1、ICS 65.150B 51DB 37山 东 省 地 方 标 准DB37/ XXXXXXXXX鲟鱼人工繁殖技术规程Specification of Artificial propagation Techniques on SturgeonXXXX-XX-XX 发布 XXXX-XX-XX 实施山 东 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB37/ XXXXXXXXXI前 言本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由山东省海洋与渔业厅提出。本标准由山东省渔业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省淡水
2、渔业研究院。本标准主要起草人：陈有光、于振海、卢红、王玉新、郑玉珍、轩子群。DB37/ XXXXXXXXX1鲟鱼人工繁殖技术规程1 范围本标准规定了鲟鱼人工繁殖的环境条件、亲鱼培育、人工催产、精液采集与保存、鱼卵采集、人工授精、脱粘、孵化、出苗及疾病防治等操作规范。本标准适用于施氏鲟、西伯利亚鲟、鲟鳇杂交种的苗种人工繁育，其他鲟鱼种类可参照使用，匙吻鲟不适用。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 11607 渔业水质标准NY 5071 无公害食品 渔用
3、药物使用准则NY 5072 无公害食品 渔用配合饲料安全限量SC/T 1086 施氏鲟养殖技术规程3 环境条件3.1 场地环境亲鱼培育池应为流水、微流水池塘。长方形池塘，面积200 m 2500 m 2，池深1.2 m1.5 m；或圆形池塘，直径7 m8 m，池深1.2 m1.5 m，池底中央排水，池塘坡度不大于1:20。3.2 水质要求水源充足，每口池塘应设有独立的给排水系统；水质应符合GB 11607的规定，其中养殖水中溶氧大于5 mg/L。4 亲鱼培育4.1 亲鱼来源来自于持有国家发放的良种生产许可证的良种场人工养殖的鲟鱼。不得使用近亲繁殖的后代作亲本。4.2 亲鱼要求4.2.1 形态特
4、征、可数与可量性状亲鱼外部形态特征、可数与可量性状可参考SC/T 1086。DB37/ XXXXXXXXX24.2.2 繁殖年龄和体重允许作为繁殖用亲鱼的最小年龄和最小体重可见表1。表 1 繁殖用亲鱼的最小年龄和最小体重亲鱼性别 性腺成熟年龄，龄 允许繁殖的最小年龄，龄 允许繁殖的最小体重，kg雌/ 7 8 10雄/ 4 5 5.54.2.3 雌鱼选择性成熟的个体胸腹部浑圆柔软而有弹性，腹部凹陷钩状，生殖孔红润外突，也可用挖卵器从雌鱼体内取出卵子，目测卵呈灰黑色、椭球形，用卡尺量卵径长轴和短轴均大于2.75 mm，挑选鱼卵极化指数小于1/20的雌鱼用于催产。鱼卵极化指数参见附录A。4.2.4
5、雄鱼选择性成熟的个体胸腹部平整坚硬，在发情期或生殖期生殖孔较紧不外突，两侧轻挤压有乳白色的精液流出；也可穿刺取性腺，目测性腺呈白色或乳白色，显微镜压片检测可见到精子。4.3 亲鱼放养4.3.1 专池培育经选择达到可以进行繁殖的亲鱼，可雄雌单性专池培育，也可以雄雌混养。利用自然或者机械降低亲鱼养殖池水温到10 以下、维持1个月以上，然后每天逐步升温小于3 ，将水温提升至15 ，亲鱼性腺发育达到期的时候，可进行人工催产。鲟鱼性腺分期方法参见附录B。雄雌亲鱼分开单独放养，等待人工催产。产后亲鱼要单性专池培育。4.3.2 单性培育4.3.2.1 放养密度雌、雄亲鱼应分池，进行单性培育。雌亲鱼放养规格在
6、10 kg15 kg，亲鱼池放养密度为5 m210 m 2水面1尾。；雄亲鱼放养规格在5.5 kg12 kg，亲鱼池放养密度为2.5 m 25 m 2水面1尾。4.3.2.2 水体交换产卵季节池水交换不小于1次/6 h，其他季节池水交换不小于1次/24 h。4.4 亲鱼投喂4.4.1 饵料可以使用鲜活饵料或配合饲料，鲜活饵料宜用鱼、虾、螺、蚌等。应切碎、除壳后投喂。饲料应该新鲜，安全质量应符合NY 5072的规定，腐败变质的饲料不应使用。4.4.2 投喂次数和投饲量亲鱼入池后，即应投饲。每天早、晚各1次，配合饲料的日投饲量为亲鱼体重的0.5 %1.0 %。根据摄食情况进行调整。DB37/ XX
7、XXXXXXX34.5 日常管理亲鱼培育期间应加强管理，做好以下工作：每天早、晚巡池 2 次。注意观察亲鱼活动情况，做好饲养记录，发现问题及时解决。产卵亲鱼应做标记，建立档案，记录亲鱼的产卵时间和年龄，卵的质量和数量，受精卵孵化率及鱼苗成活率。加强鱼病的防治，方法可见附录 C。5 人工催产5.1 药物种类人工催产药物可选用促黄体素释放激素类似物（LRH-A）单独使用，或者促黄体素释放激素类似物（LRH-A）和地欧酮（DOM）混合使用。5.2 注射剂量雌鱼：每千克鱼体重LRH-A用量为30 g100 g；或每千克鱼体重LRH-A用量为30 g100 g混合DOM 1 mg2 mg。雄鱼：每千克鱼
8、体重LRH-A用量为20 g50 g。5.3 注射次数雌鱼一般为两次注射，第一次注射10 %的剂量，10 h12 h后注射90 %的剂量；雄鱼一次注射，在雌鱼第二次注射前2 h6 h注射。5.4 注射方法注射部位有背鳍基部肌肉注射和胸鳍基部注射两种方法，背鳍基部注射采用较多。进针深度1.0 cm1.5 cm。注射操作完成后拔针头时，应用手指轻轻按住注射处使药物尽量不外流。6 精液采集与保存6.1 采集时间注射催产药物8 h10 h开始检查雄鱼，轻压雄鱼腹部时发现乳白色精液流出，镜检精子快速运动时间不低于30 s，即可开始采集精液。初次采集后每隔2 h3 h检查并采集1次，一般可以采集3次4次。
9、6.2 采集方法6.2.1 采集工具消毒所有使用的采集工具均需消毒。6.2.2 导管吸出法将医用导管与医用注射器前端相连，用干燥毛巾将生殖孔周围体表擦干；轻压腹部有少量精液排出时，将导管深入雄鱼生殖孔内，用注射器抽取精液。宜使用内径3 mm、长度5 cm的医用导管和100 mL的医用注射器。DB37/ XXXXXXXXX46.3 精液保存将取出的精液移入干燥烧杯中，封口后放入冰箱0 4 保存。采出后和使用前的精液均用显微镜进行精子活力检测。7 鱼卵采集7.1 鱼卵采集时间雌鱼催产药物注射4 h后，应每隔1 h检查1次亲鱼，当接近排卵时，应30 min检查1次。当雌鱼出现排卵时，游动活跃，不时撞
10、击水面，卵巢有流动现象，有卵粒涌出，即可采卵。采卵时间掌握在排卵开始的90 min左右，不宜超过150 min，否则影响受精率。7.2 挤压法用干燥毛巾擦干生殖孔周围，挤压腹部两侧，将鱼卵挤入干燥容器内。挤压法采卵需间隔1 h2 h多次采集，直到挤压腹部无鱼卵排出为止。7.3 微创手术法7.3.1 手术工具消毒所有使用工具均应消毒。7.3.2 手术方法使用间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（MS-222）100 mg/L或丁香酚50 mg/L麻醉雌鱼，然后固定在操作台上，用75 %酒精消毒腹部，用手术刀在距生殖孔前方10 cm左右的腹部中线一侧切一个3 cm5 cm切口，从鱼体腹部两侧由头部向尾部反复挤
11、压，将鱼卵从切口处挤出，直至很少的卵粒从开口处流出为止。然后，在开口处向鱼体内灌入生理盐水，每次加入500 mL1000 mL，挤压鱼体腹部，排出体内剩余的游离成熟鱼卵，反复23次再也挤不出鱼卵后，可结束人工采卵工作。7.3.3 切口缝合方法鱼卵全部取出后，用聚丙烯丝线缝合切口，手术切口采用交叉针法、8针4结缝合，并对缝合部位用碘酊和70 %乙醇消毒。整个手术用时需控制在50 min内。术后亲鱼放入暂养池饲养恢复。恢复期间水温13 17 ，溶解氧8 mg/L10 mg/L。每日现察鱼的活动情况，第3天检查一次切口愈合情况。7.3.4 手术后雌鱼护理缝合后给雌亲鱼注射抗生素药物，把受伤雌鱼放入专
12、门护理水泥池中，每日注射抗生素，剂量为每千克亲鱼体重50万单位80万单位青霉素，持续时间为10 d左右。亲鱼手术后15 d内每天检查亲鱼刀口，检查刀口恢复情况和缝合线是否脱落等。同时投喂适口的人工配合饲料，并注意保障养殖用水的清新。8 人工授精8.1 精液密度DB37/ XXXXXXXXX5根据精液浓度及精子活力确定使用精液体积，精子的质量体积比为1.13 g/mL。8.2 精液用量每千克鱼卵使用精液为10 mL20 mL。8.3 授精方法根据鱼卵总量，计算需要的精液量。将精液经镜检后与鱼卵混合，用羽毛搅拌均匀后，按1千克鱼卵加水1千克再搅拌3 min5 min进行人工授精，避光操作。9 脱粘
13、使用医用滑石粉配成20 %30 %的滑石粉悬浊液，将受精卵倒入含有该溶液的容器内，用手工或脱粘装置宜搅动40 min60 min，轻轻搅动受精卵直至受精卵分散呈颗粒，静置不结块。每千克受精卵使用10 L15 L滑石粉悬浊液。为防止缺氧，搅动20 min30 min后，更换一次滑石粉悬浊液。10 孵化10.1 孵化装置选用麦克唐纳瓶式孵化器，孵化器应架设水槽，使孵出鱼苗直接流入集鱼箱或鱼苗培育池。10.2 孵化条件10.2.1 温度保持水温15 16 。10.2.2 溶氧溶氧不小于6 mg/L。10.2.3 光照避免阳光直射。10.2.4 孵化用水经过不小于150目的筛绢过滤，避免将敌害生物带入
14、。10.3 孵化方法10.3.1 孵化方式流水孵化。10.3.2 孵化密度水的流量3O L/min，可孵化32 kg受精卵，约32510 4粒。10.3.3 孵化时间DB37/ XXXXXXXXX6受精卵孵化6 d1 d开始出苗；温度越低，孵化时间越长。10.4 孵化管理10.4.1 日常管理孵化期间应有专人值班，观察检查孵化设备的运转情况，鱼卵的发育状况，及时清除死卵、坏卵，防止水霉生成。检查与清洗滤水设备，保持滤水流畅。做好值班记录。计数出膜的鱼苗，并将其及时移入鱼苗培育池。10.4.2 水霉控制孵化期间应及时拣出死卵。水霉病的防治见附录C。10.4.3 受精率统计在鱼卵发育到原肠中后期时
15、，开始统计受精率。11 疾病防治11.1 防治原则坚持以预防为主、防治结合、防重于治的原则。11.2 防治药物的使用应按NY 5071的规定执行，并按水产养殖质量安全管理规定做好有关记录。11.3 主要疾病的防治主要疾病的防治可见附录C。DB37/ XXXXXXXXX7A A附 录 A（资料性附录）鲟鱼卵极化指数的计算方法成熟卵细胞呈椭球形、黑灰色。用挖卵器从雌鱼体内取出卵子，将卵子放入水中煮2 min3 min，将鱼卵放在通风、阴凉的地方，待表面干燥后，用刀片沿卵的长轴切开，计算极化指数。极化指数计算方法见公式（1）。.(附 录 A.1)21lPI式中：PI 极化指数；l1 鱼卵动物极到卵核
16、的最短距离；l2 鱼卵动物极到植物极的距离。DB37/ XXXXXXXXX8B B附 录 B（资料性附录）鲟鱼雌性性腺发育分期方法B.1 第期卵巢卵巢呈白色半透明窄带状，肉眼看不见卵粒，辨认不出卵巢与精巢。切片可见到卵巢中的生殖细胞是以第期的卵原细胞为主，细胞质很少，细胞直径在10 m60 m，最小的卵原细胞直径10 m，细胞核直径7.5 m，细胞核大占据了卵原细胞的大部分体积，核直径为7.5 m38.5 m，核内染色质呈丝状均匀分布，又可称染色质核期。细胞核内只见核质还没有核仁出现。B.2 第期卵巢卵巢乳白色中略见淡淡黄色，肉眼可见半透明状针眼大的卵粒，低倍光镜下能见到丰富的脂肪组织包裹着卵
17、巢，卵巢表面分布着大小不同的卵。切片观察，卵巢组织内也有大量的脂肪，占卵巢整体的大部分。卵巢中的生殖细胞是以第期卵巢的初级卵母细胞小生长期的细胞为主，细胞呈多角圆形，初级卵母细胞直径为60 m200 m，细胞质增多并呈嗜碱性，核也相应增大，核直径为38.5 m82.5 m，核仁(7个26个)靠近核膜内侧环形分布，也可称为外周核仁期。部分细胞质可见到网状结构。初级卵母细胞外面已有滤泡膜。随着初级卵母细胞的生长发育，细胞质的嗜碱性减弱，少部分初级卵母细胞很大，卵径在400 m左右。B.3 第期卵巢卵巢有浅灰色和深褐色两种，表面分布着浅灰色或深褐色卵粒，卵巢组织内仍有大量的脂肪。卵巢内生殖细胞是以第
18、期进入大生长期的初级卵母细胞为主，可以分为早、中、晚3个相的发育阶段。初级卵母细胞的早期，细胞直径在200 m500 m之间，细胞质占细胞体积的大部分，嗜碱性减弱，细胞质有颗粒物质并形成环层，脂肪滴出现在核的外周。核仁数量明显增加(29个35个)，核膜内侧环形排列，与细胞质相比核已小得多了。中期，卵细胞直径在500 m900 m，细胞膜有完整的3层结构，卵黄颗粒在细胞质外环出现，脂肪滴数量增加并向细胞质外环移动，卵巢中卵细胞进行有丝分裂，数量大大增加。晚期，细胞直径为900 m1600 m，细胞为椭圆形，随着卵细胞的生长发育，核仁数量迅速增加（200个400个），同时卵黄颗粒的数量也在增加，卵
19、黄颗粒体积加大成为卵黄小体，分布于细胞质的大部分区域，由卵黄颗粒的分布使细胞质分成5层，靠近细胞膜和核的2窄层为无卵黄颗粒分布层，靠这2窄层的2层是小颗粒层，中间是大颗粒层，细胞质最外层出现色素颗粒。此期细胞核在中央没有发生极化。B.4 第期卵巢卵巢灰黑色，体积很大，卵巢重是亲鱼体重的15 %20 %。DB37/ XXXXXXXXX9卵巢内生殖细胞是以第期发育晚期的初级卵母细胞为主，细胞体积增大，长轴直径为1600 m3300 m左右。根据卵母细胞直径的大小和核偏移的情况，发育晚期的初级卵母细胞又可划分为早、中、晚3个发育阶段。早期，卵母细胞长轴为1600 m2000 m，细胞质分5层，卵黄小
20、体聚集成卵黄小板和大的脂肪滴分布在中间层，并偏向长轴的一侧，靠细胞膜的小卵黄颗粒层内出现色素颗粒，核位于中心，核膜消失，核仁移向中央，均匀分布并被无卵黄颗粒的细胞质环绕。中期，卵母细胞长轴为2000 m2600 m，细胞核开始由中央直接呈三角形状移向动物极，不含卵黄的细胞质也随着卵核向受精孔方向移动，卵母细胞进入成熟期。细胞质的5层分布消失，卵黄小板和脂肪滴集中在细胞质外周和植物极，卵黄颗粒和脂肪滴充塞了卵母细胞的大部分体积。晚期，卵母细胞长轴为2600 m3300 m，核仁完全溶解在核浆中，核向动物极的卵膜靠近。卵膜在切片上可见3层结构。卵膜外附着薄膜状，松散起伏不平的是滤泡膜。卵膜最外层为
21、胶膜或蜂窝膜，中间为卵黄外膜，里侧是卵黄内膜。3层膜都有相对应的辐射纹，卵黄内膜很薄，与卵黄外膜紧密结合。3层卵膜中最厚的是胶膜，卵黄外膜较胶膜略薄，卵黄内膜最薄。晚期的初级卵母细胞的卵膜，较大生长期的初级卵母细胞的卵膜明显增厚，约35 m40 m。根据细胞核偏移情况将该期卵母细胞分为早、中、晚3个发育阶段。当卵细胞发育到中期阶段时，细胞核向动物极移动，开始极化。到IV期末，核极化到PI值小于0.1左右，可以进行人工催产繁殖。B.5 第期卵巢卵巢松软，成熟卵细胞从滤泡膜内释放，直接落入腹腔。鲟成熟卵细胞呈椭球形，有长轴和短轴，长轴3.40 mm3.72 mm、短轴3.00 mm3.16 mm，
22、每粒卵重约0.022 g，卵黑灰色。动物极顶端有一浅色亮点，为极斑，极斑被深浅相间的环所环绕，为极环。卵的极环到极斑约占卵体的1/3。第期的卵母细胞，是由初级卵母细胞经过第一次成熟分裂成为次级卵母细胞，进而发育到第二次成熟分裂中期的成熟卵细胞，细胞核呈一团的核质状，卵细胞的原生质集中在核周围，形成胚盘原基，并接近受精孔。细胞膜的辐射纹消失。B.6 第期卵巢第期卵巢的卵已经产出，卵巢松弛，充血，呈红色或紫红色。未产出的卵会退化凋亡被鱼体吸收，卵巢内除少量残留第IV期卵母细胞外，主要为第期的初级卵母细胞、大量的空滤泡和发达的结缔组织。DB37/ XXXXXXXXX10C C附 录 C（资料性附录）
23、常见鲟鱼病害及防治方法表 C.1 常见鲟鱼病害及防治方法病名 病原 症状 防治方法小瓜虫病 小瓜虫病（Ichthyophth-iriasis）鱼体的躯干、头、鳍、鳃、口腔等处都布满小白点，同时伴有大量黏液，患病鱼体消瘦，行动缓慢，经常与池壁或池底摩擦。用显微镜可确诊。用 150 mL/L 福尔马林在培育池中处理 30 min，需连续处理数次，每天 1 次；或全池遍洒亚甲基蓝，使池水成 2 mg/L浓度，连续数次，每天 1 次。车轮虫病车轮虫（Trichodina spp）和小车轮虫（Trichodinclla spp）属缘毛目、游动亚目（Moleilina） 、壶形科（Urceolavvida
24、l）主要寄生在鱼苗的体表与鳃上，少量寄生时，无明显症状，严重感染时，引起寄生处黏液增多，鱼苗游动缓慢，引起鱼不安，行为异常。用显微镜可确诊。用食盐水进行药浴；或全池遍洒福尔马林，使池水福尔马林浓度达到 30 mL/L，1 h 后换水。细菌性肠炎肠型点状产气单孢杆菌（Enterobacter aerogenes）病鱼行动迟缓，不摄食，腹部有时膨大，体色变黑，肛门红肿、并伴有黄色或淡红色液体流出，病情严重的鳍基充血，剖开鱼腹，可见腹腔积水，肠管红肿充血发炎，肠内无食物，有乳黄色黏液或血脓。一般在水质恶化、饲料变质、或食物携带致病菌引发。预防：保持水质清新，投喂饲料质量好，没变质。治疗：每 100
25、kg 饲料加大蒜 250 g 拌料，连续投喂养 3 d5 d。指环虫 指环虫（Dactylogyrus spp）主要寄生在小体鲟的体表与鳃上，少量寄生时无明显症状，大量寄生时，可引起鱼的鳃丝肿胀、充血，鳃上有大量黏液，病鱼呼吸困难，游动缓慢而死。鳃上组织损伤，呼吸上皮细胞及黏液细胞增生，分泌物增多，急性型病鱼鳃的毛细血管充血，渗出，嗜酸粒细胞和淋巴细胞浸润严重，呼吸上皮细胞肿胀，脱离毛细血管，严重时鳃小片坏死，解体一大片；附近的软骨组织发生变性。用显微镜可确诊。放养前用 1.5%2.0%食盐水洗浴 5 min 10 min；全池遍洒晶体敌百虫，使池水浓度达到 0.3 mg/L0.5 mg/L。水霉病 水霉菌（Saprolegnia）最为常见。水温在 1020流行。病鱼在水中焦躁不安，体表生长成丛，像一团灰白色绒毛。寄生部位有腐烂现象，体表多粘液，卵成“太阳籽” 。病重的鱼游动迟缓，消瘦。在孵化初期，每日用亚甲基蓝 5 mg/L 浸泡鱼卵 15 min；在接近鱼卵破膜时停止浸泡。鱼卵破膜 80 h 后，每日用亚甲基兰 0.5 mg/L 浸泡鱼苗。药物使用与休药期应符合NY/T 5071的规定；饲料安全质量应符合NY 5072的规定。_
