1、ICS 65.020.30B 41 DB 37山 东 省 地 方 标 准DB 37/ XXXXXXXXX猪伪狂犬病毒环介导等温扩增检测技术Loop-mediated isothermal amplification for Pseudorabies VirusXXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施山 东 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB37/ XXXXXXXXXI前 言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准起草人
2、：李俊、时建立、彭喆、吴晓燕、张玲玲、郑书轩、徐绍建、孙文博、于江、丛晓燕、韩红、吴家强、杜以军、陈蕾、陈智、刘畅。DB37/ XXXXXXXXX1猪伪狂犬病毒环介导等温扩增检测技术1 范围本标准规定了猪伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus，PRV）的环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）检测技术的操作步骤。本标准适用于猪伪狂犬病毒的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。G
3、B/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 LAMP环介导等温扩增技术。3.2 Bst DNA Polymerase嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶。3.3 SDS十二烷基硫酸钠。3.4 4S Green Plus Nucleic Acid Stain无毒型核酸染色剂。4 材料及设备4.1 主要仪器设备4.1.1 微量移液器（最大量程分别为 10 L、20 L、100 L、1000 L），带滤芯的枪头。4.1.2 20000 r/min 低温高速离心机。DB37/ XXXXXXXXX24.1.3 电热恒温水槽。4.1.4 稳流稳压电泳仪。4.1.
4、5 水平电泳槽。4.1.6 凝胶成像系统。4.1.7 紫外透射反射分析仪。4.1.8 电磁炉。4.1.9 烧杯（1000mL）。4.1.10 电子天平 精度为：0.001g。4.2 主要试剂或材料4.2.1 5mol/L Betaine 溶液：配制见附录 A.1。4.2.2 Bst DNA Polymerase（8U/L）。4.2.3 SYBR Green 核酸染料。4.2.4 0.5TBE 缓冲液：配制见附录 A.2。4.2.5 2%琼脂糖电泳液：配制见附录 A.3。4.2.6 4S Green Plus Nucleic Acid Stain。4.2.7 DNA Marker 2000。4.
5、2.8 10%SDS 溶液：配制见附录 A.4。4.2.9 超纯水：符合 GB/T 6682，三级。4.2.10 引物猪伪狂犬病毒LAMP检测引物：F3： 5- ACGAGCCCCGCTTCCA -3。B3： 5- AGATGCAGGGCTCGTACA -3。FIP：5- AGACCACGCGCGCGGCATCAG-CTTCCACTCGCAGCTCTTCT-3。BIP：5- GAGAACTTCACCGCCACGCT-CGTAGTACAGCAGGCACCG-3。5 检测步骤5.1 样品采集与处理采集血清或淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等脏器。5.2 样品处理5.2.1 血清直接用于 DNA 提取
6、。5.2.2 淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等脏器各 1 g 剪碎放于灭菌的研磨器中磨碎，用生理盐水15 倍稀释，取悬液反复冻融 3 次，5000 r/min 离心 15 min，取上清液-20 保存备用。5.3 病毒 DNA 的提取5.3.1 取上清液（或血清）500 L 加入 10%SDS 溶液 50 L、20 mg/mL 蛋白酶 K 溶液 10 L，于55 水浴 2 h3 h。5.3.2 加入 200 L Tris 饱和酚，混匀，4 12000 r/min 离心 15 min。5.3.3 取上清液 500 L，加入 200 L Tris 饱和酚和 200 L 三氯甲烷，4 12000 r
7、/min 离心15 min。DB37/ XXXXXXXXX35.3.4 取上清液 400 L，加入 200 L 三氯甲烷，4 12000 r/min 离心 15 min。5.3.5 取上清液 300 L，加入 2 倍体积的无水乙醇，-20 静置 20 min，4 12000 r/min 离心15 min。5.3.6 弃上清液，加入 1 mL 70 %的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。5.3.7 加入 20 L 灭菌超纯水溶解沉淀，-20 保存备用。5.4 环介导等温扩增（LAMP）检测步骤5.4.1 环介导等温扩增反应体系配制，按表 1 中 18 的循序配制。表 1 环介导等温扩增反应体
8、系（25 L）体系组成 体系含量1 10ThermoPol 2.5 L2 dNTP混合液(10 mmol/L) 4.0 L3 B3/F3(5 mol/L) 0.15 L24 BIP/FIP(50 mol/L) 1.5 L25 Betaine(5 mol/L) 3.0 L6 DNA 1.0 L7 Bst DNA Polymerase(8 U/L) 1 L8 超纯水 10.2 L5.4.2 LAMP 程序设定每次LAMP均应设一个阳性对照和阴性对照，具体参数见表2表 2 LAMP 反应程序设定温度 时间1 63 60 min2 80 5 min5.5 电泳5.5.1 2%琼脂糖凝胶板的制备（见附录
9、 A.3）。5.5.2 加样将LAMP扩增产物5 L与1 L 6Loading Buffer混合，点样于1%琼脂糖凝胶孔中，以DNA Marker2000作相对分子质量指示。每次电泳加阳性对照和阴性对照的扩增产物作对照。5.5.3 电泳保持稳定电压80 V，电泳20 min，观察结果。6 结果判定6.1 电泳结果判定电泳反应结束后，如果阳性对照孔出现瀑布样条带，阴性对照孔不出现瀑布样条带，则试验成立。在试验成立条件下，出现瀑布样条带泳道的样品判为阳性（说明样品中含有猪伪狂犬病毒），不出现瀑布样条带泳道的样品为阴性（参见附录A.5）。DB37/ XXXXXXXXX46.2 可视化结果判定6.2.
10、1 LAMP 反应体系中加入 1 L SYBR Green 核酸染料，混匀（加深观察颜色），阳性反应管内液体变为黄色，阴性反应管不发生颜色变化，为橘红色（参见附录 A.6）。6.2.2 反应管置于紫外透射反射分析仪下，阳性反应管发出明亮的黄绿色荧光，阴性反应管不显现荧光（参见附录 A.7）。DB37/ XXXXXXXXX5A A附 录 A（规范性附录）试剂的配制A.1 5mol/L Betaine溶液Betaine 1.4644 g。灭菌超纯水 2.5 mL。A.2 0.5TBE缓冲液Tris 108 g。Na2EDTA.2H2O 7.44 g。 硼酸 55 g。灭菌超纯水 定容至1 L，配成
11、10TBE缓冲液。取10TBE缓冲液25 mL，加灭菌水475 mL，制成0.5倍的工作液。A.3 2%琼脂糖电泳液琼脂糖 1.2 g。0.5TBE缓冲液 60 mL。A.4 10%SDS溶液SDS 1 g。灭菌超纯水定容至 10 mL。A.5 LAMP反应电泳检测结果DB37/ XXXXXXXXX6M：DL-2000；1、2、3、5、6：PRV阳性样品；4、7：PRV阴性样品；P：Positive control；N：Negative control。A.6 LAMP反应肉眼观察的可视化结果1：Positive control ；2：PRV 阳性反应管；N：Negative control。A.7 LAMP反应紫外透射反射分析仪下可视化结果1：Positive control ；2：PRV 阳性反应管；N：Negative control。_
