1、ICS 65.020.30B 41DB 23黑 龙 江 省 地 方 标 准DB 23/ T XXXX XXXX鱼类传染性胰腺坏死诊断技术操作规程（报批稿）XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施黑 龙 江 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB23/ T XXXXXXXXI前 言本标准依据GB/T 1.1-2009 的编写规则起草。本标准由黑龙江省农业委员会提出。本标准由黑龙江省农业标准技术委员会归口。本标准起草单位：东北农业大学。本标准主要起草人：刘敏、姜艳平、唐丽杰、崔文、管雪婷。DB23/ T XXXXXXXX1鱼类传染性胰腺坏死诊断技术操作规程1 范围
2、本标准规定了危害鱼类的传染性胰腺坏死病（IPNV)的临床症状检查、PCR检测方法及结果的综合判定。本标准适用于鱼类传染性胰腺坏死病的诊断。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范3 术语和定义下列术语
3、和定义适用于本标准。3.1 传染性胰腺坏死病（infectious pancreatic necrosis）：由传染性胰腺坏死病毒感染鱼类，以肝脏、肾脏和胰脏贫血及坏死为主要临床症状的急性传染病。4 试剂和材料4.1 水：应符合 GB/T 6682-2008 中一级水，用于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）时要用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理，除去核糖核酸（RNA）酶。4.2 IPNV 参考株：由具有保存毒株资质的实验室提供。4.3 无水乙醇：分析纯。4.4 蛋白酶 K：20 mg/mL。4.5 脱氧核糖核酸（DNA）分子量标准：DL2000。4.6 溴化乙锭(EB)：10 mg/mL。4.7
4、 琼脂糖：电泳级。DB23/ T XXXXXXXX24.8 脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）：10 mmol/L，含三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP）、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）各10 mmol/L 的混合物，-20 保存。4.9 Taq DNA 聚合酶：5 U/L，-20 保存。4.10 PCR 缓冲液：10 倍，-20 保存。4.11 TBE 电泳缓冲液：5 倍,配方见附录 A。4.12 上样缓冲液：6 倍。4.13 引物：所选取的基因为 IPNV 的 VP2 基因片段，F1 和 R1 扩增该基因中的 1095
5、bp 片段，而 Jd2u和 Jd2l 扩增该基因中的 273bp 片段，用无菌去离子水配置成 10 mol/L，-20 保存；基因序列如下：F1 5-GGATCCAGAGCGACACATCTTAAAACAAGAGAC-3R1 5-CTCGAGTTCGGGGTCGTACTTGCCATAG-3Jd2u 5-GGATCCTGGAGAGCCTGACCTACAAT-3Jd2l 5-CTCGAGAGCGGTGAGGGTTCCTGTC-34.14 磷酸盐缓冲液（PBS）：0.01 M。5 仪器设备5.1 医用镊子、医用解剖刀、医用剪刀。5.2 一次性注射器：1 mL。5.3 台式高速离心机：转速 12000
6、 rpm 以上。5.4 冰箱：具有冷藏箱、- 18 以 下 冷 冻 箱 体 。5.5 微量移液器和枪头：量程 0.1L2.5 L、1L10 L、2L20 L、20L200 L、100L1000 L。5.6 微量离心管：1.5 mL。5.7 PCR 仪。5.8 核酸电泳仪和水平电泳槽：输出直流电压 0 V600 V。5.9 凝胶成像仪。5.10 水浴锅或者金属浴仪。5.11 微 波 炉 。5.12 PC R 管 ： 0.2 mL。5.13 涡旋振荡器。5.14 超净台。DB23/ T XXXXXXXX35.15 组织匀浆器或研钵。6 采样采样数量按SC/T 7103规定执行。体长4cm的鱼苗取整
7、条，若是带卵黄囊的鱼应去掉卵黄囊；体长4 6cm的鱼苗取内脏（包括肾）；体长大于6cm的鱼则取肝、肾、脾组织；成熟雌鱼还需取卵巢液；鱼卵则取卵壳。7 诊断方法7.1 临床诊断患病鱼体色变黑，眼球突出，腹部膨大，有腹水，肛门常带有一条线状粘液便，常发生离群翻滚、旋转，片刻后再次发作，直至死亡，病鱼胸腹部呈紫红色，鳍基及腹中线有明显出血点，病鱼常停于水底两侧。解剖病鱼可见其胰腺充血及有坏死灶，肝、脾、肾苍白贫血肿大，消化道通常无食物，有乳白色或淡黄色粘液，呈卡他性肠炎。肠道内粘液物在 510福尔马林溶液中不凝固，胃肠粘膜脱落，幽门出现下垂、出血或坏死，生殖腺和内脏脂肪组织有明显出血点。临床如有上述
8、典型症状，可以初步诊断，通过 RT-PCR 检测病原进一步确诊。7.2 PCR 检测7.2.1 样品处理取 50mg100 mg 以内的组织。先加入 150LTrizol 溶液，用组织研磨器将样品匀浆成糊状，放人 1.5 mL 的离心管中，再将 Trizol 溶液补加至 900 L。25 C 作用 2. 5 h。7.2.2 RNA 提取下列方法任选其一，在提取RNA时，应设立阳性和阴性对照样品，按同样的方法提取RNA。RNA提取操作应在超净台条件下进行。7.2.2.1 TRIZOL 法 取 7.2.1 处理后的样品，4 12000 rpm 离心 5 min，取 600L 上清作为待提取样品，加
9、入氯仿 600L，振荡混匀后，室温放置 30min，4 12000 rpm 离心 10 min，取上层溶液，加入等体积的异丙醇，混匀，-20放置 2h 以上或过夜，4 12000 rpm 离心 10min，去上清，缓缓加入75 %乙醇 1 mL 洗涤，4 12000 rpm 离心 5 min，去上清，室温干燥 20 min。7.2.2.2 选择市售商品化RNA提取试剂盒，进行RNA的提取.7.2.3 反转录合成 cDNA(reverse transeription)向上述 EP 管中加入 DEPC 水 20L，下游引物 R1 2L。65水浴 10 min。冰浴 5 min，离心 12 s，依次
10、加入：5反转录缓冲液 8.0LdNTP（各 2.5mM） 4.0LRNA 酶抑制剂（40U/L） 1.0LM-MLV 反转录酶（200U） 1.0LDB23/ T XXXXXXXX4DEPC 水 4.0L42水浴 1.5h4h 后，于 70水浴 10 min，冰浴 5 min。获得合成 cDNA 作为模板进行 PCR 反应，或于-20保存。7.2.4 PCR 反应体系的准备PCR 反应体系中使用引物 F1 和 R1，模板为合成 cDNA，PCR 体系如下：反转录产物(cDNA) 3.0L10Taq DNA 聚合酶反应缓冲液 2.5L10 mM dNTPs 2.0L上游引物 F1 1.0L下游引
11、物 R1 1.0LTaq DNA 聚合酶 0.5L灭菌去离子水 15.0 L总体积 25.0 L7.2.5 PCR 操作在超净台内按比例分别加入上述 PCR 试剂混匀后分装，对每份样品用单独的枪头定量吸取待测模板，待测模板除样品 cDNA 外同时设阳性对照和以无菌双蒸水为模板的空白对照，分别将各模板溶液加到分装后的 PCR 反应预混物中，加完样品后，PCR 管在离心机上离心 12 s，放入 PCR 仪中，按照反应条件运行。反应条件为：95预变性 5min 后进入 PCR 循环，94变性 1min，54退火 1min，72延伸 1min，30 个循环，最后 72延伸 10min。7.2.6 PC
12、R 产物的分析7.2.6.1 琼脂糖凝胶的制作在电泳区用 0.5TBE 电泳缓冲液配制 1.0%的琼脂糖凝胶，于锥形瓶中配制，在微波炉中加热至溶液完全透明(胶液体积应少于容器体积的 1/4)。待溶液冷却至 60 左右，加入 10 mg/mL 溴化乙锭(EB) (有毒)至终浓度 0.5 g/mL，摇匀。将凝胶液缓缓倒入设置好样孔梳的凝胶槽中，胶液厚度 0.6 cm0.8 cm。样孔梳底部水平深入凝胶层约 0.3 cm0.5 cm，并距凝胶底部 0.2 cm，以免穿透。待凝胶完全凝固后，小心拔掉样孔梳。7.2.6.2 电泳将制备好的琼脂糖凝胶连同凝胶槽一起装入水平电泳槽，加样孔应在负极一侧，加入
13、0.5TBE 电泳缓冲液至没过胶面约 1mm2 mm 的深度。将 5 L PCR 产物与 2 L 6上样缓冲液混匀后加入到加样孔中。同时至少一个泳道加入 5 L DL2000 DNA 分子量标准液。在 90V120V 条件下电泳，当上样缓冲液中的溴酚蓝指示剂色带迁移至琼脂糖凝胶底部时停止电泳，将凝胶置于凝胶成像仪上观察。7.2.7 套式 PCRDB23/ T XXXXXXXX5如果 PCR 后产物电泳时没有看到特异性 DNA 条带，则应直接以 PCR 产物做模板；如果电泳时能看到特异性 DNA 条带，则应将产物按（1:100）（1:1000）稀释后，取 5L 做模板。 引物改用 Jd2u和 J
14、d21，反应体系同 7.2.4。反应条件为：95预变性 5min 后进入 PCR 循环，94变性 40sec，58退火 40sec，72延伸 40sec，30 个循环，最后 72延伸 10min。PCR 产物的分析同 7.2.6。7.2.8 后处理按照 PCR 实验室的相关操作规程进行处理。7.2.9 结果判定待检样品经第一次 PCR 后阳性对照会在 1095bp 处有一条特定的条带出现（见图 1） ，空白对照没有该条带；套式 PCR 后在 273bp 处会有一条特定条带出现(见图 2)，空白对照没有该条带。或者经第一次 PCR 扩增看不到可见的 DNA 带，但套式 PCR 扩增后能在相应的
15、273 bp 处有带者，以上两种情况均可判定为阳性。两次 PCR 扩增均无带者判定为阴性；或者仅第一次 PCR 扩增后有 1095 bp 的 DNA 带，但套式 PCR扩增重复 2 次后仍不能扩增出 273 bp 的 DNA 条带的样品也判为阴性。如果扩增出的 DNA 带的大小不是 1095bp 与 273 bp 则也应判为阴性。如果带的大小和阳性片段接近难以确定，则应测序，根据是否和已知 DNA 片段（参见附录 B）的序列吻合来判定。阳性结果表明被检测样品中存在传染性胰腺坏死病毒的 RNA。图 2 套式 PCR 阳性结果1. DNA Marker DL2000；2、3. VP2 （273bp
16、 ）RT-PCR 结果；4. 水对照；图 1 第一次 PCR 阳性结果1. DNA Marker DL2000；2.VP2（1095bp ） RT-PCR 结果；3 水对照；DB23/ T XXXXXXXX6A A附 录 A（规范性附录）试剂及其配制A.1 TBE电泳缓冲液（5 倍浓缩液）Tris 54g硼酸 27.5 gEDTA 2.922 g4水 1000 mL 用 5 moL/L 的 HCl 调到 pH 8.0。A.2 样品缓冲液每 100 mL 水溶液中含：溴酚兰 0.25g，蔗糖 40gA.3 Taq酶用 10 倍浓缩缓冲液Tris-HCl 500 mmoL/L pH 8.8,KCl
17、 500 mmoL/LTritonX-100 1%A.4 样品缓冲液每 100 mL 水溶液中含：溴酚兰 0.25g，蔗糖 40gA.5 EB用水配制成每10mg/mL的浓缩液。用时每10mL电泳液或琼脂中加1L。A.6 PBS液Nacl 8gKCl 0.2gNa2HPO4 1.42KH2PO4 0.27gH2O 1000mlDB23/ T XXXXXXXX7B B附 录 B（资料性附录）基因序列B.1 IPNV VP2（1500bp）基因序列如下：ATGAACACAAACAAGGCAACCGCAACTTACTTAAAATCCATTATGCTTCCAGAGACTGGACCAGCAAGCATCC
18、CGGACGACATAACGGAGAGACACATCTTAAAACAAGAGACCTCGTCATACAACTTAGAGGTCTCCGAATCAGGAAGTGGCATTCTTGTTTGTTTCCCTGGGGCACCAGGCTCACGGATCGGTGCACACTACAGATGGAATGCGAACCAGACGGGGCTGGAGTTCGACCAGTGGCTGGAGACGTCGCAGGACCTGAAGAAAGCCTTCAACTACGGGAGGCTGATCTCAAGGAAATACGACATTCAAAGCTCCACACTACCGGCCGGTCTCTATGCTCTGAACGGGACGCTCAACGCTGCCA
19、CCTTTGAAGGCAGTCTGTCTGAGGTGGAGAGCCTGACCTACAATAGCCTGATGTCCCTAACTACGAACCCCCAGGACAAAGCCAACAACCAGCTGGTGACCAAAGGAGTCACCGTCCTGAATCTACCAACAGGGTTCGACAAACCATACGTCCGCCTAGAGGACGAGACACCCCAGGGTCTCCAGTCAATGAACGGGGCCAGGATGAGGTGCACAGCTGCAATTGCACCACGGAGGTACGAGATCGACCTCCCATCCCAAAGCCTACCCCCCGTTcCTGCGACAGGAACCCTCACCGCTC
20、TCTACGAGGGAAACGCCGACATCGTCAACTCCACAATAGTGACGGGAGACATAAACTTCAGTCTGGCAGAACAACCCGCAAACGAGACCAGGTTCGACTTCCAGCTGGACTTCATGGGCCTTGACAATGACGTCCCAGTGGTCACAGTGGTCAGCTCCGTGCTGGCCACAAACGACAACTACAGAGGAGTCTCAGCCAAGATGACCCAGTCCATCCCGACCGAGAACATTACCAAGCCGATCACCAGGGTCAAGCTGTCATACAAGATCAACCAGCAGACAGCAATCGGCAATGTCGCCA
21、CCCTGGGCACAATGGGTCCAGCATCCGTCTCCTTTTCATCGGGGAACGGAAATGTCCCCGGCGTGCTCAGACCAATCACACTGGTGGCATATGAGAAGATGACACCGCTGTCCATCCTGACCGTAGCTGGAGTGTCCAACTACGAGCTGATCCCAAACCCAGAACTCCTCAAGAACATGGTGACACGCTATGGCAAGTACGACCCCGAAGGTCTCAACTATGCCAAGATGATCCTGTCCCACAGGGAAGAGCTGGACATCAGGACAGTGTGGAGGACAGAGGAGTACAAGGAGAGGACCAGAGTCTTCAACGAAATCACAGACTTCTCCAGTGACCTGCCCACGTCAAAGGCATGGGGCTGGAGAGACATAGTCAGAGGAATTCGGAAAGTCGCAGCTCCTGTACTGTCAACGCTGTTTCCAATGGCAGCACCACTCATAGGAACGGCAGACCAATTCATTGGAGATCTCACCAAGACCAACTCAGCAATCTCTAGAGGATCCCCGGGtACCGAGCTCGAAtTC注：带下划线为引物序列。_
