1、 ICS 65.040.10P 35备案号：黑龙江省地方标准DB23DB23/猪应激综合症的 PCR 检测方法（2015.4.20）2015-发布 2015-实施黑 龙 江 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB23I前 言本标准依据GB/T 1.1-2002的起草规则编写。本标准由黑龙江省畜牧兽医局提出。本标准起草单位：黑龙江省农业科学院畜牧研究所。 本标准主要起草人：刘娣、张冬杰、王文涛、彭福刚、何鑫淼。DB231猪应激综合症的 PCR 检测方法1 范围本标准规定了猪应激综合症PCR 检测的术语、定义、缩略语、检测方法以及结果判定。本标准适用于生猪应激综合症的检测。2 规范性引用文件下
2、列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB /T 6682 分析实验室用水规格和实验方法3 术语、定义和缩略语下列术语和定义适用于本标准。3.1 猪应激综合症也称恶性高热综合征，指在非特异性的应激因子（如运输、转栏、高温、预防注射、配种等）作用下，猪发生呼吸急促、心跳亢进、体温升高、肌肉僵直、后肢呈现痉挛性收缩，并伴随突然死亡的一种征候群。是一种应激反应，而不是一种独立的疾病。其主要遗传学病因是由于氟烷基因的存在。3.2 PCR polymerase chain reactio
3、n，聚合酶链式反应3.3 DNA deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸3.4 dNTP deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核苷酸三磷酸3.5 bp base pair，碱基对4 方法提要以耳组织样提取的核酸，作为DNA模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，与标准分子量标记比较，来确定扩增产物的大小。5 试剂和材料除另有规定，所用试剂均为分析纯，去离子水为符合GB/T6682的标准水。5.1 PCR反应混合物：10PCR缓冲液，2.5 mmol/L dNTP、上下游引物，rTaq酶，模板DNA，去离子水。引物序列如下，F：5-T
4、GACCCCTAGGTGCTGGAT-3，R：5-GGAGGGTTCTAAGCTCTGGG-3。5.2 rTaq DNA聚合酶（5U/L）。DB2325.3 琼脂糖：电泳级。5.4 溴化乙锭、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇、酚。5.5 分子量标记：DL 2000标准分子量标记物。5.6 组织提取液：3 mol/L氯化钠，1 mol/L三羟甲基氨基甲烷（pH 8.0） ，20 mol/L EDTA（pH 8.0） ，高压灭菌。室温保存，使用时20倍稀释。5.7 凝胶加样缓冲液：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青、40%（W/V）蔗糖水溶液。5.8 TE 缓冲液：10 mmol/L 三羟甲基氨基
5、甲烷(pH 8.0)，1 mmol/L 乙二胺四乙酸(pH 8.0)。5.9 电泳缓冲液：242 g 三羟甲基氨基甲烷溶于800 mL水中，加入100 mL的0.5 mol/L 乙二胺四乙酸(pH 8.0)和57.1 mL冰醋酸，定容至1000 mL，高压灭菌，贮存于室温。使用时50倍稀释。6 仪器和设备6.1 离心机。6.2 DNA热循环仪。6.3 核酸电泳仪。6.4 pH计。6.5 移液器：2 L，10 L，20 L，100 L，1000 L。6.6 紫外线透射仪或凝胶成像系统。6.7 恒温水浴锅。7 操作步骤7.1 样品处理和基因组DNA的提取取10 mg组织样，加入500 L组织提取液
6、和5 L蛋白酶K，55 ，120 r/min的摇床上消化810 h。消化结束后，加入500 L三羟甲基氨基甲烷饱和酚上下晃动均匀10 min。12000 r/min离心10 min，取上层水相，弃下层。加入等体积酚:氯仿:异戊醇（24:23:1）混合液，混合10 min，12000 r/min离心10 min，取上层水相，弃下层。加入等体积氯仿:异戊醇（23:1）混合液，混合10 min；12000 r/min离心10 min，取上层水相，弃下层。加入与上层水相相比，2倍体积的无水冰乙醇（20 ） ，水平摇匀大约30次，出现白色絮状物（DNA）后，用枪头挑出白色絮状物，加入700 L 70 %
7、冰乙醇，8000 r/min离心5 min，倒掉乙醇，自然干燥，加3050 L的TE缓冲液，室温溶解35 h。20 保存备用。注： 使用等效的DNA提取试剂盒提取DNA模板也可。7.2 PCR扩增按照25 L PCR反应体系的比例混合各组分：上、下游引物各1 L（浓度为10 M） ，Buffer（10）2.5 L，dNTP（10 mM/L）2 L，rTaq酶 0.2 L，去离子水17.3 L，2000 r/min离心10 s后，分装，每只EP管分装24 L混合液，预留一支空白，设为阴性对照，其余的分别加入待DB233检个体的DNA模板（浓度为50 ng/L）。PCR扩增条件为：95 预变性5
8、min，94 30 s，58 30 s，72 30 s，30个循环，72 延伸10 min，4 保存。7.3 PCR扩增产物电泳检测取1.0 g琼脂糖，于100 mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取5 L PCR扩增产物和1 L上样缓冲液混合，混合充分后加样，进行电泳。电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在3 V/cm 5 V/cm，电泳时间为30 min 35 min。将电泳好的凝胶放入终浓度为0.5 g/mL的溴化乙锭染色缓冲液中染色15 min 20 min，在紫外线透射仪或凝胶成像系统上观察结果，并做好实验记录。7.4 PCR-RFL
9、P检测PCR-RFLP反应体系：10 L PCR扩增产物，10 U HhaI内切酶，2.5 L内切酶缓冲液，去离子水补至20 L。PCR-RFLP反应条件：37 ，12 h。电泳检测：酶切结束后，1000 r/min离心10 s，4 %琼脂糖凝胶电泳检测，具体操作同7.3。8 结果及判断8.1 实验结果成立条件阴性对照的PCR产物电泳后无条带，而检测个体的 PCR产物电泳后出现一条 186 bp的特异性条带。8.2 结果判断在实验结果成立的前提下，如果样品的PCR 产物在酶切电泳后出现一条186 bp条带的，记为nn型，为阳性个体。在实验结果成立的前提下，如果样品的PCR 产物在酶切电泳后出现126 bp和60 bp两条带的，记为NN型，为阴性个体。在实验结果成立的前提下，如果样品的PCR 产物在酶切电泳后出现186 bp、126 bp和60 bp三条带的，记为Nn型，为阳性个体。
