1、ICS 11.220B 41DB 37山 东 省 地 方 标 准DB37/T XXXXXXXXX禽波氏杆菌免疫荧光检测技术规范Technical Guideline of Immunofluorescent Test of Bordetella aviumXXXX-XX-XX 发布 XXXX-XX-XX 实施山 东 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB37/T XXXXXXXXXI前 言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准由山东农业大学、山东省动物疫病预防与控制中心负责起草。本标准主要起草人：朱瑞
2、良、胡莉萍、魏凯、黄河、杨萍萍、孙振红、彭军、张华杰、万吉国。DB37/T XXXXXXXXX1禽波氏杆菌免疫荧光检测技术规范1 范围本规范规定了禽波氏杆菌病间接免疫荧光检测技术的试剂或材料、仪器设备、禽波氏杆菌外膜蛋白（OMP）的提取、禽波氏杆菌OMP含量测定、禽波氏杆菌外膜蛋白（OMP）抗血清的制备、阴性血清制备、禽波氏杆菌免疫荧光检测方法和判定标准。本规范适用于山东省境内从事家禽饲养以及从事家禽防疫活动的单位和个人禽波氏杆菌检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单
3、）适用于本文件。GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 14925 实验动物 环境及设施3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 蛋白定量Bradford法 Bradford method for protein quantitation考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488 nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质色素结合物在595 nm波长下有最大光吸收，其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2 min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下
4、1 h内保持稳定。该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应灵敏，可测定微克级蛋白质含量。3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS，即十二烷基硫酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素），可以用于分离蛋白质和寡核苷酸。3.3 免疫荧光试验 immunofluore
5、scence testDB37/T XXXXXXXXX2是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。4 试剂或材料4.1 禽波氏杆菌禽波氏杆菌P5株，购自中国兽医药品监察所。4.2 抗体异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗兔IgG。4.3 生化试剂邻苯二胺(OPD)、聚乙二醇辛基苯基醚（Tri-tonX-100）、考马斯亮兰G-250、牛血清白蛋白（BSA）、不完全弗氏佐剂、丙酮（分析纯）、乙醇（分析纯）、甘油（分析纯）。5 仪器设备5.1 超净
6、工作台。5.2 恒温培养箱。5.3 超速冷冻离心机。5.4 蛋白电泳仪。5.5 微量移液器（20 L100 L）。5.6 电子天平。5.7 超声波破碎仪。5.8 旋涡混合器。5.9 分光光度计（380 nm780 nm）。5.10 荧光显微镜。6 禽波氏杆菌外膜蛋白（OMP）的提取6.1 将保存的禽波氏杆菌株接种于 200 mL 肉汤培养基中，37 振荡培养过夜后，离心收集过夜培养的细菌。肉汤培养基配制按附录 A 执行。6.2 用 10 倍体积的含有 10 mM MgCl2的 Tris-HCl（100 mM pH7.8）缓冲液悬浮，超声波破碎（功率为 500 W、破碎时间 60 s、间隙 60
7、 s、反复破碎 10 次）。Tris-HCl 缓冲液配制按附录 A 执行。6.3 通过 1000g 低速离心去除细胞核，上清液高速离心，10000g，20 min。6.4 含全膜蛋白的沉淀，用同体积的含 2 % Triton X-100 的 Tris-MgCl2缓冲液溶解，室温下孵育 30 min 降解内膜蛋白后，再进行 100000g，30 min 超速离心。6.5 沉淀用缓冲液再悬浮，置-20 保存备用。6.6 SDS-PAGE 电泳检测禽波氏杆菌外膜蛋白 OMP 的分子量。7 禽波氏杆菌 OMP 含量测定DB37/T XXXXXXXXX37.1 考马斯亮蓝法7.1.1 取 16 支试管，
8、1 支作空白对照，3 支用于检测禽波氏杆菌 OMP 样品，其余 12 支试管分为两组，每组 6 支，用于绘制标准曲线。7.1.2 用移液器向每组 6 支试管中各加入 1.0 mg/mL 的标准蛋白质溶液各 0.01 mL、0.02 mL、0.04 mL、0.06 mL、0.08 mL、0.1 mL，然后用去离子水补充到 0.1 mL。7.1.3 各试管中分别加入 5.0 mL 考马斯亮兰 G-250 试剂，立即在旋涡震荡器上混匀；空白对照管为0.1 mL 水与 5.0 mL 考马斯亮兰 G-250 试剂的混合液。7.1.4 加完试剂 2 min5 min 后，用塑料或玻璃比色皿在分光光度计上测
9、定各样品在 595 nm 处的吸光值 OD595。7.1.5 用标准蛋白质量（mg）为横坐标，吸光度值 OD595为纵坐标，绘制标准曲线。根据检测样品的OD595值，计算样品中 OMP 的含量。7.2 考马斯亮蓝微量法7.2.1 样品中蛋白质浓度较稀时（10 mg/mL100 mg/mL）采用微量法检测。7.2.2 每支试管的蛋白溶液量加大到 1.0 mL，加考马斯亮蓝 G-250 试剂 5.0 mL，根据测定的 OD595值绘制标准曲线，计算样品中禽波氏杆菌 OMP 的含量。7.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳7.3.1 分别配制 SDS-聚丙烯酰胺分离胶和浓缩胶，安装垂直电泳装置。分离胶和浓
10、缩胶配制按附录A 执行。7.3.2 用移液器将 OMP 样品加至加样孔，进行电泳。7.3.3 电泳结束，用考马斯亮蓝 R250 对蛋白胶进行染色，检验禽波氏杆菌 OMP 的提取效果。8 禽波氏杆菌外膜蛋白（OMP）抗血清的制备8.1 将提取的禽波氏杆菌 OMP 蛋白液与弗氏不完全佐剂混合（V:V=1:1），用漩涡振荡器乳化，制备禽波氏杆菌 OMP 免疫用抗原。.8.2 选取体重 2.5 kg 的健康青紫兰家兔 4 只，颈背部皮下注射免疫 OMP 抗原，共免疫 4 次，每次间隔 1 周，OMP 免疫剂量为 320 g/只/次。实验兔的饲养符合 GB 14925 的要求。8.3 最后 1 次免疫后
11、 7 d 采血，检测兔血清中禽波氏杆菌抗体的凝集价，凝集价高于 1:256 以上时采血，分离血清，-20 保存备用。9 阴性血清制备采集未免疫的健康青紫兰兔血液，制备阴性血清。10 禽波氏杆菌免疫荧光检测方法10.1 被检禽波氏杆菌涂片的制备10.1.1 组织涂片的制备DB37/T XXXXXXXXX4取临床疑似禽波氏杆菌病的鸡肝脏组织进行涂片，自然干燥后，用冷丙酮固定15 min，用灭菌PBS（配制方法见附录A）洗涤34次，风干。10.1.2 阴、阳性组织涂片的制备用移液器吸取5 L培养基培养的禽波氏杆菌菌液进行涂片，自然干燥后，用冷丙酮固定15 min，用灭菌PBS洗涤34次，风干。正常肝
12、脏组织涂片作为阴性对照。10.2 检测方法10.2.1 向涂片中滴加 1:10 倍稀释的禽波氏杆菌 OMP 抗血清 100 L，置于 37 湿盒中孵育 30 min，用 PBS 洗涤 3 次。10.2.2 加 1:100 倍稀释的异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗兔 IgG 二抗，置于 37 湿盒中孵育30 min，用 PBS 洗涤 3 次。10.2.3 用吸水纸吸干后滴加甘油，将涂片置于荧光显微镜下观察。11 判定标准11.1 结果有效性阳性对照呈现明显的黄绿色荧光，阴性对照无黄绿色荧光，则检测结果有效。11.2 结果判定荧光显微镜中出现黄绿色荧光，判为阳性，用“+”表示；未出现黄绿色荧光
13、，判为阴性，用“”表示。阴阳性判定结果按附录B执行。DB37/T XXXXXXXXX5A A附 录 A（资料性附录）溶液的配制A.1 SDS-PAGE电泳浓缩胶和分离胶的配制A.1.1 5%浓缩胶配制表 A.1 5%浓缩胶配方成分 配制不同体积 SDS-PAGE 浓缩胶所需各成分的体积（mL）5%浓缩胶 2 3 4 6 8 10水 1.4 2.1 2.7 4.1 5.5 6.830%Acr-Bis（29:1） 0.33 0.5 0.67 1.0 1.3 1.71M Tris（pH6.8） 0.25 0.38 0.5 0.75 1.0 1.2510%SDS 0.02 0.03 0.04 0.06
14、 0.08 0.110%过硫酸铵 0.02 0.03 0.04 0.06 0.08 0.1TEMED 0.002 0.003 0.004 0.006 0.008 0.01A.1.2 12%分离胶配制表 A.2 12%分离胶配方成分 配制不同体积 SDS-PAGE 分离胶所需各成分的体积（mL）12%分离胶 5 10 15 20 30 50水 1.0 2.0 3.0 4.0 6.0 10.030%Acr-Bis（29:1） 2.0 4.0 6.0 8.0 12.0 20.01.5M Tris（pH8.8） 1.9 3.8 5.7 7.6 11.4 19.010%SDS 0.05 0.1 0.15
15、 0.2 0.3 0.510%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.012 0.02A.2 禽波氏杆菌免疫荧光检测相关试剂的配制A.2.1 1 mol/L PBS（pH 7.2）的配方氯化钠 8.0 g氯化钾 0.2 g磷酸氢二钠 1.44 g磷酸二氢钾 0.24 g双蒸水 定容至1000 mLDB37/T XXXXXXXXX6A.2.2 普通肉汤培养基的配方蛋白胨 10 g牛肉膏粉 3 g氯化钠 5 g最终pH 7.40.2A.2.3 1 mol/L Tris-Hcl缓冲液（pH 7.8）的配制Tris 碱 121.1 g浓盐酸（1 mol/L HCl） 42.0 mL双蒸水 定容至1000 mL在900 mL双蒸水中加入121.1 g Tris 碱，溶液冷却至室温后调节溶液pH值至8.0，然后定容至1000 mL，分装后1.03410 5高压灭菌30 min，室温保存。实验室用水应符合GB/T 6682的要求。试验中配制试剂应符合GB/T 603的要求。DB37/T XXXXXXXXX7B B附 录 B（规范性附录）阴阳性判定结果B.1 禽波氏杆菌免疫荧光检测结果阴阳性对照阳性对照（ 1000） 阴性对照（1000）_
