1、1广西地方标准陆川猪及其肉制品的分子定量鉴定方法（征求意见稿）编制说明一、工作简况(一) 任务来源根据广西壮族自治区质量技术监督局2016 年第一批广西地方标准制定（修订）项目计划的通知（桂质监函2016198 号）文。(二) 起草单位起草单位：广西大学、广西分析测试研究中心、广西经贸职业技术学院、广西陆川县质量技术监督局。(三) 主要起草人姓 名 性别 职务/职称 工作单位 任务分工黄丽 女 副教授 广西大学 项目负责人黄磊 男 研究生 广西大学鉴定方法研究，标准研制杨磊 女 高级工程师 广西经贸职业技术学院 标准研制黄岛平 男 高级工程师 广西壮族自治区分析测试研究中心 调研论证庞理松 男
2、 局长 陆川县质量技术监督局 原料收集，调研夏宁 女 副教授 广西大学 PCR 方法研究林葵 女 高级工程师 广西壮族自治区分析测试研究中心 调研论证韦保耀 男 教授 广西大学 标准研制滕建文 男 教授 广西大学资料收集、组织协调、统稿庞丽 女 副局长 陆川县质量技术监督局 原料收集杜寒春 女 高级工程师 广西壮族自治区分析测试研究中心 调研论证二、制定标准的必要性和意义陆川猪因其原产于广西壮族自治区东南部的陆川县而得名，是中国华南地区的优良猪2种，主要分布于广西玉林、梧州、钦州等地区。是“中国八大地方优良猪种”之一。陆川猪属于小型脂肪型猪种，但其皮薄肉嫩、脆而不腻、味道鲜美、营养丰富。其畜产
3、品可加工成香肠、无皮五花腊肉、白切猪脚、脆皮乳猪、扣肉等制品，产品价值非常高，不仅深受国内消费者的青睐，更有受到海外消费者的欢迎。然而由于纯种陆川猪本身饲料率低、饲养周期相对较长，为了满足市场需求而以纯种陆川猪为母本与国内外其他的优良猪种进行杂交，得到了高饲料率、短周期的二代陆川猪（称为二元杂猪，例如大陆二元杂）和三代陆川猪（称为三元杂猪，例如大陆长白三元杂）。二元杂猪与三元杂猪的出现弥补了纯种陆川猪的不足，丰富了消费者的选择，提高了陆川猪品牌的价值。新事物的出现也常常伴随着问题，由于陆川猪肉自身的优势，市场上陆川猪肉的价格常常是普通猪肉价格的两到三倍，这种价格的差异诱导了很多不法分子对陆川猪
4、生鲜肉及熟肉制品掺假造假的违法现象。有些不法商贩将普通猪肉混入陆川猪肉，以次充好，更有甚者以普通猪肉的生鲜肉或者熟肉制品假冒陆川猪肉进行销售，牟取不法利润，这样的做法不仅扰乱的肉类市场，欺骗了消费者，打击了陆川猪的的整个产业链的积极性，严重影响了陆川猪品牌的长远发展。目前对陆川猪肉与普通猪肉进行鉴伪的方法较少，监管体系尚未建立起来。在目前的陆川猪研究中，国内学者主要从分子生物学角度，研究了陆川猪的遗传与繁殖、猪支原体肺炎病原分子致病机制，并开发了保健扣肉、腊肠、火腿等一系列的陆川猪肉制品。但是针对陆川猪的鉴定技术研究中，鲜有报道。仅有广西大学何若钢等对杜洛克与陆川猪杂交后代进行过肉质研究，在研
5、究中也发现，虽然色差计、嫩度仪、酸度计、电镜等仪器在数据上能直观的反映出肉制品的品质，但肉质指标大多没有统一的数值范围，个体差异也比较明显，不能作为区别陆川猪及其他品种猪的重要依据。采用可靠的 DNA分子鉴定技术，快速、准确的鉴定了陆川猪、陆川猪杂交品种、巴马香猪、瘦肉型猪及其肉制品之间的区别，为广西陆川猪鉴别技术标准研究奠定了基础。但是，遗憾的是前期研究尚未形成能够实施的标准。而且由于陆川猪系的杂交后代品种较多、且目前 NCBI 文库尚未检索到陆川猪系的全基因序列，陆川猪的全基因组学研究进展缓慢，为陆川猪系（纯种、二元杂、三元杂等陆川猪）的 DNA 的定量鉴别技术研究带来了很大的难度。因此，
6、针对肉类鉴伪识别技术的发展以及肉类成分鉴定标准现状，在前期陆川猪的DNA 分子鉴定技术的研究基础上，拟进一步扩大陆川猪的样本、扩大样品的产地，进一步完善 DNA 分子标记鉴定陆川猪系及其肉制品的方法，优化反应体系、研究扩增体系的稳定性和灵敏度。建立标准化陆川猪及其肉制品的 QPCR 定量检测方法，为政府部门规范和监督相关食品企业生产提供法律依据，为保护消费者食品安全提供有力的保障。3三、主要起草过程（一）成立标准编制小组，确定编写方案项目立项后，广西大学立即成立标准编制小组，确定陆川猪及其肉制品的分子定量鉴定方法标准制定方案。（二）收集资料，撰写工作组讨论组通过检索、查阅相关文献资料，收集了广
7、西地区的陆川猪和部分非陆川猪样品，参照可实现的学者研究 QPCR 鉴定方法，并联系厂家确定用于鉴定方法建立的部分样品。完成大量而充分的前期工作后，编制组开始着手撰写陆川猪及其肉制品的分子定量鉴定方法的工作组讨论稿。（三）调研论证，形成征求意见稿编制小组在充分讨论、研究及集体分析后，几经修改和讨论，完成了陆川猪及其熟肉制品的分子定性鉴定方法的征求意见稿。2016 年 5 月在广西大学轻工与食品工程学院组织相关专家召开标准研讨会，确立鉴别方法使用 QPCR 技术；2016 年 10 月在广西大学轻工与食品工程学院组织相关专家召开标准研讨会，进一步完善方法的评价体系。2017 年10 月在广西分析测
8、试研究中心进行了试验方法的复验，认为鉴别方法整体可行、重现性好。四、制定标准的原则和依据（一）本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。（二）本标准编制遵循“科学、适度、可行”原则，标准的编写参考了 SN/T 3730-2013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法实时荧光 PCR 法， SN/T 3731-2013 食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法实时荧光 PCR 法，SN/T 3589-2013 出口食品中常见鱼类及其制品的鉴伪方法实时荧光 PCR 法， SN/T 4103-2015 猪及其加工产品中转基因成分定性 PCR 检测方法等商检行业标准，并结合试验结果为基本依据。五、主
9、要条款的说明（一）原理QPCR(Real-time Quantitative PCR Detecting)实时荧光定量检测。即在普通 PCR 扩增体系中新加入特异性的荧光探针（Taq）或者荧光染料（SYBR ），探针的 5端是荧光报告基4团而在 3端对应的是淬灭基团 1。在扩增前，探针作为一个整体，荧光部分所报告的信号恰好被淬灭基团吸收；在扩增时特异性探针与特异性基因位点结合，而体系中的 Taq 酶会将探针切断，使荧光基团与淬灭基团分离，从而荧光基团所报告荧光信号未被吸收而被系统监测到,而随着 DNA 链的扩增，结合在特定位点被切断的荧光基团也随之增多，通过荧光信号积累的监控即可实时检测到目的
10、片段(目的基因) 的情况 2。荧光染料（SYBR ）可以结合到双链 DNA 上面，当体系中的模板被扩增时，SYBR 可以有效结合到新合成的双链上面，随着 PCR 的进行，结合的 SYBR 染料越来越多，被仪器检测到的荧光信号越来越强，从而达到定量的目的 3。实时荧光定量 PCR 的出现，极大地简化了定量检测的过程，真正实现定量检测。（二）仪器与试剂1 主要仪器普通 PC 实时荧光 QPCR 仪、高速冷冻离心机、冷藏冷冻冰箱、漩涡振荡器、微量移液器（1 l、10 l、100 l、1 000 l）、0.2mL 光化学 QPCR 管、一次性 PE手套、1.5mL 离心管。2 主要试剂2.1 除另有规
11、定外，所有试剂均为分析纯或者生化试剂。2.2 实验用水：应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。2.3 DNA 提取试剂盒（Genomic DNA Isolation Kit Instruction Manual）。2.4 2X SYBR QPCR Master Mix。 3. 特异性引物。参考 Genbank（基因银行）数据库中的陆川猪线粒体细胞色素 b 全序列（编号：GI:748762956），并与其他品种猪（地方黑猪 GI: 917574245，地方土猪 GI: 4512161，杜洛克 GI: 1111374688，长白猪 GI: 1049937379 等线粒体全序列）进行 Blas
12、t 比对。找到陆川猪的保守序列（特异性序列），委托上海生工生物工程公司设计并合成陆川猪线粒体细胞色素 b（上游序列 5-CACTTACCGGAGCCCTATCA-3；下游序列 5-GGTGGTCAGCAACCTCCTAA-3），合成后的引物是白色干粉的形式，使用前先对其进行预处理，使用小型离心机对引物进行 2s 左右离心，后加入说明书上各引物的稀释所需体积的 TE 溶液，使引物浓度达到 100M，完成后将引物放入-20 冰箱中保存备用。引物序列如表 1。表 1 引物信息检测基因 引物序列55-CACTTACCGGAGCCCTATCA-3陆川猪线粒体细胞色素 b5-GGTGGTCAGCAACCT
13、CCTAA-3（三）肉制品制作方法将生鲜猪肉清洗、切分后，在 100 的水中煮约 15 min，直至肉色发生改变且内外表面无血水，取出冷却至室温即成熟肉样品。将生鲜猪肉样品经过清洗、切块后，在水温为90 的水中预煮约 30 min，直至无血水，然后捞出冷却后，放入油温为 180 左右的油中炸 1015 min，捞出冷却、切片并调味，即成为实验所需的扣肉样品 4。将生鲜猪肉样品切块、修整，把 2.5 %的食盐，适量料酒、香辛料等充分混合后均匀地涂抹在肉品表面，并适当揉搓后放入 4 冰箱中腌制 1 d，待配料全部渗入肉内后取出，放入烘箱中，先用 40 的温度烘烤 2 h，然后把温度调至 55 烘烤
14、约 36 h，待把腊肉烘干后取出即可成为实验所需的扣肉样品 5。（四）鉴定步骤按照通用型基因组 DNA 提取试剂盒（Genomic DNA Isolation Kit Instruction Manual）中动物组织基因组 DNA 提取操作进行提取 18-19。1.将待测的原料猪肉，去除肥肉后，用灭菌刀切分。提取时切取 0.5g 肉样，剪碎后用干净镊子或药匙转移至干净的离心管中；2.向离心管中加入 400 l Buffer L1 和 20 l Foregene Protease，涡旋混匀，放置于 65金属浴或水浴中 25-30min，其间每间隔 10min 涡旋混匀一次，促进酶解；3.酶解完成
15、后，加入 400l Buffer L2，颠倒混匀至分层消失，置于 65金属浴或水浴中 10min，然后 12000 rpm 室温离心 5-10 min，收集上清液；4.将上清液用移液器转移到离心柱中，再将离心柱放入收集管中，然后 12000 rpm 室温离心 1min，弃掉收集管中的废液；5.向离心柱中加入 500l Buffer PW，12000rpm 室温离心 1min，弃掉收集管中的废液；6.再向离心柱中加入 700 l Buffer WB，12000rpm 离心 1min，弃掉收集管中的废液；将离心柱放回收集管中，12000rpm 空管离心 2min，弃掉离心柱中残余的 Buffer
16、WB；7.将离心柱移至新的 1.5mL 离心管中，向膜中央悬空滴加 100 l 已于 65预热的Buffer EB，室温放置 5min，12,000rpm 离心 1min，收集洗脱液；8.再次向膜中央悬空滴加 100 l 已预热的 Buffer EB，12,000rpm 离心 1min，收集洗脱液；将两次收集的洗脱液合并，即得样品 DNA。DNA 提取后置于-20保存。62 DNA纯度的测定检测提取 DNA 的纯度。取 5L DNA 溶液加灭菌水稀释至 1mL，用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260nm 和 280nm 处的吸光值。 DNA 纯度为 OD260 /OD28020。DN
17、A 样品的纯度检测结果见表 2。表 2 DNA 纯度检测结果样品名 OD 260nm OD 280nm OD 260nm / OD 280nm纯种陆川猪生鲜肉 0.381 0.205 1.854纯种陆川猪熟肉纯种陆川猪扣肉纯种陆川猪腊肉0.3640.3880.376 0.2070.2110.2041.8531.8391.843二元猪生鲜肉 0.330 0.184 1.739二元猪熟肉二元猪扣肉二元猪腊肉0.3590.3270.3340.1890.1760.1851.7931.8581.805三元猪生鲜肉 0.366 0.201 1.899三元猪熟肉三元猪扣肉三元猪腊肉0.3620.3780.3
18、650.2030.2150.1831.7831.7581.995地方土猪生鲜肉 0.454 0.266 1.707地方土猪熟肉地方土猪扣肉地方土猪腊肉0.4770.4850.4330.2350.2470.2162.0301.9642.004地方黑猪生鲜肉 0.347 0.201 1.726地方黑猪熟肉地方黑猪扣肉地方黑猪腊肉地方黑猪猪毛地方黑猪猪血0.3390.3830.3760.3750.3980.1970.1990.2000.2160.2141.7211.9241.8801.7361.860白条猪生鲜肉 0.290 0.150 1.733白条猪熟肉白条猪扣肉白条猪腊肉0.3200.2940
19、.2760.1800.1580.1431.7781.8611.931结果表明，PCR 扩增的要求是提取 DNA 的 OD260 / OD280 要 达到 1.7 至 2.0 之间，而DNA 试剂盒提取法又高效又能提取达到 PCR 扩增要求，所以采用 DNA 试剂盒提取样品DNA。采用商业的化 DNA 试剂盒提取，效率高，质量好，且几乎对人体以及环境不存在污染。73 实时荧光 QPCR反应体系QPCR 扩增体系的反应液共 20L，反应所需的 2SYBR qPCR Master Mix 包含了 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl 2、反应缓冲液、QPCR 反应的增强剂、优化剂、稳定剂和S
20、YBR 染料等，浓度为 2，体系如表 39。配置体系时在每个 PCR 管内按照表 3 从左至右的顺序依次加入试剂和模板，注意在加样时应使样品 DNA 模板溶液完全落入反应液中，不应粘附于管壁上，如若管壁上存在粘附残留，必须先进行离心使其全部落入管底，再将PCR 管放入 PCR 仪内准备扩增。表 3 QPCR 反应体系上游引物 下游引物 DNA Buffer2SYBR qPCR Master Mix模板 DNA ddH2O0.4 L 0.4 L 2.0 L 10.5 L 1 L 补足至 20.0L4 实时荧光 PCR反应程序在 PCR 仪表设置界面按照表 4 设定扩增程序进行 40 个循环扩增
21、10。表 4 QPCR 反应程序预变性 退火（信号获取） 延伸95 60 60 3 min 20 s 20 s5 实验对照阴性对照选取与陆川猪不同的猪种，考虑到市场存在以廉价猪肉代替陆川猪肉的现象，将地方土猪或地方黑猪或白条猪或其他非陆川猪按试剂盒提取提取 DNA，按表 3 配置QPCR 反应体系，按表 4 程序进行 QPCR 扩增；空白对照选取灭菌水代替 DNA 模板，按表 3 配置 QPCR 反应体系，按表 4 程序进行 QPCR 扩增 11。6 实时荧光 QPCR反应运行设定好 QPCR 仪的扩增程序后，检查 QPCR 反应管是否摆放正确（检查各放反应管是否盖紧，以免反应液泄漏污染仪器）
22、，开始运行仪器进行 QPCR 反应。QPCR 反应结束后，可在程序 QPCR 仪的“ 数据获取 ”界面获得被测样品的 Ct 值。（五）结果判定与表述1 质量控制空白对检测无荧光增幅现象，无菌水中不含 DNA；阴性对照检测无荧光增幅现象，提8取的地方土猪或地方黑猪或白条猪或其他非陆川猪的 DNA 中不含与陆川猪特异性引物 b对应的结合的位点，所以不会进行 QPCR 扩增，无信号获取，则不出现荧光增幅现象。依据 BJS 201707植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定。2 结果判定根据获得被测样品的 Ct 值， 如 Ct 值20.0，则判定为被检样品阳性；如 Ct 值30.0，则判定为被检样品阴性；如
23、20.0Ct 值30.0，则重复试验一次。如再次扩增后 Ct 值为20.0Ct 值25.0 ，则判定被检样品含二元猪源性成分者。如再次扩增后 Ct 值为 25.0Ct值30.0，则判定被检样品含三元猪源性成分者。表明样品中含有纯种陆川猪的特异基因。QPCR 检测结果如表 5。表 5 QPCR 检测结果样品 Ct初始拷贝数copies/l陆川猪生鲜肉 13.55 2.751011陆川猪熟肉陆川猪扣肉陆川猪腊肉二元猪生鲜肉二元猪熟肉二元猪扣肉15.38 16.3217.7715.0114.1121.673.241093.49108.53.88107.93.141092.9010104.91106.
24、5二元猪腊肉 24.38 5.64105.1三元猪生鲜肉三元猪熟肉三元猪扣肉三元猪腊肉26.1527.8528.3328.906.12104.76.57104.76.701046.85104其中纯种陆川猪的荧光检测量最强，Ct 值的范围在 10 到 20 之间；三元杂猪的荧光检测量最弱，Ct 值的范围在 25 到 30 之间；二元杂猪的荧光检测 CT 值的范围在 20 到 25 之间。对于不含陆川猪特异性基因的其他品种猪则不会有扩增曲线。3 结果表述结果为阳性者，表述为“被检样品为纯种陆川猪”。结果为阴性者，表述为“被检样品为非陆川猪”。结果为含二元猪源性成分者，表述为“被检样品为二元陆川猪”
25、。结果为含三元猪源性成分者，表述为“被检样品为三元陆川猪”。依据 BJS 201707植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定。（六）样品保存依据 GB/T 21101-2007动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法 PCR 方法，样品9应在20 条件下保存，防止 DNA 降解。（七）实验室防污染措施按照 GB/T 2740 的规定执行。六、验证试验（一）特异性评价用陆川猪特异性引物 b 对纯种陆川猪，二元猪，三元猪，地方土猪，地方黑猪，白条猪（生鲜肉、熟肉、扣肉、腊肉）进行 QPCR 反应检测，以评价该引物的特异性 12。图 1 QPCR 特异性扩增曲线（生鲜肉和熟肉） 图 2 QPCR 特异性熔解曲线
26、（生鲜肉和熟肉）注：图 1 中的扩增曲线分别为纯种陆川猪生鲜肉、纯种陆川猪熟肉、二元猪生鲜肉、二元猪熟肉、三元猪生鲜肉、三元猪熟肉。没有扩增曲线样品为地方土猪生鲜肉、地方土猪熟肉、地方黑猪生鲜肉、地方黑猪熟肉、白条猪生鲜肉、白条猪熟肉。退火温度设置为 60。图 3 QPCR 特异性扩增曲线（扣肉、腊肉） 图 4 QPCR 特异性熔解曲线（扣肉、腊肉）注：图 3 中的扩增曲线分别为纯种陆川猪扣肉、纯种陆川猪腊肉、二元猪扣肉、二元猪腊肉、三元猪扣肉、三元猪腊肉。没有扩增曲线样品为地方土猪扣肉、地方土猪腊肉、地方10黑猪扣肉、地方黑猪腊肉、白条猪扣肉、白条猪腊肉。退火温度设置为 60。根据图 1、3
27、 结果表明，特异性引物 b 对于纯种陆川猪，二元杂猪，三元杂猪生肉、熟肉制品及猪血、猪毛均有扩增曲线，而对于地方土猪，地方黑猪以及白条猪的对应样品均无扩增曲线。图 2、4 中熔解曲线 Tm 值在 77.50.5，峰值唯一，没有二聚体和其他非特异性杂峰产生。目的片段为陆川猪保守序列，特异性引物 b 可用于特异性检测陆川猪。从QPCR 评价性的试验结果总体可以得出，特异性评价试验表明特异性引物 b 在退火温度设定在 60的条件下，纯种陆川猪，二、三元杂猪均能进行扩增且有不同的扩增曲线，对于不含陆川猪特异性基因的其他品种猪则不会有扩增曲线，且熔解曲线 Tm 值在 77.50.5，峰值唯一，没有二聚体
28、和其他非特异性杂峰产生。因此，引物 b 具有非常强的特异性。（2）重现性评价对 3.010拷贝数的纯种陆川猪，二元杂猪，三元杂猪（生鲜肉、熟肉、扣肉、腊肉）提取的 DNA 分别作五次 QPCR 检测，得到样品的 Ct 值并计五个平行样之间的变异系数（CV），进而评价引物重现性 13。变异系数的计算结果如表 6 所示。变异系数 CV =(标准偏差 SD / CT 平均值）100%表 6 QPCR 重复性检测结果样品 Ct1 Ct2 Ct3 Ct4 Ct5 CtmeanSD CV(%)陆川猪生鲜肉陆川猪熟肉陆川猪扣肉陆川猪腊肉15.1516.9817.3419.5615.7716.8417.391
29、9.4815.5116.4517.2919.6015.6016.4217.3819.5915.9816.5317.3119.5715.6016.6417.3419.560.310.250.040.05 0.990.510.250.24二元猪生鲜肉二元猪熟肉二元猪扣肉二元猪腊肉22.6323.7624.4425.1323.2123.7924.4725.1122.4423.8124.4125.1522.8523.7724.4525.1822.1223.8024.4425.1622.6523.7924.4425.150.410.640.020.030.820.690.090.11 三元猪生鲜肉三元猪熟肉三元猪扣肉三元猪腊肉26.0027.5728.4529.2326.4727.5528.4129.2126.9527.6128.4629.1926.5227.6228.4429.2026.0427.5928.4529.2226.4027.5928.4429.210.390.030.020.020.480.100.070.05表 6 结果表明，陆川猪生肉、熟肉制品、猪血和猪毛样品的五次试验检测数据的变异系数均小于 1.00，表明样本之间离散程度小，证明在定量检测陆川猪系列样品过程中特异性引物 b 具有良好的重复性。
