1、 发 布ICS 点击此处添加 ICS 号点击此处添加中国标准文献分类号RB中 华 人 民 共 和 国 认 证 认 可 行 业 标 准RB/T XXXXXXXXX转基因检测方法验证评价指南Guidance on verification of analytical methods for GMO testing（EUR 24790 EN, JRC ）（草案）XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施中 华 人 民 共 和 国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局目 次 前 言 .3转基因检测方法验证评价指南 .41 范围 .42 规范性引用文件 .43 术语和
2、定义 .44 符号和缩略语 .55 转基因检测方法验证评价 .5附录 A （资料性附录） DNA 含量对实际 LOD 的影响 .9附录 B （资料性附录） 对 DNA 提取方法的评价（抑制试验） .11附录 C （资料性附录） 中间浓度阳性对照的生产 .14附录 D （资料性附录） 基于实时 PCR 的转基因含量平均值、标准偏差和相对可重复性标准偏差的评估 .15前 言本标准是根据 GB/T1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写中的要求进行编写的。本标准等同采用欧盟委员会联合研究中心组织编写的 EUR 24790 EN 多个实验室转基因分析方法验证的验证方法 （Veri
3、fication of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methods）。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：饶红、韩玥、郭铮蕾、徐姗、李伟。本标准系首次发布的认证认可行业标准。转基因检测方法验证评价指南1 范围本标准规定了转基因检测实验室方法验证评价的术语和定义、利用协同实验数据和/或实验室内部数据进行方法验证评价的程序、方法、报告与表示。本标准适用于转基因检测（如实时荧光PCR 法）方法
4、验证过程的评价、报告和表示。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 19495.1 转基因产品检测 通用要求和定义3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1 方法确认 Validation of method确认是通过检查并提供客观证据，以证实某一特定预期用途的特定要求得到满足。(ISO 17025 5.4.5.1)3.2 方法验证 Verification of method验证是通过提供客观证据，确认特定要求得到满足（ISO 9000:20
5、00 3.8.4）。验证一个实验室能够充分按照标准要求进行操作需要实验室提供客观证据，证明对于所用的样品基质，能满足检测方法规定的性能指标。通常，标准要求是真实度（一般用偏差形式表示）和精确度（一般为重复性和再现性），反映在测量不确定度中。客观证据是从实验室实际数据中得到的真实度和精确度。3.3 可重复性标准偏差 Precision- Relative Repeatability standard deviation（RSDr）可重复性（重现性）标准偏差是指在可重复性（重现性）条件下获得的测试结果的散布的分布状态的度量标准。相同地，“可重复性（重现性）变化”或“可重复性（重现性）变化系数”可以
6、被定义或用于在可重复性（重现性）条件下获得的测试结果的散布情况的度量标准。3.4 实验室样品 Laboratory sample由原始样品经过混合、缩分得到的一定数量样品。用于制备试样和存查样品。3.5 分析样品 Analytical sample实验室通过研磨制备的样品，必要时进行混匀。3.6 检测部分 Test portion用于检测或分析的样品，其一次用于分析物提取的整体的量。3.7 检测结果 Test result测试结果是从PCR平行得出的 Ct值或拷贝数。3.8 DNA提取平行（本文中用到的）DNA extraction replicates (as used in this do
7、cument)从不同分析样品的不同检测部分得到的DNA提取物3.9 PCR平行( 本文中用到的) PCR replicates (as used in this document)用PCR在不同反应中对DNA提取物平行的分析3.10 工作溶液 working dilution后续PCR方法中用到的DNA最高浓度。3.11 定量检测低限 Limit of Quantification（LOQ）定量分析过程的低限是指被检测的样品在合适的精确度水平上能被检测出的最低含量或浓度，并且依据ISO 5727条款【2】或 【3】，经过合作实验的满意证明或单一实验室的确认。3.12 实际定量检测低限 Prac
8、tical limit of Quantification（practical LOQ）实际LOQ 是在已知（确定 /估计）目标种类基因拷贝数的情况下，能定量到的可信的（如95%置信水平）最低相对目标DNA的量。3.13 检测低限 Limit of Detection (LOD)定性方法的检测限是指被检测物能被可靠检出的最低浓度或含量。但是不必进行定量，并且已经经过合作实验的证明或单一实验室的确认。3.14 实际检测低限 Practical limit of Detection (practical LOD)实际LOD 是在已知（确定/估计）目标种类基因拷贝数的情况下，能检测到的可信的（如95
9、%置信水平）最低相对目标DNA的量。3.15 特异性 Specificity方法只对特定特性或分析物有反应的特点。3.16 动态范围定量检测范围 Dynamic range - Range of quantification由合作实验室证明了分析过程内的浓度间隔具有适当水平的精确度和真实度。3.17 真实度 Trueness大量实验结果的平均值和认可参考值的一致性。注：真实度（可信度）的量度标准通常是以斜率来表示的。可信度也就是所提到的“平均值的正确度”。3.18 精确度 Precision在规定条件下所获得的独立测试结果之间的一致性。3.19 扩增效率 Amplification effic
10、iency每个循环达到100%效率时，使理论斜率达到 -3.2的PCR扩增速度。效率（%）可用以下公式计算：效率=(10 (-1/斜率) -1) 1003.20 R2系数 R2 coefficientR2是判定系数，是通过线性回归分析得到的标准曲线的相关系数（测量的Ct值和浓度对数）的平方计算出的。3.21 稳健性 Robustness分析方法的稳健性是指在通常的使用情况下，检测方法不受微小、但有意的方法参数改变的影响，仍然能保持其测量可靠性的能力。4 符号和缩略语下列符号和缩略语适用于本标准。Ct-value number of PCR cycles to pass a set thresh
11、old Ct值DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸ENGL European Network of GMO laboratories 欧洲GMO检测实验室网络EU European Union 欧盟GM genetically modified 基因改造GMO genetically modified organism 转基因生物ISO International Standards Organisation 国际标准化组织IEC International Electrotechnical Commission 国际电工委员会LOD limit of detect
12、ion 检测限LOQ limit of quantification 定量检测限PCR polymerase chain reaction 聚合酶链式反应5 转基因检测方法验证评价5.1 DNA 提取和纯化DNA提取方法应该提供具有高质量的DNA供后续检测分析用。尽管这个标准关注的是PCR方法验证，但是DNA提取方法的评估是关键的步骤，因为DNA提取的质量对最终结果有重要影响。DNA提取方法可以是实验室间确认的方法、单个实验室确认的方法、标准方法（如ISO）和/或其它可利用的方法。步骤：对于已经确认的DNA提取方法，每次分2份至少2次（推荐3次）进行DNA 的提取，如果可能的话，不在同一天内进
13、行，并且由不同的操作者操作。提取的DNA必须要达到一定的浓度和质量标准（如，通过控制扩增效率和用实时荧光PCR检测是否存在抑制剂，见附录B）。适用于一种基质的DNA提取方法可能不适用于其它基质。以上步骤需要针对不同基质进行。对于一个DNA提取方法的验证，测试的基质不能含有转基因成分。5.2 DNA 浓度步骤：提取的DNA浓度用日常检测方法进行检测。验收标准：在验证过程中，当用于DNA提取方法的基质和方法确认的相同时，提取的DNA 要和方法确认时的结果进行对比。提取的方法应该能产生出满足检测目的的DNA的量（至少达到所需的LOD/LOQ）。如果DNA提取方法不能从特定基质上提取满足检测目的的DN
14、A, 实际的LOD 就会受到影响（附录A）。5.3 DNA 提取物中不含抑制剂步骤：每个DNA提取物的平行被稀释为工作稀释液（如40ng/L）。从这个工作溶液，进行一系列稀释，如4个稀释点被用来进行实时荧光PCR 的分析（每个稀释至少2个PCR 平行）。从4个稀释点得到标准曲线。检测抑制剂的PCR实验优先选择参考基因实验（如，特定分类基因参考系统）。工作溶液中总的DNA量应该至少和要在方法验证过程中及日常检测中用的 DNA的量相同（如，PCR特定分类参考系统中指示的DNA量）。验收标准：测量Ct值和工作溶液的推测 Ct值差值（Ct）应该 0.5(测量Ct-推测Ct) 0.5，抑制剂曲线斜率在-
15、3.6到-3.1之间。抑制剂实验的例子见附录B.如果提取的DNA含有抑制剂，在进行实时荧光PCR之前，要对DNA 进一步纯化或过滤到观察不到PCR抑制剂水平。5.4 特异性特异性应该在方法确认时就已经研究过了。因此，在方法验证时不需要对特异性再进行研究。在对几种转基因成分共有的基因要素做方法筛选时，方法在进行应用后，应该在实验室内（如果不具备方法确认的数据）先进行和市场上新的转基因物质交叉反应的检测。这也只有在具备新转基因成分的阳性对照样品时才能进行。5.5 动力范围、R 2 系数、扩增效率步骤：动力范围、R 2系数和扩增效率在测量其它参数，如真实度和精确度时，从标准曲线可以自动得出。应采用至
16、少两条标准曲线的平均值（见表1）。动力范围验收标准：动力范围必须覆盖预期使用的值。可以用转基因成分%或拷贝数范围表示。例：0.09%和4.5%的0.9% 目标转基因浓度或当目标为500拷贝时的50和2500基因组拷贝扩增效率的验收标准：对定性和定量方法，标准曲线斜率的平均值在-3.6到-3.1 之间，相当于扩增效率在90-110% 。R2系数验收标准：R 2平均值0.98。5.6 真实度步骤：真实度应该接近规定值（如0.9%阈值），或根据方法的预期使用需要，而且至少在接近LOQ的水平。真实度的测量可以用标准参考物质（CRM）的至少2个浓度（如0.1%和1% ），可能的话，用在动力范围之上的第3
17、个浓度（如5%）。或者，用一个更高比例的标准参考物质制成参考样品（如1% ）。附录C提供了制备这种参考物质的实例。检测条件（反应量、PCR仪等）应该和日常检测一致。至少要得到16个PCR 平行的结果。检测的设计实例见表1、图2和图3.附录D提供了实时荧光PCR平行的相关或不相关的转基因成分平均值、标准偏差和相对重复性标准偏差的计算方法。如果没有标准参考物质进行真实度的评估，可以用能力验证材料或能力验证的Z值评价方法的真实度。验收标准：真实度在可接受参考值的25%内，或Z值在2之间。5.7 相对可重复性标准偏差（RSD r）步骤：重复性的评估和真实度的评估方法相似。是在重复条件下通过PCR平行实
18、验进行计算。重复性适用于所有转基因水平的测试。检测条件（反应量、PCR仪等）应该和日常检测一致。至少要得到16个独立测量结果。检测的设计实例见表1、图2和图3.附录D提供了实时荧光PCR平行相关或不相关的转基因成分标准偏差和相对重复性标准偏差的计算方法。验收标准：相对重复性标准偏差应25%，在方法的动力学范围之上。5.8 定量限（LOQ）的评估可以确定相对LOQ（% ）和/或绝对LOQ （拷贝数）。相对LOQ （LOQrel）步骤：0.1%的阳性对照样品可以用目标转基因的 10次PCR 平行和目标参考基因的10次平行进行分析。LOQrel 的RSD应该低于25%。为了建立准确的LOQrel，需
19、要用低浓度的转基因物质配制溶液。绝对LOQ(LOQabs)步骤：1%的已知阳性对照样品的一系列稀释可以用 10次PCR平行（如80，60，40，20，10，5和1）。LOQabs可以用一系列的稀释液中的最后一个进行评估，测量的RSD要低于25% 。标准曲线应该覆盖 LOQabs值。概率分布建议1个拷贝应该给出大约30%的阴性结果。因此，为了验证稀释系列的拷贝数大致正确，1个拷贝的稀释液至少一个平行结果得是阴性的。10次PCR平行的平均值是标准曲线的一部分，只要标准曲线满足R 2和斜率/效率的要求。其它的标准曲线只需要在每个点做2个PCR 平行。验收标准：当有确认数据时，LOQ应该符合（或好于）
20、那些数据。5.9 检测限（LOD）的评估可以确定相对LOD（% ）和/或绝对LOD （拷贝数）。相对LOD （LODrel）步骤：一个低转基因浓度的阳性对照样品可以用10次PCR平行测量，如果所有平行的结果都是阳性，这表示LODrel 低于或和阳性对照水平相同。绝对LOD （LODabs）步骤：计算一个方法95%置信水平的 LODabs,需要每个浓度进行60个PCR平行。由于此方法并不实用，建议计算少量平行，如10次平行的假阴性率。假阴性率要低于5%（如，10个PCR平行都得是阳性结果）。这个方法可以进行 LODabs的大致评估。假阴性率是指一个已知阳性样品被检测成阴性的可能性。当分析物的量接
21、近方法的LOD，就会出现假阴性率的增加。选取稀释的系列，使其能代表基于对方法性能的认知的高于和低于预期LODabs的间隔（如20、10、5和1拷贝）。10个平行都是阳性的最低浓度是LODabs。概率分布建议1个拷贝应该有大约30%的阴性结果。因此，为了验证稀释系列正确的拷贝数，至少1个拷贝稀释的一个平行需要是阴性的。见表1.验收标准：当有确认数据时，LOD应该符合那些数据。实际LOD （LODprac）超出了本文的范围，因为要取决于样品而不是方法。但是应该对每个样品确定LODprac。5.10 稳健性在对方法进行协作实验前，在方法开发或优化时就应该对稳健性进行研究，因此，在验证研究中不用对稳健
22、性再进行评估。5.11 相关样品当有新的转基因产品出现在市场上时，实验室希望得到检测方法的通知。但是，在方法验证阶段通常只有有证参考物质。因此，通常使用有证参考物质进行验证。如果没有有证参考物质，可以用其它的转基因阳性样品。也可以对日常样品或添加参考物质的日常样品进行额外检测。表 1.定量实时荧光 PCR 方法的验证设置实例1.可选的：预实验确定 DNA 的合适浓度在 300ng-0.1ng 的范围里至少测试 3 个目标浓度（取决于植物物种）如，300ng 玉米 DNA 对应大约 110000 内源性基因拷贝，0.1ng 对应大约 37 拷贝。2.动力学范围，R 2 系数和扩增效率例 1：2
23、个标准曲线的最低要求每个曲线用 5 个校准点，做 3 个 PCR 平行（3）所有斜率都应该在-3.6 到-3.1 之间，所有 R2 值应该0.98例 2：4 个标准曲线每个曲线用 5 个校准点，做 2 个 PCR 平行（2）用 4 个斜率和 R2 的平均值进行验证。例 3：2 个校准曲线每个曲线用 8 个点，做 5 个 PCR 平行（5） ，覆盖 LOD 和 LOQ 的最低浓度。用所有 LOQ 以上部分的斜率和 R2 的平均值进行验证。3.真实度，精确度，RSDr至少两个转基因水平（一个近似于标签阈值，一个近似于 LOQ，推荐将动力范围的上限作为第三个水平）例 1：每个转基因水平做两个 DNA
24、 提取的平行，每个提取/板做 2 个 PCR 平行，4 个板得到 16 个测量结果，每个转基因水平得到 8 个评估*（图 2）例 2：每个转基因水平做两个 DNA 提取的平行，每个提取/板做 4 个 PCR 平行，2 个板得到 16 个测量结果，每个转基因水平的到 4 个评估*（图 3）为了评估中间精密度，由同一个实验员在两天里分别进行 PCR 实验，如果可能，由两名实验员实验。4.LOQ, LOD LOQ：在一个低浓度的 10 个 PCR 平行（如 80、60、40、20、10、5 和 1 个拷贝） 。LOQ 是当拷贝数测量的 RSD 低于 25%并且标准曲线覆盖了这个点的一系列浓度中的最低浓度。LOD：在一个低浓度的10个PCR平行（如20、10、5和1个拷贝） 。LOD是当所有平行都是阳性时的一系列浓度中的最低浓度。*如果基于经验，实验室能够证明两个经验丰富的操作者的平行和一个操作者的平行是一样的，就无需两个操作者完成重复了。注意：也可同时评估表 1 中的参数。注意：针对一次实验，标准曲线和样品要在同一个板上。两次实验（如内源基因和转基因实验）可以在两个不同板上进行，每个板使用相同的样品稀释液和同一个标准曲线。
