平板 2 个，置 361C 培养 48 小时后，再移置室温24 小时，数杂菌菌落数（CFU） ，然后分别计算杂菌数。任何 1 瓶每克被检样品（或每头剂）的非病原菌数不应超过该规程的规定。如污染霉菌时，亦作为杂菌计算。13（2）病原性鉴定：A. 检查需氧性细菌：将污染需氧性杂菌管培养物移植 1 支 T.G 管或马丁汤，置同条件下培养 24 小时，取培养物用蛋白胨水稀释 100 倍，接种体重 18-20g 的健康小鼠 3 只，每只皮下注射 0.2m1，观察 10 天。B. 检查厌氧性细菌：将生长有杂菌管延长培养至 96 小时，取出置65C 水浴加温 30 min 后移植 T.G 管或
31、厌气肉肝汤 1 支，在同样条件下培养 24-72 小时。如有细菌生长，将培养物接种体重 350-450g 的豚鼠之只，每只肌肉注射 1m1，观察 10 天。C. 如发现制品同时污染需氧性及厌氧性细菌，则按上述要求同时注射小鼠及豚鼠。D. 判定：小鼠、豚鼠均应健活。如有死亡或局部化脓坏死，证明有病原菌时，该批制品应废弃。5. 禽沙门氏菌的检验凡用普通鸡胚生产的各种弱毒疫苗，将被检物用划线法接种麦康凯平板或 S.S 琼脂平板，经 37C 培养 18-24 小时后，挑选无色半透明、边缘整齐、表面光滑并稍突起的菌落 2-3 个，分别接种于三糖铁培养基。先在该培养基上层斜面涂布，再穿刺至底部。经 37C
32、 培养 24 小时后，如培养基下层变黄，斜面为淡红色时，应进一步用多价沙门氏因子血清作玻片凝集试验，如为阳性即证明为沙门氏菌污染。除此之外，有些生物制品在需要的情况下，还要进行枝原体检验和衣原体检验。（二）安全检验生物制品的安全性是其首要的条件，各种制品都必须经过安全检验合格者方可出厂。1安全检验的内容（1）检验外源性污染：上述无菌与纯粹试验也应包括在内，这不仅是因为有致病性细菌的污染，而且即使是非病原菌，如数量过多，其代谢产物也会影响安全。另外，外源性的病毒及枝原体的污染亦是影响安全的重要方面。14特别是活疫苗在采用细胞培养时，可通过培养病毒的组织细胞带来外来的病毒，如猪瘟兔化弱毒疫苗采用猪
33、肾细胞培养时，有可能带入野外猪瘟强毒。细胞培养多用犊牛血清，犊牛血清就可能带入牛腹泻病毒，如使用马血清又可能带入马传贫病毒，使用鸡胚则可能带入鸡白血病等病毒。而且除原材料以外，生产环境不佳及操作不严密，亦可能造成外源性污染。生产全过程各个环节，均须重视防止污染。（2）检查杀菌、灭菌或脱毒情况：灭活疫苗都是以致病微生物加入甲醛或其它灭活剂灭活，而类毒素则是加入甲醛将毒素脱毒。但如灭活不彻底或脱毒不完全，都影响制品的安全性。（3）检查残余毒力或毒性物质：这主要是对活疫苗而言。所谓残余毒力是指生产这类制品的菌（毒）种，本身是活的减毒株或弱毒株，允许有轻微毒力的存在，能在接种的机体内表现出来。这种残余
34、毒力的大小，按制品的不同而有不同的指标要求，测定和制定方法也不一致。如无毒炭疽芽孢苗菌种的毒力标准是允许实验动物（小鼠、家兔、豚鼠）在注射部位引起剧烈水肿，但家兔不能死亡，豚鼠可死亡 1/2，而小鼠可全部死亡。又如羊痘鸡胚化弱毒疫苗，安全试验的标准是试验羊2/3 可发生不全经过型痘种，接种局部皮肤的表面应出现 0.5-4cm 微红色或无色的丘疹（痘肿） ，持续 10 天左右，有的还有体温反应，但不应有其它异常现象。毒性检查主要是对死菌苗或类毒素这类制品，这类制品虽经杀菌或脱毒，仅具有抗原性，但其本身的某些成分，当接种一定量时，可引起对机体的有害反应，即毒性反应。这种毒性反应可存在于某些污染革兰
35、氏阴性菌的制品中，即有时也会产生热原性的类毒素。在冻干活菌疫苗中有的也出现毒性反应，如仔猪副伤寒活疫苗，冻于后的存活率过低会出现内毒素反应，有时引起死亡，在这种情况下采用口服免疫可以避免。（4）检查对胚胎的毒性：有的病毒致弱毒株虽对免疫动物已经致弱，但还能通过孕畜影响胚胎。如国外猪瘟的某些弱毒株，就可通过孕猪的胎盘屏障传给胚胎以致造成死胎、胎儿畸形或生后发育不良等。因此欧洲药典中明确规定猪瘟病毒应经过对胚胎毒性的检查。其检查方法是：选 10 头未免疫的母猪在怀15孕 25-35 天时肌肉注射两头剂的疫苗，同时另选 10 头未免疫的同龄同源怀孕母猪注射等量生理盐水，然后观察疫苗对胎儿或仔猪是否有
36、影响。2安全检验的方法及要点成品的安检方法主要是动物检验。安检剂量应大于使用剂量。但凡能以小动物作出正确判断者，则多用实验小动物，这主要是材料易得，费用较低。禽苗则可直接以使用对象动物作安检。但无论使用何种动物，其首要条件是选用敏感的动物。安检动物要求一定的品种，譬如猪丹毒以鸽和小鼠比较敏感；而猪肺疫则以家兔比较敏感。但同一种动物不同品系其敏感性也下一样，如鸡新城疫的安检鸡，用我国土种鸡就不如用来航鸡敏感。又如不同日龄的小鼠对猪丹毒的敏感性也下一致，日龄过大则敏感性差。到底哪种日龄动物最适宜，各种动物不一样。一般概念敏感动物是不含母源抗体的，如以猪检查猪瘟疫苗的安全性，就必须检查供试猪是否含有
37、母源猪瘟抗体，无母源抗体者方可使用。除了动物的敏感性外，动物的健康状况也与安检结果的正确判断密切相关。试验期间的饲养管理也会影响安检结果的判断，安检动物舍应与健康动物和其它试验动物分开，以免相互干扰，即必须在专用动物舍内进行。在安检期间，如安检动物有死亡时，必须及时解剖明确原因，在整个安检期内应及时观察动物的健康情况，并予以记录。3安全检验的判断（1）安检期死亡的动物经解剖明确非制品所致者可以重检，如检验结果可疑难以判定时，应以加倍头数的该种动物重检。（2）凡规定用多种动物进行安检的制品，如牛瘟兔化绵羊化活疫苗用小鼠和豚鼠两种动物检验，两种均应安全合格。（3）用小动物检验不合格者，有的规定可用
38、使用对象动物重检。但用使用对象动物检验不合格者，不能再以小动物重检。4外源病毒检验（1）用于鸡的活疫苗：取样品 2-3 瓶混合（如是细胞苗，须用超声波或 3 次冻融方法破坏细胞） ，用相应含专一特异性抗体的血清中和后作为检品。用鸡作检验用动物，被检样品不做处理。如对检验样品中病毒中16和不完全，可用高效价血清重做，或用制品使用对象进行检验。A. 鸡胚检查法：用 9-11 日龄 SPF 鸡胚 20 个，分为 2 组，每胚各以10 个使用剂量接种，第一组 10 个胚接种于尿囊腔内；第二组 10 个胚接种于绒毛尿翼膜上，在 37C 培养，弃去在接种后 24 小时内死亡的胚，但每组胚须存活 6 个以上
39、，试验方可成立。7 天后剖检，胎儿应发育正常，绒毛尿囊膜无病变。取鸡胚液做凝集试验，应无血凝价。用来自对脑脊髓炎（AE）易感鸡群的 1-7 日龄鸡胚 15 只，每胚卵黄囊内接种 0.2m1，继续孵化直至孵出雏鸡。对雏鸡观察 15 天，不应出现运动失调，或呈现 AE 组织病理变化的死亡，并至少有 9 只胚孵出小鸡，试验才成立。用鸡胚检查无结果或可疑时，可用鸡检 1 次。B. 检查禽白血病病毒: 用 COFAL 试验。用对禽白血病病毒易感的SPF 9-11 日龄鸡胚，制成鸡胚成纤维细胞单层，将用特异性血清中和过的疫苗（至少含 50 个使用剂量）接种于成纤维细胞单层上，维持培养不少于 14 天，在此
40、期间每隔 3-4 天细胞继代 1 次，培养结束时，做 COFAL试验检查细胞中应无鸡白血病病毒。C. 鸡检查法：用适于接种本疫苗日龄的 SPF 鸡 20 只，点眼、滴鼻接种 10 个使用剂量，肌肉注射 100 个使用剂量，接种后 21 天，按上述方法重复接种 1 次，第一次接种后 42 天采血，进行有关疫病的血清抗体检验。在 42 天内，不应有疫苗引起的局部或全身症状和呼吸道症状或死亡。如有死亡，应做病理学检验，查明是否由于疫苗所致。血清抗体检验，除本疫苗所产生的特异性抗体外，不应有其它疫苗的抗体存在。（2）非禽源细胞的活疫苗：A. 荧光抗体检查法：对细胞制品检验，将 3 瓶样品混合，经 3
41、次冻融后，接种细胞单层培养 4 天，传第 2 代，取第 2 代培养物，分别进行丙酮固定后，以适宜的荧光抗体进行染色。猪细胞应检查：牛病毒性腹泻病病毒（BVDV） 、伪狂大病毒（PRV） 、狂犬病病毒（RV） 、猪细小病毒（PPV） 、猪瘟病毒（HCV） 。牛羊细胞应检查：BVDV、RV、PRV、PPV、BTV（蓝舌病病毒） 。 马细胞应检查，马传染性贫血病病毒。犬细胞应检查：RV、PRV、PPV、BVDV。17确定被检对象后，取片进行染色与镜检。若被检血出现任何一种特异荧光，为不合格；若阳性对照组不出现特异荧光或不明显为无结果，可以重检。若被检组出现不明显荧光，必须重检，重检仍出现不明显荧光，
42、为不合格。B. 绿猴肾（Vero）传代细胞检查法：疫苗用相应特异性血清中和后，用 Vero 细胞 3 个单层，总面积不少于 100 cm2，每个单层接检品 1m1，连传 2 代，每代 7 天，应不出现细胞病变，并无红细胞吸附因子存在及荧光抗体检查无特异荧光。（3）用细胞单层生产的病毒性活疫苗：检测外源病毒时，亦可采用致细胞病变和（或）红细胞吸附试验。先用相应的特异性血清中和后，接种敏感的细胞单层进行培养。A. 致细胞病变的检测：取经传代后培养至少 7 天的细胞单层（每个cm2）1 个或多个，用适宜染色液，对细胞单层进行染色，观察细胞单层，检查包涵体、巨细胞的数目异常或其它由外源病毒引起的细胞病
43、变的出现情况。B. 红细胞吸附病毒的检测：取经传代后培养至少 7 天的细胞单层（每个 cm2）1 个或多个，以 PBS 洗涤细胞单层数次，加入 02红细胞悬液适量，以覆盖整个单层表面为准。红细胞悬液应是洗涤过的豚鼠红细胞、人“0”型红细胞、鸡红细胞的等量混合悬液，可在加入前混合，亦可分别滴加于不同的细胞单层上。4C 放置 30min，用 PBS 洗涤，检查红细胞吸附情况。若无明显的红细胞吸附现象可重复 1 次，在细胞单层加入红细胞悬液后置 20-25C 培养 30 min，用 PBS 洗涤，再次检查红细胞吸附情况。也可用 2 个细胞单层分别在 4C 和 20-25C 培养。C. 若出现外源病毒
44、所致的特异性细胞病变或红细胞吸附现象，判不合格；若疑有外源病毒污染，但又不能通过其它试验排除这种可能性，则作不合格处理。（三）效力检验制品的效力是指它的使用价值。效力不好的制品，如为疫苗和类毒素，则无法有效地控制疫情；如为治疗用的血清，则无法医治病畜，从而使疫18病蔓延；如为诊断制品，则影响检疫及诊断的正确性。1效力检验的内容（1）免疫原性：首先是菌（毒）种的免疫原性应良好，制备生物制品的茵（毒）种的免疫原性，应经过周密的试验测定。如制猪丹毒灭活疫苗的菌种应选择 2 型菌，因为 2 型菌株免疫原性良好，试验证明对其它菌型也有免疫力。又如流感与口蹄疫，因其在流行中病原常有型的变化，所以用以制备疫
45、苗毒株的型必须与流行型相对应。否则即使是制品的免疫原性良好，也收不到免疫效果。（2）制品的免疫持续期：这也应在选育菌（毒）种时测定，但不同制品其免疫持续期各异。理想的制品应具有较长的免疫持续期，免疫持续过短的应考虑增加免疫接种的次数。（3）抗原的热稳定性：一般灭活苗和血清的热稳定性较好，弱毒疫苗较差，但也随制品的种类而异，如牛痘苗的热稳定性就很好。但制品的热稳定性也与制品中所加入的冻干稳定剂的种类或制备工艺有关。（4）抗原量的测定：活的疫苗的效力取决于接种动物的毒量，即一定量病毒（细菌）才能在体内增殖到一定程度，促使机体产生免疫应答，若数量不够，则达不到免疫效果。所以常以测定抗原量来检查制品的
46、效力，当然实验室的检定指标应和使用效果一致。灭活苗也同样要求一定抗原量才有效。所以应测定制品的最小免疫量。制品中的抗原量并非愈多愈好，应求其适当有效量，规定上限和下限，过多还会出现副作用，如鸡痘鹌鹑化弱毒疫苗对 6 日龄以下雏鸡刺种反应大，而改用稀释一倍后刺种 1 针则安全有效。2成品的效力检验（1）动物保护力试验：这是兽用生物制品最常用的检验方法。所用动物依制品而异，但使用的敏感小动物应与使用的对象动物有平行关系者，禽用疫苗一般均使用对象动物作检验，当小动物检验如遇有某种原因难以判断者，可以改用制品使用对象动物检验。但使用对象动物检验不合格者不能再用小动物重检。有的制品没有相应的小动物，就只
47、能用使用对象动物检验，如抗猪瘟血清与羊痘活疫苗只能用猪和羊效检。动物保护试验的方法虽有许多种，但凡需攻毒者，均应设立同品种、同来源19的同批动物作对照组，并必须在特设的隔离强毒动物舍内进行。A. 定量强毒攻击法：这种方法是以待检品接种动物，经 2-3 周后，用相应的强毒攻击。观察动物接种后所建立的自动免疫抗感染水平，即以动物的存活或不受感染的情况来判定制品的效力。如猪丹毒活疫苗的效检，用小鼠 10 只，每只注射 0.02 个使用剂量的猪丹毒活疫苗，14 天以后连同未接种的小鼠 3 只攻击 1000 个小鼠致死量的强毒，另 3 只攻 1 个 MLD。观察 10 干，免疫组存活 8 只以上，攻10
48、00MLD 对照组全死、攻 1 个 MLD 对照小鼠至少死亡 2 只为合格。如以猪检验则用易感猪 10 头，其中 5 头接种疫苗，每头注射 1m1 活疫苗，14 天后连同对照组 5 头，每头攻击致死量的强毒，免疫猪保护 4 头以上，对照猪全部发病，并有 2 头以上死亡，疫苗为效力合格。B. 定量免疫变量攻击法：这种方法是把动物分为两大组，一为免疫组，一为对照组，两大组又各分为相等的若干小组，每小组的动物数相等。免疫动物均用同一剂量的制品接种免疫，经一定时间后，与对照组同时用不同稀释倍数强毒攻击，比较免疫组与对照组的存活率。按 LD50计算，如对照组攻 10-5稀释毒有 50%的动物死亡，而免疫
49、组攻 10-3稀释毒死 50%，即免疫组对强毒的耐受力比对照组高 100 倍，亦即免疫组有 100 个 LD50的保护力。在兽用生物制品中狂犬病灭活疫苗的效力即按此法检验。C. 变量免疫定量攻击法：即将疫苗稀释为各种不同的免疫剂量并以之接种动物，间隔一定时间待动物的免疫力建立以后，各免疫组均用同一剂量的强毒攻击，观察一定时间，用统计学方法计算能使 50%的动物得到保护的免疫剂量。如鸡新城疫油乳剂灭活苗即用此法进行效力检验。具体的检验方法是：用 3-4 周龄易感鸡 35 只，以 1/25、1/50、1/100 稀释的疫苗 0.5ml 剂量，各皮下或肌肉注射 10 只鸡，另 5 只不接种作对照，3-4周后，每只鸡肌肉注射 10-5ELD50 的强毒，观察 14 天，记录每组的死亡数，对照应全部死亡，最后算出 50%的保护剂量，以 PD50表示。每一使用剂量（0.5ml）的效价应不低于 50 个 PD50。在国外如英国的口蹄疫疫苗与猪瘟活疫苗也用这种方法检验，前者应不小于 6 个 PD50，后者应不小于100 个 PD5
