1、ICS 65.020.30B41DB 37山 东 省 地 方 标 准DB 37/ XXXXXXXXX鸭细小病毒感染诊断技术 第 1 部分：病毒分离鉴定Diagnostic techniques for duckparvovirus infection Part 1：Isolation and identification of duckparvovirusXXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施山 东 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB37/ XXXXXXXXXI前 言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准
2、由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东农业大学。本标准起草人：刁有祥、陈浩、唐熠、杨晶。DB37/ XXXXXXXXX1鸭细小病毒感染诊断技术 第 1 部分：病毒分离鉴定1 范围本标准规定了鸭细小病毒样品的采集与保存、病毒的分离和鉴定等的技术要求。本标准所规定的鸭细小病毒分离鉴定和PCR检测方法适用于鸭组织、分泌物、排泄物和病毒培养物中鸭细小病毒分离鉴定及其核酸检测。PCR方法还适用于该病的的实验室诊断、监测和流行病学调查等。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有
3、的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489 实验室生物安全通用要求GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫3 术语和定义下列定义和术语适用于本文件。3.1 鸭细小病毒 Duck parvovirus也称新型鹅细小病毒，是引起鸭短喙侏儒综合征的病原，该病以生长障碍，短喙、舌外露为特征。3.2 间接免疫荧光试验 Indirect immunofluorescence assay （IFA）用对应某一种抗原的抗体(这里被称为一抗)与细胞孵育结合，在采用对应一抗(也就是抗一抗)的抗体(这里被称为二抗，二抗上偶联有荧光素分子)与细胞孵育结合后在荧光显
4、微镜下观察，出现绿色荧光信号为阳性反应。3.3 原代鸭胚肝细胞 Duck embryo liver cell （DEL）采用胰酶消化法，用15日龄20日龄SPF鸭胚肝脏制备的原代细胞。4 实验室质量控制DB37/ XXXXXXXXX24.1 实验室符合 GB 19489 和 GB/T 27401 要求，实验室必须为生物安全级（BSL-2 级）及以上实验室。4.2 从事 PCR 工作的实验室尽可能分区，根据条件划分出前处理区、核酸提取区、核酸扩增区、电泳检测区，尽可能形成有效的物理隔离，且为单一流向，不得倒流。特别注意电泳后的琼脂凝胶要及时处理，避免对实验室造成污染。病毒分离区域的鸡胚接种操作区
5、和细胞培养操作区也应遵循一定的布局原则，避免交叉污染。4.3 注意个人防护和环境保护，电泳中用到的 EB 可诱发基因突变，试验中被 EB 污染的物品要有专用收集处，并通过适当的方式（如焚烧、或送有资质的医用垃圾处理公司）进行无害化处理。4.4 生物样品应严格控制对环境的污染，试验结束后应将相关样品收集高压灭菌后，送有资质的医用垃圾处理公司做最终处理。4.5 人员操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理、细胞培养和分子生物学实验室检测技术培训。熟悉生物样品处理、细胞培养、以及核酸提取、基因扩增等分子生物学技术。4.5.1 仪器设备a) 生物安全柜；b) PCR 仪；c) CO2恒温培养箱（3
6、7 恒温）；d) 台式低温高速离心机（最大转速 12000 r/min）；e) 电泳仪；f) 电泳槽；g) 紫外凝胶成像仪；h) 2C8C 冰箱；i) -20C 冰柜；j) 微量移液器（最大量程分别为 10L、20L、100L、1000 L），带滤芯的枪头；k) 孵化器（37恒温）；l) 水平摇床；m) 电子天平精度为：0.001 g；n) 电磁炉或微波炉。4.5.2 试剂和材料a) DNA 提取试剂盒；b) rTaqDNA 聚合酶(5 U/L)；c) 10PCR Buffer；d) dNTPs（2.5 mmol/L）；e) 1.5 %琼脂糖凝胶，见 A.1；f) 1TAE 缓冲液，见 A.2
7、；g) 溴化乙锭（10g/L），见 A.3；h) 核酸电泳加样缓冲液，见 A.4；i) DNA 分子量标准，要求在 100 bp2000 bp 之间，有 5 条以上的指示条带；j) 已知的鸭细小病毒液阳性对照标准品；k) 健康鸭组织或细胞作为阴性对照标准品；DB37/ XXXXXXXXX3l) 固定液，甲醇：丙酮=1:1（V/V）；m) FITC 标记的鼠抗兔荧光抗体；n) 细胞培养液（含 10 %胎牛血清的 DMEM 培养基）；o) 兔抗鸭细小病毒多克隆抗体；p) 细胞维持液（含 1 %胎牛血清的 DMEM 培养基）；q) SPF 鸭胚；r) PCR 检测引物：上游引物5455F：5-GAG
8、CATCAACTCCCGTATGTCC-3；下游引物5371R：5-CTACTTCCTGCTCGTCCGTGA-3；扩增目的片段长度为661 bp；引物浓度均为50mol/L。5 样品的采集和处理5.1 样品的采集采集死亡鸭肝脏、脾和脑等组织，分别处理或混合后进行处理；若是活鸭，则采集泄殖腔拭子。样品置于在密闭容器中冷藏运输，储藏温度不超过4，时间不超过24h。5.2 样品的保存5.2.1 室温条件下样品在 1 h2 h 内处理完毕，未能及时处理的样本在 4 冰箱中存放，不超过 24 h；也可于-20 低温条件下保存，不超过 30 d；-70 贮存最佳，不超过 1 年。5.2.2 组织研磨液和
9、泄殖腔拭子悬液置于-20 低温条件下保存，不超过 2 周；-70贮存不超过 30 d。5.3 样品的处理5.3.1 在生物安全柜中，取 10 g20 g 样品放入灭菌的研钵中，无菌条件下磨碎。5.3.2 用含有抗生素（青霉素(2000 IU/mL)、链霉素(2 mg/mL)、庆大霉素（50g/mL）和制霉菌素(1000 IU/mL)）等渗磷酸盐缓冲液（PBS，pH 值 7.07.4，附录 A.1）配成 10 %20 % (g/mL)的悬液；泄殖腔拭子悬液中抗生素浓度提高 5 倍。加入抗生素后 pH 调至 7.07.4。5.3.3 样本组织悬液反复冻融 3 次，经 8000 r/min 离心 1
10、0 min，取上清并置 4 过夜，次日接种SPF 鸭胚或原代鸭胚肝细胞。6 病毒分离6.1 鸭胚接种6.1.1 将处理后的样品上清，每份尿囊腔接种 9 日龄11 日龄 SPF 鸭胚 3 枚5 枚， 0.2 mL/胚， 37 孵化 120 h。6.1.2 弃去 24 h 内死亡胚，24 h120 h 内死亡和存活鸭胚置 4 冰箱过夜或-20 冷冻 1 h，分别无菌收集尿囊液并进行无菌检查，无菌尿囊液盲传三代。6.2 细胞接种6.2.1 将处理后的样品上清接种 80 %生长状况良好的单层原代鸭胚肝细胞，5 %CO 2、37 孵育 1 h，吸弃上清，用 PBS 缓冲液轻轻洗涤 2 次，吸弃后加入细胞
11、维持液。DB37/ XXXXXXXXX46.2.2 当 70 %以上单层细胞出现细胞病变时，将细胞培养物冻融后，转移至 2 mL 冻存管置于-70 保存，不超过 3 年。7 病毒鉴定7.1 间接免疫荧光法（IFA）7.1.1 细胞的固定取接种病毒60 h的鸭胚肝细胞（24孔细胞培养板），用PBS缓冲液轻轻洗涤3次4次，吸弃液体。加入预冷（-20 ）的甲醇：丙酮（1:1）固定液150L/孔没过单层细胞，置于-20 固定10 min，吸弃固定液，自然晾干后，用PBS缓冲液洗涤3 次。7.1.2 一抗孵育将兔抗细小病毒多克隆抗体用抗体稀释液（PBST，见附录B.3）作1:200稀释，每孔加入100L
12、，置于湿盒中37 孵育1 h。吸弃后用PBS洗涤3 次。7.1.3 二抗孵育加入1:200（抗体稀释液PBST）稀释的FITC标记鼠抗兔抗体（100L/孔），置于湿盒中4 孵育1 h。吸弃后用PBS缓冲液洗涤3 次。注意避光操作。7.1.4 封片观察加入数滴50 %甘油盐水封片（见附录B.2），置于倒置荧光显微镜下，观察是否有绿色荧光信号。7.2 PCR 检测7.2.1 DNA 提取用DNA提取试剂盒，并按试剂盒说明，提取样品和对照的DNA。提取的DNA应随时检测，否则应于-20 冻存。7.2.2 PCR 反应7.2.2.1 以提取的样品 DNA 为模板，用 PCR 进行扩增。7.2.2.2
13、PCR 反应体系：10PCR Buffer 2.5L、dNTPs（2.5mmol/L）2L、引物5455F（100mol/L）和 5861R（100mol/L）各 0.5L、DNA 模板 3L、rTaq DNA 聚合酶 0.25L，加 H2O 至 25L。7.2.2.3 PCR 反应条件：94 C 预变性 5 min；94 30 s、58 45 s、72 30 s，进行 30 个循环，72 延伸 10 min。7.2.3 PCR 产物电泳7.2.3.1 取 9L 样品与 1L 核酸电泳加样缓冲液混匀后，于 1.5 %琼脂糖凝胶中电泳，在位于凝胶中央的孔加入 DNA 分子量标准。7.2.3.2
14、加样后，按照 5 V/cm 电压，电泳 20 min40 min，当加样缓冲液中溴酚蓝电泳过半至凝胶下 2/5 处时，可停止电泳。7.2.3.3 置于凝胶成像仪下观察，根据分子量标准判断 PCR 扩增产物大小。7.2.4 对照设置每次检测，至少设置一个或一个以上的阴性对照标准品和阳性对照标准品。8 结果判定DB37/ XXXXXXXXX58.1 鸭胚肝细胞感染鸭细小病毒，细胞轻微聚集，IFA 检测出现绿色荧光信号。当阳性对照 IFA 检测显示出现绿色荧光信号，阴性对照未出现荧光信号时，检测结果成立，见资料性附录 C。8.2 样品检测孔出现绿色荧光信号表明样品中存在鸭细小病毒，阴性样品中无鸭细小
15、病毒。8.3 阳性对照出现预期长度的扩增条带，且阴性对照无此扩增条带时，判定检测有效；否则判定检测结果无效，不能进行判断。8.4 在阳性对照出现目的扩增条带，阴性对照无条带出现（引物二聚体除外）时，试验成立。PCR 检测结果为阳性表明样品中存在鸭细小病毒，检测结果为阴性时表明样品中不存在鸭细小病毒，见资料性附录 D。DB37/ XXXXXXXXX6A A附 录 A（资料性附录）相关试剂的配制A.1 1.5%琼脂糖凝胶的配制试剂类型 试剂含量琼脂糖 1.5 g0.5TAE 电泳缓冲液加至 100 mL微波炉中完全融化，待冷至50 60 时加入溴化乙锭（EB）溶液5L，摇匀。倒入电泳板上，凝固后，
16、取下梳子，备用。A.2 1TAE 电泳缓冲液的配制A.2.1 配制0.5 mol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na 2）溶液（pH8.0）试剂类型 试剂含量乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na 22H2O） 18.61g灭菌双蒸水 80.0mL氢氧化钠调 pH 至 8.0灭菌双蒸水加至 100mL用于配制A.2.2中的50TAE 电泳缓冲液A.2.2 配制50TAE 电泳缓冲液试剂类型 试剂含量羟基甲基氨基甲烷（Tris） 242 g冰醋酸 57.1 mLEDTA-Na2 溶液（pH8.0） 100 mL灭菌双蒸水加至 1000 mL用于配制A.2.3中的1TAE A.2.3 配制1TAE 电泳
17、缓冲液试剂类型 试剂含量50TAE 电泳缓冲液 20 mL灭菌双蒸水加至 1000 mLA.3 溴化乙锭的配制试剂类型 试剂含量溴化乙锭 20mg灭菌双蒸水加至 20 mLDB37/ XXXXXXXXX7A.4 核酸电泳加样缓冲液(10)试剂类型 试剂含量聚蔗糖 25g溴酚蓝 0.1g二甲苯青 0.1g灭菌双蒸水 100 mLDB37/ XXXXXXXXX8B B附 录 B（资料性附录）检测试剂的配置B.1 PBS溶液的配制：试剂类型 试剂含量NaCl 3.9 gNa2HPO412H2O 0.2 gKH2PO4 0.2 g双蒸馏水加至 1000 mLB.2 50 %甘油盐水试剂类型 试剂含量甘油 50 mLNaCl 0.9 g蒸馏水加至 100 mLB.3 PBST溶液的配制：试剂类型 试剂含量NaCl 3.9 gNa2HPO412H2O 0.2 gKH2PO4 0.2 g吐温-20 0.5 mL双蒸馏水加至 1000 mLDB37/ XXXXXXXXX9C C附 录 C（资料性附录）检测结果对照组图 C.1 检测结果对照组图注1：A：DEL细胞感染鸭细小病毒IFA检测结果；B：未感染对照组。DB37/ XXXXXXXXX10D D附 录 D（资料性附录）PCR 产物大小对照图 D.1 PCR 产物大小对照图注1：M为分子量标准；11为阴性对照，110为阳性对照。_
