1、ICS 65.20.01b05DB 23黑 龙 江 省 地 方 标 准DB 23/ XXXXX2017玉米品种（单交种）纯度检测 SSR 方法（报批稿）XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施黑 龙 江 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB23/ XXXXX2017I前 言本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由黑龙江省农业委员会提出。本标准由黑龙江省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所。本标准主要起草人：关海涛、张瑞英、温洪涛、李宛、孙丽容、马永华、扈光辉、王明泉。DB23/ XXXXX2
2、0171玉米品种（单交种）纯度检测 SSR 方法1 范围本标准规定了玉米品种（单交种）纯度SSR分子标记检测方法的术语和定义、原理、仪器设备、试剂、实验方法、检测步骤及结果计算。本标准适用于玉米品种（单交种）纯度检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样GB/T 3543.5 农作物种子检验规程 真实性和品种纯度鉴定GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文
3、件3.1 品种纯度 品种在特征特性方面典型一致的程度。用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。本标准的品种纯度表示种子在SSR分子标记带型方面典型一致的程度，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子粒数的百分率表示。3.2 聚合酶链式反应(PCR)一种在体外通过酶促反应扩增特异DNA片段的技术。3.3 简单重复序列(SSR)由几个核苷酸（1-6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个碱基的串联重复DNA序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。3.4 分子标记 DB23/ XXXXX20172以蛋白质、核酸分子的多态性为基础，检测生物在遗传上
4、的差异。4 原理简单重复序列（SSR）分布于玉米整个基因组的不同位置上，不同品种每个位点上重复单位的数目不同形成了品种间的多态性。由于每个简单重复序列两端的序列是高度保守的序列，因而根据其两端的序列设计一对特异引物，利用PCR技术对重复序列进行扩增，扩增产物通过电泳进行分离，经银染，可辨别SSR电泳谱带。通过选用在亲本中具有共显性带型的SSR引物，根据PCR扩增产物电泳谱带差异，鉴定玉米品种纯度。5 仪器设备主要仪器设备包括：a) 测序电泳槽；b) 高压电泳仪（3000 V，400 mA，400 W）；c) 电子天平（感应为 0.01 g）；d) 微量加样器；e) 磁力搅拌器；f) 台式离心机
5、（最大离心力不小于 15 000 g）；g) 紫外-可见成像系统。h) 胶片观察灯。i) 水平摇床。j) 高压灭菌锅。k) pH 计。6 试剂实验用水为重蒸馏水或符合GB/T 6682-2008规定的三级水等。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂。a) 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na 2）；b) 三羟甲基氨基甲烷（Tris）；c) 盐酸（HCl，36%）；d) 氯化钠（NaCl）；e) 氢氧化钠（NaOH）；f) 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）；g) 氯仿：异戊醇=24：1（V：V）；h) 硼酸；去离子甲胺；i) 溴酚蓝；j) 二甲苯青；k) 甲叉双丙烯酰胺；l) 丙烯酰胺；m) 尿素；n
6、) 亲和硅烷；DB23/ XXXXX20173o) 剥离硅烷；p) 无水乙醇；q) 四基乙二胺（TEMED）；r) 过硫酸铵；s) 冰醋酸；t) 硝酸银；u) 甲醛溶液（37%）；v) Taq DNA 聚合酶（含 Mg2+的 10CR 缓冲液）；w) 四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）；x) SSR 引物（附录 A）。7 实验方法7.1 溶液配制a) 10 mol/L 氢氧化钠（NaOH）溶液：取 NaOH 80 g，160 mL 蒸馏水溶解后，加水定容至 200 mL。b) 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）：取 EDTA-Na2 186.1 g，加入 100 mL 蒸馏水，再加入适量
7、 10 mol/L NaOH 溶液，加热至完全溶解后，冷却至室温，用 10 mol/L 氢氧化钠溶液调 pH 值至 8.0，加水定容至 1000 mL，高压灭菌。c) 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）：取三羟甲基氨基甲烷(Tris) 60.55 g 溶于适量蒸馏水中，用盐酸(HCl)调 pH 至 8.0，加水定容至 500 mL，高压灭菌。 d) 5 mol/L 氯化钠（NaCl）：称取 NaCl 29.20 g，溶解于 90 mL 水中，加热到 80溶解，冷却，再用双蒸水定容 100 mL，高压灭菌 20 min。e) TE 缓冲液（pH 8.0）：取 1mol/L Tris
8、-HCl（pH 8.0） 5 mL，0.5mol/L EDTA（pH 8.0）1 mL，加蒸馏水定容至 500 mL，高压灭菌。f) 碱煮法 DNA 提取液：取 NaOH 2 g，先用 200 mL 蒸馏水溶解，再加水定容至 500 mL，高压灭菌。g) CTAB 法 DNA 提取液：取 CTAB 2 g，加 1 mol/L Tris-HC1(pH 8.0)10 mL，加 0.5 mo1/L EDTA(pH8.0) 4 mL，加 5 mol/L NaCl 28 mL 并定容到 100 mL，高压灭菌 20 min，终浓度为 1%的-巯基乙醇现用现加。h) 引物稀释：按照引物合成单的说明先配制
9、100 umol/L 的储存液，取适量储存液稀释 40 倍，配制浓度为 2.5 mmol/L 的使用液。i) 6变性上样缓冲液：去离子甲酰胺 49 mL，0.5 mol/L 的 EDTA 溶液（pH 8.0）1 mL，溴酚蓝0.125 g，二甲苯青 0.125 g。j) 10电泳缓冲液：Tris 108 g，硼酸 55 g，0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）溶液 37 mL，加水定容至1000 mL。k) 亲和硅烷：20 uL 亲和硅烷，20 uL 冰醋酸，加无水乙醇至 2 mL。现用现配。l) 6%变性丙烯酰胺凝胶：尿素 420.5 g，10电泳缓冲液 100 mL，丙烯酰胺 57
10、 g，甲叉双丙烯酰胺3 g，加水定容至 1000 mL。DB23/ XXXXX20174m) 10%过硫酸铵：0.1 g 过硫酸铵溶于 1 mL 水中。现用现配。n) 固定液：200 mL 冰醋酸，定容至 2000 mL。o) 染色液：4 g 硝酸银，定容至 2000 mL。p) 显影液： 40 g 氢氧化钠和 10 mL 甲醛加入 2000 mL 蒸馏水中。7.2 DNA 提取碱煮法剥取种胚，分别放入96孔深孔板中。每孔加入400 L DNA提取液，煮沸 5 min 后，加入200 L Tris-HCl溶液，煮沸30s。在每孔中加入400 L TE 缓冲液，冷却至室温，形成样品 DNA 溶液
11、。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA，用紫外-可见成像系统观察DNA电泳条带的完整性。样品 DNA 溶液可以直接进行 PCR 扩增或在-20冰箱中冷冻长期保存。7.2.2 CTAB 法取单株幼苗籽粒或子叶0.1 g，在液氮中研碎，放入1.5 mL离心管中。将DNA提取液预热到65，每管加入700 L，将离心管置于65金属浴或水浴锅中，保温 30 min后取下，向离心管中加入700 L 24:1氯仿异戊醇（V:V），振荡混匀。10 000 g离心10 min。将上清液500 L转入另一支1.5 mL离心管，加入1000 L -20预冷无水乙醇沉淀DNA。10 000 g离心1 min，弃上清液
12、，加入500 L70%乙醇溶液，10 000 g离心5 min收集沉淀。加入100 L TE（pH 8.0）溶液溶解DNA，检测DNA浓度。-20保存。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA，用紫外-可见成像系统观察DNA电泳条带的完整性。7.3 PCR 扩增7.3.1 反应体系总体积20 L，包括11.8 L水、2.0 L含Mg 2+的10PCR缓冲液、2.0 L dNTPs（2.5 mmol/L）、2.0 L SSR引物（10 mol/L）、0.2 L Taq DNA聚合酶（ 5 U/L）、2.0 L DNA（30-50 ng/L），混匀。也可使用商用试剂盒。7.3.2 反应程序94预变性5
13、 min、94变性30 s，60退火45 s，72 延伸45 s，循环35次、72延伸5 min、4条件下保存。退火温度可根据不同PCR仪器自行进行调整。7.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及染色7.4.1 凝胶制作将玻璃板洗净，用无水乙醇擦两遍，晾干。在长板上涂亲和硅烷，在短板上涂剥离硅烷。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。待玻璃板彻底干燥后，将其组装好，用水平仪调平。取6%变性丙烯酰胺凝胶80 mL，加入TEMED 80 L和10%过硫酸铵400 L，迅速混匀后灌胶。灌胶过程中防止气泡产生。灌胶结束后，将梳子齿向外，轻轻的插入胶中，使其聚合1 h以上。7.4.2 预电泳待胶凝固后，拔出梳子，将电
14、泳槽组装好，80 W恒功率下预电泳15 min-20 min。DB23/ XXXXX201757.4.3 变性在20 L PCR产物中加入4 L 6变性上样缓冲液，混匀后，在 PCR仪上运行变性程序：95 变性5 min，4 冷却10 min。7.4.4 电泳用洗耳球吹洗加样槽，清除气泡和杂质。每个加样孔加入5 L变性后的PCR产物。80W恒功率电泳至上部的指示带（二甲苯青）到达胶板的中部。7.4.5 银染电泳结束后，小心分开两块玻璃板，凝胶紧贴在长板上。将长板置于固定液中轻轻晃动3 min、双蒸水快速漂洗1次，不超过10 s、染色液中染色5 min、双蒸水快速漂洗1次，不超过10 s、显影液
15、中轻轻晃动直至带纹清晰、固定液中定影5 min、双蒸水漂洗1 min。8 纯度检测步骤及结果计算8.1 取样按GB/T 3543.5的要求，从送验样品中随机分取至少120粒玉米种子，并保证至少有100个有效带型用于纯度检测。8.2 适合引物筛选建议优先选用附录A中引物对送检样品及亲本进行PCR扩增，筛选出不少于3对有共显性带型的引物。如果附录A中引物未扩增出共显性带型，可用其它适合的引物。筛选时用父、母本各2粒及送检样品3粒。8.3 数值计算品种（单交种）纯度P的数值以%表示，根据公式（1）计算： )1(%101 nMPi式中：M-供检种子粒数（幼苗数、株数）；M1-判定为其他品种的种子粒数（
16、幼苗数、株数）。n-选用引物数目。DB23/ XXXXX20176A A附 录 A（规范性附录）20 对核心引物核心引物见表1表1:20对核心引物序号 名称 序列（5-3 ）01 phi299852 GATGTGGGTGCTACGAGCCAGATCTCGGAGCTCGGCTA02 umc1066 ATGGAGCACGTCATCTCAATGGAGCAGCAGCAACGTCTATGACACT03 phi109275 CGGTTCATGCTAGCTCTGCGTTGTGGCTGTGGTGGTG04 phi15 GCAACGTACCGTACCTTTCCGAACGCTGCATTCAATTACCGGGAAG
17、05 umc1635 GCTGAGCAGATCTTTCCTTGTTTCAAGGAGCAGAACTCGGAGACG06 umc1134 AAAACTAACAGGCAGCAGACCAACATCAGCAAGTGACTGAATTCCTCC07 umc1196 CGTGCTACTACTGCTACAAAGCGAAGTCGTTCGTGTCTTCCGAAACT08 umc2027 CAAATATCTTCGCAGCTCCAAATCGTACCTGTCTTTGGGGCTTTTCTT09 umc1065 TGATGCTCGTTGCTTACCTGTTGCCTCTCGTCTTCCAACT10 phi65 AGGGACAA
18、ATACGTGGAGACACAGCGATCTGCACAAAGTGGAGTAGTC11 umc1857 TTCCTTGCCAACAAATACAAGGATGTTCATTGCTTCATCTTGGAACCT12 dupssr21 GTGCAAACTAATCCAAAGCAAATGTAGGGACAAAGGAATAAATCA13 umc2224 CGGGCTATAAGTAAACTGAAACGGAGCTGGCTAGCTGTTAGCGTTTT14 phi102228 ATTCCGACGCAATCAACATTCATCTCCTCCAGGAGCCTT15 phi24 ACTGTTCCACCAAACCAAGCCGAGA
19、AGTAGGGGTTGGGGATCTCCTCC16 umc2281 CAATGATTGGAGCCTAACCCCTATGATGATCTGCAGAGCCTAGTCCDB23/ XXXXX20177序号 名称 序列（ 5-3）17 umc1545 GAAAACTGCATCAACAACAAGCTGATTGGTTGGTTCTTGCTTCCATTA18 phi83 CAAACATCAGCCAGAGACAAGGACATTCATCGACGCGTCACAGTCTACT19 phi127 ATATGCATTGCCTGGAACTGGAAGGAAATTCAAACACGCCTCCCGAGTGT20 umc1154 CCACCACAAGACAAGACAAGAATGCCTGATCGATCTCATCGTCGT_
