1、键入文字1烟草及烟草制品中多酚类化合物（新绿原酸、4-o-咖啡奎尼酸、莰菲醇基芸香苷） 测定 超高效液相色谱法标准编制说明贵州省烟草科学研究院2017 年 5 月键入文字2目 录一、编制的目的和意义 .3二、任务来源及编制工作过程 .3三、标准制定原则 .4四、标准的构架和主要内容及指标确定的依据 .5五、与现行相关法律、法规、规章及相关标准，特别是强制性标准的协调性 .12六、专利及涉及知识产权 .13七、分歧意见的处理经过 .13八、标准作为强制性或推荐性标准的建议 .13九、贯彻标准的要求和措施建议 .13十、废止现行有关标准的建议 .14十一、其他应予说明的事项 .14十二、推广应用的
2、预期效果 .14十三、标准水平分析 .14键入文字3一、编制的目的和意义烟草酚类物质（包括酚及其衍生物）是衡量烟草品质的重要指标，在烟草中的含量约为 0.52%6.04% 。目前，在烟叶和烟气中已鉴定出的多酚物质有已有 280 多种。 烟草行业在 2006 年出台了使用液相色谱测定烟草及烟草制品中绿原酸、莨菪亭和芸香苷三种酚类化合物的分析方法（YC/T 202-2006），但在烟草中同样含量较高的新绿原酸、4-o- 咖啡奎尼酸、莰菲醇基芸香苷等多酚类物质还没有标准出台，且随着烟草品质等方面研究的深入及研究手段的更新，2006 年的分析手段无论在分析时间还是分析种类上都无法满足现阶段对我省大量烟
3、草及烟草制品中酚类化合物的分析要求。本标准拟建立烟草和烟草制品中 3 种（新绿原酸、4-o-咖啡奎尼酸、莰菲醇基芸香苷）对烟草品质影响较大的多酚类化合物的超高效液相色谱快速检测方法，简化分析步骤，节省分析时间，为加强烟草及烟草制品的品质安全和产品质量的监督提供可靠的方法保障。二、任务来源及编制工作过程（一）任务来源本标准于 2013 年由贵州省烟草科学研究院首次提出，经贵州省质量技术监督局批准，被列入贵州省 2013 年第一批地方标准制修订项目计划（黔质技监标函2013158 号）。项目获批后，我院成立了以耿召良为组长的标准起草工作组，认真总结、梳理和编制，完成了方案制定、项目实施、总结梳理、
4、标准编制、征求意见等多项工作。（二）编制工作过程1 项目立项2013 年 8 月项目牵头单位贵州省烟草科学研究院与中国烟草总公司贵州省公司键入文字4签定烟草及烟草制品中多酚类化合物（新绿原酸、4-o-咖啡奎尼酸、莰菲醇基芸香苷） 测定 超高效液相色谱法标准项目合同。2 项目启动和文献调研阶段（2013 年 1 月2013 年 2 月）项目负责人召开项目启动会，对项目研究人员进行了明确分工，并制定了项目实施方案。项目组有针对性的开展新绿原酸、4-o-咖啡奎尼酸、莰菲醇基芸香苷分析测定方法的调研和信息收集工作，并对收集的资料进行汇总、整理、分类。同时，结合行业的实际情况，提出初步意见和构想。3 标
5、准方法实验室研究阶段（2013 年 3 月2014 年 9 月）3.1 前处理条件最佳色谱条件的确定（2013 年 3 月2013 年 12 月）项目组在文献报道方法的基础上，对比研究了样品的前处理方法和色谱分析条件：确定最佳提取溶剂、提取方式及提取时间等前处理条件；通过选择超高效液相色谱柱进行分离，并对流动相的组成、流速、柱温等条件进行优化，确定最佳色谱分析条件。3.2 方法学验证及样品测定（2014 年 1 月2014 年 12 月）对新建立的测定方法的线性、检出限、重复性和回收率进行评价。选择不同种类的烟草样品，采用所建立的方法，对样品烟叶中的新绿原酸、4-o-咖啡奎尼酸、莰菲醇基芸香苷
6、进行测定，考察了方法的适用性。3.3 标准方法初稿起草阶段（2015 年 1 月2015 年 3 月）完成标准方法初稿的起草工作，在前期大量实验的基础上撰写项目研究报告，并将标准方法文本及研究报告。3.4 项目总结阶段（2015 年 4 月-2017 年 4 月）项目牵头单位对形成的烟草及烟草制品中多酚类化合物（新绿原酸、4-o-咖啡奎尼酸、莰菲醇基芸香苷） 测定 超高效液相色谱法标准征求意见稿，广泛征求行业内外的意见。三、标准制定原则本标准符合以下制定原则：（1）符合地方标准制修订管理工作规程对编制程序和工作的规定和要求。键入文字5（2）符合地方标准检测技术的有关要求，适应行业的技术特点。（
7、3）符合标准的科学性、先进性、实用性。标准的技术指标确定要有可靠的技术支撑。（4）符合国家法律、法规的有关要求，不与已有标准冲突。四、标准的构架和主要内容及指标确定的依据（一）标准的构架本标准由目次、前言、正文和附录 A 四部分组成。其中正文共 9 章，为范围，规范性引用文件，原理，试剂，仪器与材料，样品制备，分析步骤，精密度和回收率，检测报告。（二）标准的适用范围本标准适用于烟草和烟草制品中新绿原酸、4-o-咖啡奎尼酸、莰菲醇基芸香苷的测定。（三）标准的研制内容（1）前言烟草酚类物质（包括酚及其衍生物）在烟草中的含量约为 0.52%6.04%，不但本身具有令人愉快的香气，而且在燃吸时由于干馏
8、、氧化、裂解生成了一系列物质，这些降解物能赋予烟草优雅的香气，增加烟草制品的香气量，从而对改善烟草制品的品质有着重要的作用，对烟叶色泽、香味和烟气生理强度具有重要影响，是衡量烟草品质的重要指标。酚类是由烟株体内三大物质（糖类、脂类、蛋白质）之间的代谢形成 ，是植物重要的次生物质之一。目前，在烟叶和烟气中已鉴定出的多酚物质有已有 280 多种。多酚类物质通常带有 1 个或多个羟基芳香环，在烟草中全部以葡萄糖苷和酯的形式存在，烟草中发现的酚类物质包括单宁类、香豆素类、黄酮类和花色素类以及简单酚衍生物等。在 2006 年烟草行业已经出台了使用液相色谱测定烟草及烟草制品中绿原酸、莨菪亭和芸香苷三种酚类
9、化合物的分析方法YC/T 202-2006 烟草及烟草制品 多键入文字6酚类化合物 绿原酸、莨菪亭和芸香苷的测定。但由于烟草中多酚类物质种类较多，在烟草中同样含量较高的新绿原酸、4-o-咖啡奎尼酸、莰菲醇基芸香苷等多酚类物质还没有标准出台，且随着烟草品质等方面研究的深入及研究手段的更新，2006 年的分析手段无论在分析时间还是分析种类上都无法满足现阶段对我省大量烟草及烟草制品中酚类化合物的分析要求。本标准拟建立烟草和烟草制品中 3 种（新绿原酸、4-o-咖啡奎尼酸、莰菲醇基芸香苷）对烟草品质影响较大的多酚类化合物的超高效液相色谱快速检测方法，简化分析步骤，节省分析时间，为加强烟草及烟草制品的品
10、质安全和产品质量的监督提供可靠的方法保障。（2）材料与试剂（1）试剂：甲醇（色谱纯）购于美国 Fisher 公司，冰醋酸（色谱纯）购于美国迪马公司。纯度大于 97%的标准品（新绿原酸、4-o-咖啡奎尼酸、莰菲醇基芸香苷）购于Sigma-Aldrich 公司。超纯水由 Milli-Q Element 型超纯水系统获得(美国 Millipore 公司）。尼龙针式滤头（0. 22 m）购于天津市津腾实验设备有限公司）。（2）仪器：AB104-S 型电子天平(感量 0.0001 g，瑞士 Merrier Toledo 仪器公司)。T701DH 型超声波振荡器（德国 Elma 公司）。ACQUITY H
11、-Class 超高效液相色谱配PDA 二极管阵列检测器及 Empower 3 色谱工作站， ACQUITY UPLC BEH C18 (1.7m，2.1 100mm)色谱柱（美国沃特世公司）。（3）前处理方法将烟叶样品粉碎后过40目筛，准确称取0.1 g(精确至0.1 mg)样品于置于50mL离心管中，准确加入20mL 40%甲醇水溶液（体积比）置于超声波振动器中，在超声波频率40 KHz，萃取功率130 W条件下超声萃取20min，取2mL萃取液，用0.22m微孔滤膜过滤后待分析。键入文字7（4）色谱检测方法流动相 A：0.5%冰醋酸- 水；流动相 B：0.5%冰醋酸 -甲醇；梯度洗脱：0m
12、in：A89% ，B11%；0.3min：A73%，B27%；0.9min：A67%，B33%；2min：A55% ，B 45%；4.0min：A55% ，B 45%；4.1min：A20%，B 80%；5.4min：A20% ，B 80%； 5.5min：A89% ，B 11%；运行时间 10min。色谱柱：BEH C18 (1.7m，2.1mm100mm)；柱流速：0.25mL/min ；柱温：30 ；进样量：1L；检测波长0min：325nm；5min：348nm。采用比较标准与样品保留时间对新绿原酸、4-o-咖啡奎尼酸、莰菲醇基芸香苷进行了定性，外标法定量。（5）前处理条件优化5.1
13、提取溶剂的选择 多酚类化合物极性溶剂中具有较大的溶解度，实验以不同比例的甲醇-水做萃取溶剂，根据样品前处理方法，称取同一烤烟样品 10 份，分成 5 组，分别加入 20 mL20%，40%，50%，60%，80%(体积分数)甲醇水进行提取，结果取测定结果的平均值，结果见表 1。由表 1 可知，随着提取溶剂中甲醇比例的增大，测定结果略有增大，40% 的甲醇水已提取完全，且过高的甲醇含量会导致溶剂效应，影响峰型的对称性，因此选择 40%的甲醇水溶液作为提取溶剂。表 1 不同体积分数甲醇水溶液对烟草中多酚的提取结果 （mg/g）甲醇水 新绿原酸 4-o-咖啡奎宁酸 莰菲醇基芸香苷20% 2.61 3
14、.58 0.76 40% 2.66 3.65 0.81 50% 2.65 3.63 0.81 60% 2.65 3.64 0.82 80% 2.69 3.65 0.84 5.2 提取时间的选择 键入文字8根据样品前处理方法，称取同一烤烟样品 8 份，分为 4 组，超声萃取，分别考察了超声时间为 10，20 和 30 min，40min 时多酚的提取情况，结果见表 2，当提取时间为 20 min 时，提取液已达到溶解平衡。因此，确定超声提取时间为 20 min。表 2 不同提取时间测定烟草中多酚的结果 （mg/g）超声时间 新绿原酸 4-o-咖啡奎宁酸 莰菲醇基芸香苷10 2.69 3.67 0
15、.8020 2.73 3.72 0.8230 2.71 3.69 0.8140 2.75 3.74 0.835.3 提取方式的选择根据样品前处理方法，称取同一烤烟样品 4 份，分成 2 组比较了常用的摇床震荡和超声波震荡的结果（表 3），由表 3 可以发现两种提取方式的提取结果相同，但超声震荡采用离心管，样品排列更紧密，节约空间，可以同时提取更多的样品，因此实验采取超声震荡的方式。表 3 不同提取方式测定烟草中多酚的结果 （mg/g）萃取方式 新绿原酸 4-o-咖啡奎宁酸 莰菲醇基芸香苷超声震荡 2.73 3.72 0.82 摇床震荡 2.73 3.71 0.82 5.4 色谱条件的确定选择超
16、高效液相色谱柱进行分离，并对流动相的组成、流速、柱温等条件进行优化，确定最佳色谱分析条件。5.4.1 色谱柱的选择为了提高分析效率，实验采用填料粒径为 1.7m的 waters BEH C18 超高效液相色谱柱，由于提取液中包含了绿原酸异构体、芸香苷异构体，在色谱柱中的保留特性非常接近，为实现各物质的完全分离，实验选择了理论塔板数更高的2.1mm100mm 色谱柱对多酚物质进行分离。键入文字95.4.2 检测波长的选择在 210500 nm 波长范围内，用 PDA 检测器分别对 3 种烟草多酚进行全扫描，结果发现新绿原酸、4-o-咖啡奎尼酸、莰菲醇基芸香苷最佳吸收波长分别为324.3，326.
17、7，347.7nm。由于新绿原酸、4-o-咖啡奎尼酸为绿原酸异构体，最佳检测波长非常接近，因此本方法最终确定的波长条件为 0min：325nm；5min：348nm 。5.4.3 色谱梯度条件的确定多酚类物质化学性质较活泼，酚羟基易氧化和电离。在甲醇水为流动相的环境下，多酚作为一种弱电解质会发生电离。生成的离子和未电离的中性分子在 固定相表面有不同的保留行为，引起酚在固定相表面形成双重保留，导致分离效果差，峰形拖尾。因此通过向流动相中加入冰乙酸的方式抑制多酚电离。最终根据色谱分离情况确定了最终的色谱分析条件。3 种多酚的标准品和样品分析色谱图见图 1。AU0.120.4.360.48 分.40
18、2.83.0.64.0.4.805.2.60.1 3AU0.12.40.36.48 分2.402.803.203.604.04.04.805.205.60.012 31新绿原酸 24-o-咖啡奎尼酸 3莰菲醇基芸香苷 图 1：酚类化合物的混合标样 (a)烟样(b)超高效液相色谱图5.4.4 流速、柱温和进样量的确定由于 BEH C18 色谱柱粒径小柱长较长 (1.7m，2.1mm100mm)，在 0.25mL/min流速的梯度条件下运行时柱压最高时接近 10000psi，且流速提高会降低绿原酸异构体间的分离度，因此确定最佳流速为 0.25mL/min。ab键入文字10考察了 30、35、40柱
19、温条件下多酚分离情况，发现温度对分离度影响不明显。考虑到温度对柱寿命的影响，选择了 30柱温。由于流动相起始条件水相比例高，为防止溶剂效应的发生，选择了 1uL 的进样量。（四）指标确定的依据（1）定量参数验证1.1 工作曲线、检测限分别称取新绿原酸、2,4-o-咖啡奎尼酸 50.00mg，莰菲醇基芸香苷 5.0 mg，于50mL 烧杯中， 用 15mL 甲醇溶解，再转移至 50mL 容量瓶中用 40%的甲醇水溶液定容至刻度，作为新绿原酸、2,4-o-咖啡奎尼酸和莰菲醇基芸香苷的一级混合标准溶液。取一级混合标准溶液 1mL 于 10mL 容量瓶中，用 40%的甲醇水溶液定容至刻度，为多酚的二级
20、标准溶。分别取二标准溶液 0.1、0.2、0.4、1mL，一级标准溶液0.2、0.4、1mL 于 7 个 10mL 容量瓶中，用 40%的甲醇水溶液配置各级多酚类混合物标准溶液，进行 UPLC 分析，并对峰面积 (Y)与浓度(X，g/mL)进行线性回归分析，并进行 1/X 加权，得各酚的回归方程(表 4)。由此可见，在设定的浓度范围内，各酚的浓度与其峰面积都呈良好的线性关系。以信噪比为 3 计算检测限，均在 ng 级水平(表 4)，远远低于实际烟草样品中的多酚含量，说明本方法灵敏度较高。表 4 方法的线性回归方程、相关系数、线性范围、检测限成分 回归方程 r2线性范围（g/mL）检测限（ng/g）新绿原酸 Y=6.08103X-5.56101 0.9999 0.9696.0 24.02,4-o-咖啡奎尼酸 Y=6.81103X-6.65102 0.9997 0.9898.00 24.5莰菲醇基芸香苷 Y=6.62103X+1.73102 0.9997 0.10 10.18 50.91.2 回收率和精密度取 0.1g 相同烤烟烟末样品 10 份，分成 2 组，一组 5 份。其中一组按照样品前处理和色谱的实验条件平行测定 5 次，计算方法的重复性，另外一组样品分别加入表
