1、受体的放射配基结合分析,什么是受体,受体(receptor)都是有特定氨基酸序列和特定构型的蛋白质。每一种受体在细胞上都有特定的宏观和微观分布。它接受细胞外的特定信号(神经递质、激素、某些药物和毒物等)，通过受体后特定的信号传递系统，引起细胞的特定反应，因此是高等动物适应环境、协调整体各种细胞功能的关键性分子。,受体与配基结合的基本特征,可饱和性 (saturability) 每种受体在一个细胞上的量有一定限度，所以如果不断增加细胞周围配基的浓度，结合到细胞上的配基将渐趋饱和。特异性 (specificity)和高亲和力(high Affinity) 一种受体只和一定结构的配基发生特异性结合反
2、应，这种结合的特点是：亲和力高而结合容量少。配基和受体结合的特异性还具有立体特异性。可逆性(reversibility) 受体与配基结合反应的可逆性是保证细胞随时适应内外环境变化的重要特征。 识别能力(recognition)和效应的一致性 受体对配基的特异结合保证了受体对机体内成千上万种生物活性物质的高度识别能力。这种识别能力必定和配基引起的生理(药理)效应相匹配。主要表现在两个方面。一是组织分布上的匹配：亦即受体在不同组织和细胞中的分布和相应配基在引起生理或药理效应方面的组织和细胞特异性有高度一致性；二是浓度上的匹配，亦即配基引起生理或药理效应的有效浓度和配基与受体结合的有效浓度有高度一致
3、性,受体与配基结合反应的基本原理-简单单位点系统的基本规律,简单单位点系统 对某种受体系统而言，它的全部受体都以相同的亲和性以单分子与特定的配基相结合(分子比为1：1)，而且不表现明显的正负协同作用。如果一个受体系统存在两（多）种亚型，但所用配基无选择性，尽管亚型的生物效应可能不全相同；结合反应却表现出完全相同的特征，这时，也可作为单位点系统来看待。,简单单位点系统质量作用定律,受体和配基的结合反应服从质量作用定律，对简单单位点系统 ： K1，V1 R + L RL K2，V2,饱和曲线,RL和LT并非线性关系，而是曲线关系，这就是饱和曲线。曲线的高度主要反映受体的数量多少，曲线上升的快慢则主
4、要反映受体和配基的亲和力(亲和力越高，上升越快)。,非特异结合(non-specific binding，NSB),NSB主要来自杂蛋白，反应器壁，分离材料的吸附，它的特点是，容量很大，而亲和力低，因此在一般情况下不被饱和 。做NSB时，所需的非标记配基，其浓度最好通过实验来选定。如果浓度不够，NSB的抑制不完全，而如果浓度过高，也会使空余的非特异结合位点被占领，使NSB出现被抑制过多的假象,配基受体结合常数Kd的计算-Scatchard作图(Scatchard plot),KDRTRLLRL 重排，得到Scatchard函数 。当RT和KD固定时， RLL和RL是线性关系 ，直线斜率的倒数就
5、是KD。这是简单单位点系统的一个重要特征。 Scatchard作图在下列情况下不呈直线：双位点或多位点系统，亦即受体有两种以上亲和力；受体有正协同(positive Cooperativi-ty)或负协同(negative Cooperativity)现象；非特异结合的测定所用非标记配基浓度不对,正负协同作用,是指当一部分受体与配基结合后使相邻的受体的亲和力发生改变，倘若亲和力逐步下降，称之为负协同作用，亲和力逐步增大，称之为正协同作用。 在Scatchard作图时前者曲线斜乎变小，后者曲线斜率变大。,协同作用的判断-Hill作图法(Hill plot),可进一步判别协同作用的性质。其原理如下
6、：倘若一个受体可以和n个配基结合，并且KD值相同，那么按质量作用定律：KDRTRLLnRL，或RLRTRLLnKD，两边取对数：,以Lg（RL/RTRL）为纵坐标，LgL为横坐标作图，为一直线，这就是Hill作图。直线的斜率为n，称Hill系数；简单单位点系统不应有正负协同作用，n=1。对每一受体结合两个或三个配基的系统，n=2或n=3如果n1但又明显小于2，则往往是由于正协同作用。,受体与配基反应的动力学(kinetics),受体与配基的结合反应一般都较快(多数在数十秒至数十分钟)达到平衡。当周围的游离配基急剧下降，或非标记配基浓度急剧升高时，放射性复合物的解离也很快，这种快速结合和快速解离
7、对保证受体的迅速反应有很重要的意义。结合反应： 解离反应：,竞争性取代反应(competitive displacement reaction),在一个受体和放射配基的反应系统中加入另一个化合物，它若能和受体的配基结合位点结合，则会与放射配基竞争与受体结合，最终将表现为放射配基与受体形成复合物的能力降低(亲和力降低)，但受体数量不变所以叫竞争性取代反应，此时，非标记的起竞争作用的配基称为竞争剂(competitive agent)，它可以是激动剂(agonist)，也可以是拮抗剂(antagonist)，它们和受体结合后不改变受体分子的结构。,另有一类通常称为阻断剂(blocking agen
8、t)的物质，它们也能与受体结合，但结合后会引起受体分子不可恢复的结构改变，导致受体功能丧失。当受体与放射配基的结合系统中加入此类物质，就有部分受体被破坏，使受体数量减少，未被破坏的受体则仍单独与放射配基和受体结合。这类反应叫非竞争性阻断(irreversible blocking)。 以上两类反应有时统称为抑制结合反应。它们的区别可从Scatchard作图上明显看出,表示竞争剂抑制作用强弱的指标有二个：IC50值和KI。IC50值是指抑制50受体与放射配基结合所需竞争剂的浓度，IC50值大，表明竞争剂抑制作用小。KI则是指竞争剂的平衡解离常数，KI越小，表明竞争剂抑制作用越大。求上述两个参数的
9、实验也有两类：一类是：固定RT和LT，向系统中加不同量的竞争剂，求得竞争取代曲线。另一类是固定RT和IT(竞争剂浓度)，不断改变L，分析IT存在时的影响。,受体放射分析的基本方法,放射性配基的要求制备优良的放射性配基是受体结合试验的首要条件。对任何一种受体系统，通常都有好几种标记配基可供选择。选择应从两方面考虑：配基的特性；实验目的,对放射性配基的基本要求,比活度高亲和力高 特异性强 稳定性好 标记的稳定性、贮藏时的稳定性以及温育分析时之稳定性,实验目的,主要针对具体研究目标来选择。例如有的受体有几种亚型，如果实验的意图是放射性配基要结合所有这几个亚型，即可选择无亚型选择的配基。相反，想研究其
10、中某一个亚型，则应选择针对该亚型的高亲和力配基。在具体设计某种受体的放射性结合分析时，一般是选标记拮抗剂作为放射性配基，例如皮质激素受体的分析常选用氚标记地塞米松，它是皮质激素的拮抗剂。然而生理激动剂却能更准确反映受体的生物学意义。,用作受体放射分析的放射性配基多用3H、125I标记。氚标记配基与原型配基为同型式，生物学活性好，多数情况下比活度也能达到要求，且半衰期长，使用方便，主要缺点是需用液闪测量，操作较麻烦，一般实验室不能进行标记。多肽及蛋白质配基多用125I标记，其优点是可以达到较高的比活度。只要很好掌握标记条件(单碘标记物)，仍能保持较好的生物活性。另外，碘标记法快速、方便、经济，一
11、般实验室可进行。测量操作简单，所以125I配基也大量采用。,需要注意的是自行标记125I配基要解决两个难题：要确定标记物的比活度，如果比活度不确切，最后所得的受体结合位点数不确切。标记配基的纯化：多肽的碘标化合物往往产生一碘(monoiodinated)和二碘(diiodinated)标记物。这些标记物对受体的亲和力有可能是不同的。,125I配基比活度的校正,当产物的放射性丰度为80，比活度为:0.80(0.80+0.2) 8.0481014Bqmmol = 6.4381014Bq(1740Ci)mmol。60天后，其放射性标记配基变为原来的一半，而非放射性配基则或者不变，或者增加(由放射性部
12、分转化而来)。放射性丰度变为：0.8e0.693(6060)=0.40，如果属于前一种情况，比活度变为：0.40(0.40+0.20)8.0481014Bqmmol = 5.3651014Bq(1462Ci)mmol。如果属于后一种情况，则比活度变为：0.40(0.40+0.20+0.40) 8.048 1014Bqmmol=3.219 1014Bq(870Ci)mmol。,放射性配基的质量鉴定,1放射化学纯度 放射性配基的放射化学纯度对受体结合率及分析灵敏度均有较大影响。除新鲜产品外存放一定时间后的标记配基均应重测其放化纯度，以保证分析的准确性。一般要求放化纯度应在95以上。,2，结合活性鉴
13、定 受体结合分析中，放射性配基的活性特别重要，特别是生物活性。目前，测定配基的活性主要是指与受体的结合能力。即测定其最大结合活性：以定量标记配基加逐级增加至过量的受体制剂(饱和结合实验)进行反应，测定结合百分率；以结合百分率的倒数对受体浓度的倒数作图，获得一条直线；延长直线与纵座标的交点，即可算出该标记配基结合活性。,3比活度 受体结合分析最后的结果计算时离不开准确的比活度数据。必要时也可用放射受体自身置换法测定比活度。,受体标本的制备,在受体结合实验的研究中，所用的受体材料可以是组织切片，也可以是完整的单层培养细胞或游离活细胞，粗制的或纯化的细胞膜受体，可溶性的受体蛋白等。 (一)组织切片冷
14、冻组织切片常用明胶粘贴于玻片上，在温育缓冲液中与标记配基进行反应。反应后用缓冲液洗几次即可，切片厚度一般为550m。用组织切片的目的更多是研究受体的分布(用放射自显影法或免疫组化法)。,(二)游离的完整细胞悬液 完整细胞来源分三种：从组织分离出游离细胞；血细胞；培养细胞。使用完整细胞的优点： 1、受体处于原有的正常环境中。受体与其相连的效应系统(如C蛋白)也保存完好。2、在受体功能反应完全的情况下研究受体，可以同时观察配基与受体结合的情况和细胞的生物效应。所得的结果更能反映受体的生理特点。3、能直接给出平均每一个细胞的受体数。使用完整细胞的缺点：1、较难控制分析条件，操作可能导致细胞表面生理活
15、性的改变，结果有时不够稳定。2、细胞上某种受体的含量低时，需加人大量细胞才能获得足够的放射性计数，给实际工作带来一定困难。3、完整细胞的膜受体在37时会产生受体入内化现象(internalization)，导致测定结果不准确，常需要在较低温度下温育。,(三)膜制剂(membranous preparation)绝大多数受体结合分析使用膜制剂。1、使用膜制剂可以减少非特异性结合率。2、在膜制备过程中，通过洗膜的方法，可以将内源性配基洗去，并除去部分蛋白溶解酶。3、膜制剂通常也保存有受体效应器(包括GTP结合蛋白等)结合系统。但受体功能的其他方面则失去了，膜内离子浓度梯度、受体与细胞结构关系也失去
16、了。但是，受体结合需要的是膜双层脂质结构本身，所以膜碎片内仍保留受体的药理学特性。,细胞膜和细胞浆受体的制备一般采用蔗糖密度梯度离心法。操作流程如下：,为保证所制得的膜受体保持良好的结合活性，需注意：全部过程在04下进行操作。制备缓冲液的蔗糖密度，离子强度，pH值及其它物质(如EDTA，Mg2+ )应严格控制。组织匀浆条件应保持一致：一般先用高速分散器，后改用玻璃匀浆器将细胞破裂。匀浆的时间、速度、温度应尽量一致。离心的时间、速度、温度应保持恒定。为防止膜受体蛋白被蛋白酶水解常加蛋白酶抑制剂。 膜制剂于70可保存数月之久。,三、结合反应的类型,(一)标记配基饱和法(radioligand sa
17、turation method)：它又分为单点饱和及多点饱和法。 1单点饱和法(single point saturation method)：定量受体制剂加大量的标记配基使受体得以饱和结合。根据受体配基复合物的放射性计算受体结合容量(或结合位点数)。这种方法操作简便、标本用量少。但只凭单点实验数据计算受体结合容量，比多点法的结果略低，不能给出KD，误差也较大。2多点饱和法(multipoint saturation method)：定量的受体制剂，逐步增加标记配基的量(一般78个实验点)，使受体的结合趋于饱和。用曲线拟合法或直线拟合法计算受结合容量和亲和力(RT、KD)，结果可靠性高。但受体
18、标本、标记配基用量大，工作量大。如果实验中，受体存在两种亚型，而所选的放射配基对两种亚型又有一定选择性，则得到双位点饱和曲线，用双位点饱和曲线的数学模型可得到两种亚型的RT和KD。,(二)非标记配基饱和法 一定量的受体制剂和标记配基，逐渐增加非标记配基(一般7-8个实验点)，使受体饱和结合，曲线拟合法或直线拟合法计算受体结合容量和亲和力。这种方法克服了多点饱和法标记配基用量大的缺点，但由于非标记配基的用量逐渐加大，放射性逐步减少，必需标记配基比活度较高才能得到满意结果。(三)反应速率常数的测定反应系统中加入定量标记配基及定量受体制剂。于反应开始后不同时间测定特异性结合配基量，可以计算出结合速率
19、常数(k1)。在反应达到平衡后，用大量非标记配基阻断标记配基的结合，发生标记配基单方向的解离，于不同时间测定残存的放射性复合物，可以计算出解离速率常数(k2)。,(四)竞争取代反应 反应系统含定量标记配基、定量受体制剂及逐渐增加的竞争抑制剂。主要目的是测定抑制50结合的抑制剂浓度(IC50)及抑制剂与受体结合的亲和力(平衡解离常数K1)。在受体研究领域，这类试验是研究受体与配基结构功能关系的重要方法。在药物研究领域，则可用来研究药物作用机理、进行药物筛选、发现新药等。 如果所用的标本中受体有两种亚型，实验目的是要区分两种亚型，则必需选无选择性的放射配基和有选择性的竞争剂，此时得到的是双位点竞争
20、取代曲线(dualsite competitive displacement curve)，通过计算机拟合可求得两种亚型的RT、KI及IC50。,四、分析条件的选择,(一)标记配基浓度：单点饱和试验要求饱和量的标记配基。对于多点饱和试验，应尽可能覆盖饱和区及非饱和区，理论上0.110KD；实践中应考虑最低一点有足够的放射性满足放射性测量统计上的要求。对于动态试验及竞争结合实验；标记配基浓度一般不能太高，但要满足LT RT的要求，否则结合反应的假一级速率函数不能成立。KI和IC50的关系也不能成立。(二)受体浓度：在线性范围内，较高受体浓度，有时可增加特异性结合与非特异性结合的比值。在实践中，不
21、同受体的密度差别很大，往往需要通过实验来确定标本浓度。(三)温育温度与时间：最佳温育温度要经过试验选定。饱和或竞争取代试验温育时间应足够长以达到平衡状态。测试最佳温育时间时，应用低浓度的放射性配基。温育温度与平衡时间紧密相关， 一般室温操作比较方便(22)，但有人认为使用生理温度37更好；活细胞的膜受体存在入内化，0温育结果的重复性更好。(四)缓冲液：缓冲液应不干扰结合，并在较大范围内可稳定pH。 结合分析的pH应处于生理范围。钠、镁等离子、蛋白酶抑制剂和非特异结合蛋白要根据具体目的决定选用与否。,五、结合与游离配基的分离,选择适当的分离方法和环境，使受体配基复合物在分离过程中的解离减少到最低
22、限度。低温是降低解离的最有效手段，分离快慢也是重要因素。 常用的分离方法有离心法、过滤法、吸附法、透析法、电泳法等。若复合物解离快，则只能选择快速的分离方法。同时一定要在分离时间，分离温度等方面保持各样品管之间的一致性，以减少误差。,第四节 受体放射分析的数据处理,受体放射分析的数据处理包括两个方面，一是正确的单位换算，二是各种手工或计算机的数据拟合。一、单点饱和分析法的单位换算设测得复合物的放射性是2000cpm，则除以测量效率成为dpm(除以60成为Bq)，再除以标记配基的比活度(绝大多数受体以1：1关系与配基结合)就成为该标本中的受体量，设测量效率是0.3，标记配基的比活度是1.8510
23、12Bqmmol，则标本中的受体量为：受体量,如果该标本的受体密度欲以每毫克蛋白计算，则60fmol除以实测蛋白的毫克数即可。如果欲以每一细胞所含受体数表示，则fmol应进一步换算成受体数。因为每mmol物质所含分子数是常数(6.021020或近似61020)，所以：标本所含受体分子数标本mmol数61020本例为60fmol，故所含受体分子数：60101261020360108若该标本的细胞数是7.5106，于是可算得受体密度：(360l08)(7.5106)4800细胞,二、多点饱和分析法的计算,主要的直线回归数学模型有：Scatchard函数、Woolf函数、LineweaverBurk
24、函数及Hill函数。 Woolf函数：KDRTRLLRL，KD=RTL RTL，重排即成为：,以L为横坐标，LRL为纵坐标作图，为一条斜率正的直线，横截距为KD，斜率为1RT。Woolf函数拟合结果，所得RT。和KD误差往往较Seatehard函数稍小。,LineweaverBurk函数：将Woolf函数两边都除以L，即得：,以1L为横坐标，1RL为纵坐标作图，横截距为1KD，纵截距为1RT。由于纵截距是1RT，而很多实验RT是固定的，所以LineweaverBurk函数常被用来比较RT相同时KD的差异。,应用实例：家兔子宫内膜细胞(M-60细胞)EGF受体KD值与RT值测定。,M-60子宫内
25、膜单层细胞贴壁长满，经雌二醇处理后，用Hanks液洗两次，每次置37保温15分钟。去除内源性EGF。每孔 M-60约为3.0105细胞左右，每孔加入125I-EGF由2.5 104至2.5x105cpm，相应的NSB孔加入200ngEGF。4保温24小时，以冰冷50mmoLL，pH=7.4的PBS终止反应，用双层玻璃纤维滤(预先用含0.1BSA的PBS饱和吸附)多头细胞收集器收集125I-EGF-受体复合物，大约用10mlPBS冲洗。计数器测量，得下表实验值：,计算公式：,L=LT-RL (pmol/L) (1)Scatchard方程：以RL为x，BF为y直线回归，得回归方程：y=a+bx a
26、=0.0465 b=-0.02144 r=0.9598 KD=1b=466(pmolL)， RT=ab=21.68(pmolL)=21.6810-126.0210230.511031(3.0105) =21.76103结合位点数细胞,(2)Woolf方程：L为x，FB为y，直线回归，得回归方程：求y=a+bx a=20.692， b=0.0426，r=0.9494 KD=ab=485(pmol/L)， RT=1b=23.44(pmolL) =23.4410-126.021023X0.5X11031(3.0105) =23.53103结合位点数细胞,第五节 受体的调节及受体与疾病,受体的调节是指
27、某种细胞上的某种受体由于某种因素而发生变化。变化可以是受体数量(密度)的增加或减少，也可是对配基亲和力的升高或降低。调节作用是受体本身和特异性配基发生结合反应的结果，通常称为同系调节(homologous regulation)，由其他受体甚至与受体无关的因素引起的调节，通常称为异系调节(heterologous regulation)。有些调节的生理意义比较明确，主要是使机体能更好地适应内外环境的变化，但是如果调节过度，则会引起病理性的后果。还有很多调节作用，目前对其意义还不清楚。常见的受体调节现象有：,1、受体数量的异系调节 甲状腺激素同时促进肾上腺素受体的合成和降解，前者占优势，受体密度
28、升高；糖皮质激素促进肾上腺素受体的合成，导致受体密度升高；糖皮质激素促进肝细胞合成胰岛素受体，使受体密度增加 。2、受体数量的同系调节 (1)短期作用 结合反应形成的配基与膜受体的复合物可以转移到膜内，称为受体内移。一般认为是先在膜上形成小凹，再形成小囊而通过胞吞现象进入细胞质。随后复合物解离，受体分子或降解而失活，或再度插入细胞膜重新成为有活性的膜受体 。,(2)长期作用 细胞长期或反复与配基接触可以导致受体合成或降解速率的改变。一般是激动剂使受体密度降低，拮抗剂则可能使受体密度升高。M胆碱受体激动剂和胆碱酯酶抑制剂(使乙酰胆碱增多)使M受体密度降低，拮抗剂如阿托品等则使M受体密度升高；肾上
29、腺素受体激动剂早期促进肾上腺素受体的转录而使受体密度升高，后期促进受体mRNA的降解而使受体密度下调。 3、受体的化学修饰或构型变化引起亲和力的变化 (1)受体亲和力的提高或降低 受体分子可以磷酸化。有的受体磷酸化后亲和力提高，如促性腺激素释放因子受体。有的受体磷酸化后亲和力降低，如表皮生长因子受体。变构现象也可导致亲和力的改变。例如，表皮生长因子受体可形成二聚体，二聚体的亲和力比单体高。,(2)负协同现象 有时一种受体(不是两种以上亚型的混合物)和配基结合的结果，表现出两种亲和力，Scatchard作图呈现一条向上凹的曲线。最初认为这是由于部分受体与配基结合后影响尚未与配基结合的受体，引起其
30、构型变化而导致亲和力降低，所以称之为负协同。后来的研究表明，负协同可能还有其他机制。 4、受体的化学修饰或构型变化引起受体数量的变化 在某些情况下，可以发现测得的受体密度突然很快增多，这可能和隐匿受体被活化有关。隐匿受体是指原已存在但不能被测到的受体。一般认为这是由于部分受体分子存在于胞膜内侧，不能和膜外亲脂性配基结合。促使这部分受体分子向膜表面移动的因素有：受体分子磷酸化(如促性腺激素释放因子受体、孕激素受体)；受体分子部分裂解(如胰岛素受体)；受体分子部分去糖基(如促性腺激素受体)等。,5各种因素引起受体亲和力或密度的改变可导致细胞对特异配基的反应增高和或降低，通常分别称为增敏(hyper
31、sensitization)和失敏(desensitization)。有时只发生受体密度的变化，也常分别称为上调(upregulation)和下调(downregulation)。,受体与疾病,受体和疾病的关系范围很广 ：1遗传性基因突变引起的受体异常 主要表现为细胞产生的受体与内源性配基的亲和力发生变化，大多数情况是亲和力降低往往需要通过放射配基结合实验才能发现，检测结果可能包括部分正常和部分异常的受体。分子生物学手段可具体分析突变情况。受体后信息传递机制的突变所引起的后果近年来受到广泛重视。,2受体抗体引起的疾病 受体是机体本身的蛋白质，一般情况下机体不会产生针对受体的抗体。在某些病理情况
32、下，机体持续地对某一受体蛋白产生特异性抗体，并且在细胞膜上发生“原位(in situ)”的抗原抗体结合反应，导致受体功能异常。 相关疾病有：Graves病 （甲状腺功能亢进）、重症肌无力(myastheniagravis) 、肢端肥大症(acromagaly) 、自发性粘液性水肿(idiopathic myxoedema) 等。有自身抗体的受体还有促胃液素受体、肾上腺素受体、胰岛素受体等，恶性贫血、哮喘、罕见型耐胰岛素糖尿病的发病原因可能也与受体抗体有关。,3受体的变化是某些重要疾病的重要中间环节 (1)“溢出性”结合 内源性配基对受体的特异性有一定相对性，对同源性较高的其他受体也有一定亲和力。疾病时某种激素含量大幅度升高有时可使这种同源性较高的受体也被激动，从而使临床表现更为复杂化,(2)受体的变化是某些重要疑难疾病的重要中间环节 有时表现为一对作用相反的受体朝相反方向变化，形成受体间的失平衡。治疗上，针对受体的药物往往有较好的特异性，成为开发新药的重要方向。例如，甲状腺功能亢进时，肾上腺素受体密度上升 ，M胆碱受体密度下降，可引起心动过速、心律失常等。用心得安等肾上腺素受体拮抗剂常能减轻这方面的症状，预防严重并发症的出现。 4受体和甾体激素依赖性肿瘤的关系 5受体与癌基因的关系,
