1、ICS 11.220B 41DB 37山 东 省 地 方 标 准DB37/T XXXXXXXXX鸭坦布苏病毒双抗体夹心 ELISA 检测方法Detection method on Duck Tembusu Virus by a double antibody sandwich ELISAXXXX-XX-XX 发布 XXXX-XX-XX 实施山 东 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB37/T XXXXXXXXXI前 言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东农业大学。本标准主要起草人
2、：刁有祥、陈浩、唐熠、提金凤、冯强、欧全宾。DB37/T XXXXXXXXX1鸭坦布苏病毒双抗体夹心 ELISA 检测方法1 范围本标准规定了鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA方法的样品采集和保存、样品处理、试剂及仪器、检测步骤、结果判定等。本标准所规定的鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA方法适用于检测鸭组织、分泌物、排泄物和鸭胚尿囊液中的坦布苏病毒，也适用于鹅和其他动物坦布苏病毒的检测。2 试剂及仪器2.1 试剂2.1.1 捕获单抗，抗坦布苏病毒 E 蛋白单克隆抗体。2.1.2 检测单抗，辣根过氧化物酶标记（HRP）的另一株抗坦布苏病毒 E 蛋白单克隆抗体，简称酶标单抗。2.1.3 阳性对照：坦
3、布苏病毒鸭胚尿囊液。2.1.4 阴性对照：SPF 鸭胚尿囊液。2.1.5 磷酸盐缓冲液（PBS），见 A.1。2.1.6 包被液，见 A.2。2.1.7 洗涤液，见 A.3。2.1.8 样品稀释液、封闭液，见 A.4。2.1.9 底物溶液，商品化 TMB 底物显色液。2.1.10 终止液，见 A.5。2.1.11 甘油盐水，见 A.6。2.2 仪器2.2.1 酶标仪。2.2.2 微量加样器。2.2.3 恒温培养箱。2.2.4 聚苯乙烯板。2.2.5 水平振荡器。2.2.6 生物安全柜。3 样品准备3.1 样品的采集和处理3.1.1 样品的采集DB37/T XXXXXXXXX2死亡鸭采集卵泡膜、
4、脾和脑等组织样品，进行分别处理或同时处理；活鸭采集咽喉或泄殖腔拭子。3.1.2 样品的保存样品应放在含有抗生素的pH值7.07.4的等渗磷酸盐缓冲液内（无PBS可用25 %50 %甘油盐水）。抗生素的选择视当地情况而定，组织和咽喉拭子悬液中应含有青霉素(2000 IU/mL)、链霉素(2 mg/mL)、庆大霉素(50 g/mL)和制霉菌素(1000 IU/mL)，加入抗生素后pH值应调至7.07.4。在室温放置1 h2 h内样品应尽快处理。不能尽快处理的可在4 存放24 h，也可于低温条件下保存(-70 贮存最好)。3.1.3 样品的处理样品的处理在生物安全柜中进行。喉头或泄殖腔拭子，置于20
5、0 L含有抗生素的pH值7.07.4等渗磷酸盐缓冲液中；对组织样品取0.2 g置于500 L含有抗生素的pH值7.07.4等渗磷酸盐缓冲液中研磨，反复冻融3次；8000 r/min离心5 min，取上清作为检测材料。4 操作步骤4.1 试验试剂预温到 20 25 。4.2 将捕获单抗用包被液稀释成 2.5 ng/L，每孔 100 L 加入 96 孔聚苯乙烯板中，4 孵育过夜。4.3 用洗涤液 100 L 洗 3 次，每次置于水平振荡器 300 r/min 震荡 3 min，甩干板上残余液体。4.4 每孔加入 200 L 封闭液，恒温培养箱 37 孵育 1 h，用 4.3 方法洗板。4.5 在
6、A1、A2 孔各加 100 L 阴性对照，A3、A4 孔各加 100 L 阳性对照。4.6 将待检样品加入其他各孔，每孔 100 L，恒温培养箱 37 孵育 1 h，用 4.3 方法洗板。4.7 将酶标单抗用样品稀释液按 1:1000 倍稀释，每孔加 100 L，37 孵育 1 h，用 4.2 方法洗板。4.8 每孔加 100 L 底物溶液，37 避光孵育 15 min。4.9 每孔加入 50 L 终止液，轻轻振荡，终止反应。4.10 置酶标仪于 450 nm 测定各孔吸光度（OD）值，该操作需 30 min 内完成。5 结果判定5.1 阴性对照 OD 均值等于（A1 孔 OD 值+A2 孔
7、OD 值）/2；阳性对照 OD 均值等于（A3 孔 OD 值+A4 孔OD 值）/2。5.2 阳性对照平均值减去阴性对照平均值，其差须大于 0.4；阴性对照平均值须小于等于 0.20。试验条件成立，否则重做。5.3 判定：5.3.1 阳性 样品液 OD450nm0.40，判断为阳性，即待检样品中含有坦布苏病毒。5.3.2 阴性 样品液 OD450nm0.20，判断为阴性，即待检样品中不含有坦布苏病毒。5.3.3 样品 样品液 0.20OD450nm0.40，判断为可疑，需要重做。DB37/T XXXXXXXXX3A A附 录 A（规范性附录）试剂配制A.1 磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L pH 7.4）NaCl 8.0gKCl 0.2gKH2PO4 0.2gNa2HPO412H2O 0.2g蒸馏水加至 1000 mLA.2 包被液（0.05 mol/L p H9.6）Na2CO3 0.2756 gNaHCO3 0.6216 g蒸馏水加至 100 mLA.3 洗涤液PBS 1000 mLTween-20 0.5 mLA.4 样品稀释液（封闭液）脱脂奶粉 5.0 g洗涤液 100 mLA.5 终止液H2SO4 （98%） 58 mL蒸馏水 442 mLA.6 50 %甘油盐水甘油 50 mLNaCl 0.9 g蒸馏水加至 100 mL_
