1、ICS 67.120B 45DB 37山 东 省 地 方 标 准DB 37/T XXXXXXXXX氟喹诺酮类药物可溶性粉中非法添加物利巴韦林的测定高效液相色谱-串联质谱法Determination of Ribavirin adulteration in Fluoroquinolones powder by HPLC-MS/MSXXXX-XX-XX 发布 XXXX-XX-XX 实施山 东 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB37/ XXXXXXXXXI前 言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局管理并提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。
2、本标准起草单位：山东省兽药质量检验所。本标准主要起草人：高迎春、魏秀丽、陈玲、张传津、张呈军、杨林、薄永恒、陆庆泉、陈志强、崔山。DB37/ XXXXXXXXX1氟喹诺酮类药物可溶性粉中非法添加物利巴韦林的测定高效液相色谱-串联质谱法1 范围本标准规定了氟喹诺酮类药物可溶性粉中非法添加物利巴韦林的高效液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）测定方法。本标准适用于氟喹诺酮类药物可溶性粉（10 %乳酸环丙沙星可溶性粉、10 %恩诺沙星粉、5 %盐酸沙拉沙星可溶性粉）中非法添加物利巴韦林的测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡
3、是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。3 原理氟喹诺酮类药物可溶性粉中非法添加的利巴韦林以甲醇-乙腈（1+1）提取稀释后，取上清液经高效液相色谱分离，用串联质谱检测，外标法定量。4 试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂，水符合GB/T 6682一级水的规定。4.1 甲醇（CH 3OH）：色谱纯。4.2 甲酸（HCOOH）：色谱纯。4.3 乙腈（CH 3CN）: 色谱纯。4.4 乙酸铵(CH 3COONH4)。4.5 甲醇-乙腈（1+1）：准确量取甲醇（4.1）100 mL，加入乙腈（4.3）100 mL，混匀，备
4、用。4.6 流动相流动相A: 准确量取甲酸（4.2）1.0 mL，加乙腈（4.3）稀释至1000 mL，过0.22 m有机系微孔滤膜，现用现配。流动相B：称取乙酸铵（4.4）0.7708 g，加水100 mL，加入甲酸（4.2）1.0 mL，用水稀释至1000 mL，过0.22 m水系微孔滤膜，现用现配。4.7 利巴韦林对照品：纯度96.0 %。4.8 利巴韦林对照品储备液：精密称取利巴韦林对照品 10 mg，加乙腈溶解并定容至 100 mL，制成100 g/mL 的溶液，作为对照品储备液，-18冰箱保存,有效期 3 个月。4.9 利巴韦林对照品中间工作液：准确量取 0.2 mL 上述储备液（
5、4.8），加初始比例流动相并定容至100 mL，为 200 ng/mL 的对照中间工作液，4冰箱保存，有效期 1 周。DB37/ XXXXXXXXX25 仪器设备5.1 高效液相色谱串联质谱仪，配电喷雾离子源(ESI)。5.2 天平：感量 0.001 g，感量 0.00001 g。5.3 振荡器。5.4 离心机（5000 r/min）。6 试验步骤6.1 阴性空白样品经检测不含利巴韦林的氟喹诺酮类药物可溶性粉。6.2 提取称取阴性空白样品、供试试样各0.2g(准确到0.0001g)分别置于50 mL离心管中，准确加入甲醇-乙腈（4.5）20 mL，振荡10 min，5000 r/min离心10
6、min，准确量取0.5 mL上清液，用初始流动相定容至100 mL容量瓶，摇匀，从中准确量取0.5 mL，用初始流动相定容至20 mL容量瓶，摇匀，用滤膜（0.22 m）滤过，滤液待测。6.3 仪器参考条件6.3.1 高效液相色谱参考条件色谱柱：氨基色谱柱(100 mm2.1 mm,1.7 m)，填料基于亚乙基桥杂化颗粒的三键键合酰胺基。或性能相当者； 流速：0.25 mL/min；柱温：35；进样量：2 L。 液相色谱梯度洗脱程序见表1。表 1 液相色谱梯度洗脱程序时间/min A/% B/%0 80 201 80 202 10 902.5 20 802.8 80 203.5 80 206.
7、3.2 质谱参考条件电喷雾离子源，正离子扫描（ESI+）；扫描模式：多反应监测（MRM）；离子源温度：150；脱溶剂温度：500；DB37/ XXXXXXXXX3脱溶剂氮气流速：1000 L/hr；毛细管电压：3 kV；测试药物定性、定量离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量见表2。表 2 定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量药物 定量离子对 定性离子对 锥孔电压/V 碰撞能量/eV 保留时间/min利巴韦林（Ribavirin） 245.4113.4 245.4113.4245.496.238381026 2.246.4 测定6.4.1 标准曲线的配制准确吸取对照品中间工作液(4.9) 0.
8、1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL分别置20 mL容量瓶中，用初始流动相定容，配制成浓度为1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50ng/mL对照溶液，供高效液相色谱-串联质谱测定。以对照溶液中利巴韦林峰面积为纵坐标，对照溶液中相应利巴韦林的浓度为横坐标，绘制标准曲线。6.4.2 定性测定通过试样色谱图的的特征离子与对照溶液各色谱峰的特征离子相对照定性。试样与对照品保留时间的相对偏差不大于2.5 %；试样特征离子的相对离子丰度与对照溶液的相对离子丰度一致，相对离子丰度偏差不超过表3 的规定，则可判断试样中
9、添加了利巴韦林。典型的利巴韦林对照溶液特征离子质量色谱图参见附录图A1。表 3 离子丰度比的允许偏差范围相对丰度（%） 允许偏差（%）50 202050 251020 3010 506.4.3 定量测定取对照溶液、试样溶液上机测定，以峰面积按外标法采用单点或多点定量。在上述色谱-质谱条件下，典型的利巴韦林对照品溶液特征离子的质量色谱图参见附录A。7 试验数据处理 利巴韦林的含量按下列公式计算：.(1)fmAVCXS式中：X供试试样中利巴韦林的含量，单位为毫克每克（mg/g） ；DB37/ XXXXXXXXX4Cs对照品溶液中利巴韦林浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL） ； V供试试样稀释体积，
10、单位为毫升（mL） ；A试样溶液中利巴韦林峰面积；As标准溶液中利巴韦林峰面积；m供试试样的质量，单位为克（g） 。计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。f=1000000 V=1600008 检测方法的灵敏度、准确度和精密度8.1 灵敏度本方法检出限为 0.5 mg/g，定量限为 2 mg/g。8.2 准确度本方法在 2 mg/g、40 mg/g、50 mg/g、60 mg/g 添加浓度水平上的回收率在 80 %120 %之间。8.3 精密度本方法在重复性测定条件下相对偏差15 %。DB37/ XXXXXXXXX5A A附 录 A（资料性附录）利巴韦
11、林特征离子质量色谱图利巴韦林对照溶液特征离子质量色谱图见图A1。Time1.601.651.701.751.801.851.901.952.02.052.102.152.02.52.302.352.402.452.502.52.60%10.61.651.701.751.801.851.901.952.02.052.102.152.02.52.302.352.402.452.502.52.60%010li-25 Sm (Mn, 1x3) MR of2 Chanels ES+ 245.13.6 (ibwiln)2.516Area2.4;380li-25 Sm (Mn, x3) MR of Chanels ES+ 4.96. (ibwiln)6.05Area.4;78图 A.1 20 ng/ mL 利巴韦林对照品溶液特征离子质量色谱图_
