1、洋葱内表皮细胞骨架的观察,一、实验目的,二、实验原理,细胞骨架（cytoskeleton）是指真核细胞中的纤维蛋白所组成的网络结构。,、细胞骨架的概念,红：微丝 绿：微管,微管,主要成分微管蛋白 微管主要分布在核周围，呈放射状向四周扩散,电镜下的微管,1.微管蛋白,（一）微管的化学组成,微管蛋白,微管蛋白,微管蛋白,异二聚体,2个鸟嘌呤核苷酸（GTP)结合位点。,可与秋水仙素、长春花碱结合。,微管蛋白,微管蛋白,异二聚体,聚合,首位相连,原纤维,微管,（13）,微丝的形态与组分形态：是一类由蛋白纤维组成的实心纤维细丝。直径 5-7nm，长短不一。 在细胞中，微丝可成束、成网或纤维状分散分布，主
2、要分布与细胞质膜的内侧。在具有运动功能的细胞中比较发达。,微丝,化学成分,肌动蛋白 肌动蛋白结合蛋白,中间丝,直径介与微管与微丝之间，故得名中间丝（中间纤维 IF） 810nm。中间纤维则分布在整个细胞中。IF结构稳定：既不受秋水仙素也不受细胞松弛B素影响，并且也没有极性。,二、实验原理,细胞骨架的功能,微管,微丝,中间丝,二、实验原理 细胞骨架组成及分类,根据组成成分及形态结构,细胞膜骨架细胞核骨架细胞外基质细胞质骨架,广义,狭义,二、实验原理 细胞骨架观察方法,二、实验原理 试剂选用原因,戊二醛固定能较好保存骨架成分、考马斯亮蓝R250染色，使骨架蛋白着色，胞质背景着色弱，有利于骨架显示,
3、注意微丝微管和中间丝都是直径很小的结构，最大的单根微管才25nm左右，只能在电镜下观察。 本实验用普通光镜是因为骨架纤维成束分布，染色后有夸大作用。由于细胞经抽提后剩下的主要是细胞骨架，使之显现更清晰。,M缓冲液,M缓冲液使细胞骨架中的微丝保持稳定。在M缓冲液中，其中咪唑是缓冲剂EGTA 和EDTA螯合 Ca离子，溶液并提供Mg离子，在低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张，便于观察。,Triton X-100,（聚乙二醇辛基苯基醚) 是一种非离子型表面活性剂（或称去污剂）。分子量为646.86（C34H62O11）。它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。非离子型表面活性剂它在水溶液
4、中不产生离子的一种表面活性剂。它在水中的溶解是由于它具有对水亲和力很强的官能团。表面活性剂表面活性剂分子结构具有两亲性：一端为亲水基团，另一端为疏水基团。溶解于水中以后，表面活性剂能降低水的表面张力，并提高有机化合物的可溶性。,考马斯亮蓝G-250,考马斯亮蓝有G-250和R-250两种。其中考马斯亮蓝G-250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。,3%-戊二醛,作为一种有机交联剂 戊二醛在一定条件下能将单体、线型高分子或预聚物转变成三维网状结构的物质。 戊二醛在1%浓度时，交联度已达到很高的程度，在此浓度以下，随浓度下降，交联度下降，溶胀度和降解率增加。浓度超过1%时
5、，各指标无明显变化。交联剂是一种能在线型分子间起架桥作用，从而使多个线型分子相互键合交联成网状结构的物质。促进或调节聚合物分子链间共价键或离子键形成的物质。,三、实验用品,1、材料,2、器材,3、试剂,洋葱鳞茎,显微镜、小烧杯、滴管、载玻片、盖玻片、镊子, M-缓冲液 6mmol/L磷酸缓冲液 1% Triton X-100 0.2%考马斯亮蓝 R250 3%戊二醛,3.0%戊二醛：用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制,0.2考马斯亮蓝R250：甲醇46.5ml，冰乙酸7ml，蒸馏水46.5ml,三、实验用品,4、试剂配制,1% Triton X-100：一般配成30%储备液，通 常Triton
6、 X-100与M-缓冲液以所需比例混合置于30-40 水浴2-3小时，以便液体充分混匀。使用时将30%储备液临时稀释成1%。,M-缓冲液,,四、实验方法,3、冲洗,吸去缓冲液，用1%TritonX-100 处理洋葱表皮25 min。,3戊二醛固定30min,撕取洋葱鳞茎内表皮细胞约1cm2大小若干片，置于磷酸缓冲液的培养皿中，使其下沉，（12min),吸去Triton Xl00，用M一缓冲液洗3次，每次5分钟,四、实验方法,5、冲洗,6、染色,7、制片,8、观察,PH6.8磷酸缓冲液洗3次，每次5分钟,用02考马斯亮蓝R250染10min,用蒸馏水洗12次，材料置于载玻片上，加盖玻片，即可镜检。,光镜下内表皮细胞的轮廓可见，可粗略观察到蓝色纤维、团块形成的网状结构,Thank You !,
