1、ICS 65.020.30B41DB 37山 东 省 地 方 标 准DB 37/ XXXXXXXXX猪伪狂犬病病毒 gE 基因 PCR 检测技术PCR Assay for Detection of Pseudorabies virus gE geneXXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施山 东 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB37/ XXXXXXXXXI前 言本标准按照GB/T 1.1 2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：陈
2、蕾、杜以军、齐静、丛晓燕、孙文博、陈智、郭立辉、于江、吴家强、李俊、时建立。DB37/ XXXXXXXXX1猪伪狂犬病病毒 gE 基因 PCR 检测技术1 范围本标准规定了猪伪狂犬病病毒（PRV）gE基因PCR检测技术的操作要求。本标准适用于PRV的实验室诊断、监测和流行病学调查等。2 实验室生物安全要求实验室必须为生物安全级（BSL-2级）及以上实验室。3 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法。GB 19489
3、 实验室生物安全通用要求。GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫。4 术语与定义下列术语与定义适用于本标准。4.1 PCR聚合酶链式反应。4.2 SDS十二烷基硫酸钠。5 仪器设备和试剂5.1 仪器设备5.1.1 微量移液器（最大量程分别为 10 L、20 L、100 L、1000 L），带滤芯的枪头。5.1.2 20000 r/min 低温高速离心机。5.1.3 电热恒温水槽。5.1.4 稳流稳压电泳仪。5.1.5 水平电泳槽。DB37/ XXXXXXXXX25.1.6 凝胶成像系统。5.1.7 紫外透射反射分析仪。5.1.8 电磁炉。5.1.9 烧杯（1000 mL）。5.1.
4、10 电子天平 精度为：0.001 g。5.1.11 PCR 扩增仪。5.1.12 组织匀浆器或研钵。5.1.13 -20 冰柜。5.1.14 2 8 冰箱。5.2 试剂除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯。5.2.1 蛋白酶 K（见附录 A.1）。5.2.2 10 %SDS 液（见附录 A.2）。5.2.3 70%乙醇（见附录 A.3）。5.2.4 1.0%琼脂糖凝胶（见附录 A.4）。5.2.5 DNA Marker 2000。5.2.6 超纯水：符合 GB/T 6682，三级。5.2.7 引物：PRV-Fwd：5-CTGGCTCTGCGTGCTGTG-3；PRV-Rev：5-GGTCCA
5、TTCGTCACTTCCG-3；扩增片段长度348 bp。6 操作程序6.1 样品的采集和处理6.1.1 样品的采集临床上猪的脑组织、淋巴结等，置于-20 冰柜或液氮中保存。6.1.2 样品的处理6.1.2.1 取猪的脑组织、淋巴结等约 5 g 于研钵中，用剪刀剪碎，加入 2 mL PBS 缓冲液，研磨。6.1.2.2 阳性对照处理：含有 PRV gE 基因的 DNA。6.1.2.3 阴性对照处理：灭菌双蒸水。6.2 DNA 的提取用蛋白酶K裂解法提取总DNA。6.2.1 取研磨液 500 L 于 1.5 mL 离心管中，加入 50 g/mL 的蛋白酶 K 5 L，加入 10%的 SDS 溶液
6、 25 L，55 水浴 2 h3 h。6.2.2 加入 200 L Tris 饱和酚，充分混匀，10000 g 离心 15 min。6.2.3 取上清于一新的离心管中，加入 200 L Tris 饱和酚和 200 L 氯仿，10000 g 离心 15 min。6.2.4 取上清于一新离心管中，加入 200 L 氯仿，10000 g 离心 15 min。6.2.5 取上清于一新离心管中，加入 2 倍体积的无水乙醇，-20 静置 20 min，10000 g 离心 15 min，弃上清。6.2.6 加入 70 %的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。DB37/ XXXXXXXXX36.2.7 加
7、入 100 L 灭菌双蒸水溶解沉淀，-20 保存备用。试验中同时设立含有PRV gE基因的DNA作为阳性对照和灭菌双蒸水作为阴性对照。6.3 PCRPCR为50 L体系，按表1中17的循序配制。表 1 PCR 反应体系（50L）序号 体系组成 体系含量1 灭菌双蒸水 37.5 L2 DNA 4 L3 10 mmol/L上游引物 0.5 L4 10 mmol/L下游引物 0.5 L5 10PCR Buffer 5 L6 2.5 mmol/L dNTPs 2 L7 Taq酶 0.5 L首先加入双蒸灭菌水，然后按顺序逐一加入上述成分，每次要加入到液面下。全部加完后，混悬，瞬时离心，使液体都沉降到PC
8、R管底。循环参数为95 5 min，94 30 s，60 45 s，72 1 min，循环30次，72 延伸10 min结束。6.4 电泳6.4.1 制备 1.0 %琼脂糖凝胶板，见附录 A.4。6.4.2 取 5 L PCR 产物与 0.5 L 加样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。6.4.3 加入分子量标准。6.4.4 盖好电泳仪，插好电极，5 V/cm 电压电泳，30 min40 min。6.4.5 用凝胶成像仪观察、扫描图片存档。6.4.6 用分子量标准比较判断 PCR 片段大小。7 结果判定7.1 在阳性对照出现 348 bp 扩增带、阴性对照无此扩增带时，实验结果成立（参见附
9、录 A.5）。7.2 被检样品出现 348 bp 扩增带判定为伪狂犬病病毒 gE 基因阳性，未出现相应扩增带的样品判定为伪狂犬病病毒 gE 基因阴性（参见附录 A.6）。DB37/ XXXXXXXXX4A A附 录 A（规范性附录）试剂的配制A.1 蛋白酶K溶液（20 mg/mL）试剂名称 用量蛋白酶 K 100 mg灭菌双蒸水 5 mLA.2 10 %十二烷基硫酸钠（SDS溶液，pH7.2）试剂名称 用量十二烷基硫酸钠 10 g灭菌双蒸水 80 mL浓盐酸 调 pH 至 7.2灭菌双蒸水 加至 100 mLA.3 70 %乙醇试剂名称 用量无水乙醇 70 mL灭菌双蒸水 30 mLA.4 1.0 %琼脂糖凝胶试剂名称 用量琼脂糖 0.6 g0.5TBE 缓冲液 60 mLA.5 对照试验PCR 结果DB37/ XXXXXXXXX51：DNA Marker DL2000；2：阴性对照；3：阳性对照。A.6 检测样品PCR结果1：DNA Marker DL2000；2，4：PRV gE基因阴性样品；3：PRV gE基因阳性样品。_
