《基因工程原理》教案.docx

1、1基因工程原理教案（二 O 一二年修订稿）安徽大学生命科学学院2第一章 绪论重点：基因工程的概念和内容，基因工程技术在现代生物技术中的地位和作用。难点：基因工程与遗传工程的区别。（一）前言生物工程主要有基因工程、细胞工程、 酶工程、发酵工程等 4 个部分。（二）什么是基因、基因工程应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体 DNA 结 合成一具有自我复制能力的 DNA 分子（复制子、重组体），继而通过转化或 转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再 进 行扩增、提取获得大量同一 DNA 分子拷贝或其表达产物。（三）基因工程的主要内容 目的基因的制备 载体的选择和制备 DNA 分子的体外连接

2、 将外源 DNA 导入宿主 细胞 目的基因的筛选和鉴定（四）基因工程的历史及我国开展基因工程的现状第二章 基因工程的基本操作技术重点：PCR 技术和基因定点诱变技术。包括 PCR 技术的原理，反向 PCR 与染色体步移，不对称 PCR 与 DNA 序列测定，PCR 与 RAPD，RT-PCR 与 RNA 分析；基因定点诱变的原理，盒式诱变，寡核苷酸引物 诱变和 PCR 诱变。难点：酶学测序的原理和程序，基因化学合成的原理和程序。3（一）凝胶电泳技术在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以 DNA 和 RNA 实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions ）。将 DNA、RNA 放到电

3、场 中，它就会由负极正极移动。 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 脉冲场凝胶电泳 RNA 电泳（二）细菌转化技术 转化作用就是一种基因型细胞（感受态细菌）从周围介质中吸收来自另一种基因型细胞的 DNA, 进而使原来细胞的遗传基因和 遗传性发生相应变化的现象。 提供转化 DNA 的菌株叫做供体菌株，而接受 转 化 DNA 的寄主菌株则称做受体菌株。常见转化方法有原生质体转化法；化学转化法； 电穿孔法（三）核酸杂交技术 所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链 DNA 或 RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。 Southern blot；Northern b

4、lotting；斑点印迹杂交和狭线印迹杂交；菌落原位杂交注意比较核 酸 分 子 杂 交 法 的 技 术 路 线 比 较菌 落 原 位 杂 交菌 落 或 噬 菌 斑 转 印到 膜 上 抽 提 DNA/RNA 提 取 DNA 提 取 RNA裂 解 细 菌 或 噬 菌 斑 变 性 核 酸 样 品 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳变 性 DNA 将 核 酸 点 加 到 膜 上 将 凝 胶 上 核 酸 条 带 转 移 到 膜上 ， 同 时 变 性将 核 酸 固 定 在 膜 上 预 杂 交 （ 消 除 非 特 异 吸 附 位 点 ） 加 入核 素 标 记 探 针 进 行 杂 交 漂 洗 膜 （ 洗 去 非 特

5、异 结 合 探 针 ） 放 射 自 显 影 或 显 色 反 应 示 踪斑 点 杂 交 Southern印 迹 Northern印 迹4（四）DNA 序列分析技术（四）DNA 测序分析 DNA 链末端合成终止法：DNA 聚合酶能够用单链 DNA 作为模板，合成准确的 DNA 互补链 ； 该酶 能够用 2，3-双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的 3-末端，从而终止其延伸反应 。在 DNA 测序反应中，加入模板 DNA，引物（特异性引物，如 T7，T3，M13 等），DNA 聚合酶，dA， dT，dG，dC和一种 ddNTP。常用 Klenow 大片段，无 53外切 酶活性。Maxa

6、m-Gilbert 化学修饰法( 哈佛大学) ：该方法的基本原理是用化学 试剂处理具有末端放射性标记的 DNA 片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的 DNA 链降解 产物， 经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测 DNA 片段的核苷酸序列。DNA 杂交测序法(SBH-Sequencing by hybridization)：如果一段较短的 DNA探针能与较长的 DNA 片段 杂交，并形成完全的双 链结 构，我 们就推测在靶DNA 上存在着相应的互补 序列， 这就是 DNA 杂交测序法的基本原理。用一组已知系列的寡核苷酸短序列做为探针，同某一 较长的靶 DNA 分子杂交，从

7、而5测定其序列。（五）基因的化学合成（六）PCR 技术 PCR 反应体系的设立 PCR 反应程序设计 引物设计原理 PCR 技术应用（七）基因定点诱变技术使已克隆基因或 DNA 片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变 ，是基因工程和蛋白 质工程的重要手段。 盒式诱变（cassette mutagenesis）包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。 寡核苷酸引物诱变 应用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段做引物，进行 DNA 复制，使寡核苷酸引物成为新合成的 DNA 子链的一个部分 PCR 诱变：重组 PCR 定点诱变、大引物诱变（八）DNA 与蛋白质

8、相互作用 凝胶阻滞实验（Gel retardation assay），又称 DNA 迁移率变化试验（DNA mobility shift assay，DMSA）：DNA 与蛋白质结 合后分子量变大，改变了迁移率，由此判断 DNA 是否与蛋白质发生结合 DNaseI 印迹试验（DNaseI foot printing） 用于检测与蛋白 结合的 DNA 序列的部位及特性，形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定 DNA 片段之间的结合区域。 甲基化干扰实验：根据 DMS（硫酸二甲酯）能够使 G 残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的 G 残基这一原理。这种技术可以检测靶 DNA 中特异 G 残

9、基的优先甲基化对6于此后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加 详细 地揭示 DNA 与蛋白质之间相互作用的模式。DMS 化学干扰的主要局限性时，它只能使 G 残基甲基化，但仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以 鉴定足迹区段中 DNA 与蛋白质相互作用的精确位置。第三章 基因工程的工具酶重点：限制性内切酶、DNA 连 接酶和 DNA 聚合酶的生化特征、作用原理和应用领域。包括 型限制性内切酶，T4 DNA 连接 酶，大 肠杆菌 DNA 连接酶，大肠杆菌 DNA 聚合酶 I，Klenow 酶，T4 DNA 聚合酶，T7 DNA 聚合 酶，反 转录酶，Taq DNA 聚合 酶，Pfu D

10、NA 聚合酶和反转录酶。T4 多核苷酸激酶、碱性磷酸酶 和末端转移酶的作用原理和应用领域。难点：切口转移与核苷酸标记技术（一）限制性内切酶和甲基化酶 在 DNA 双链的特异性识别序列部位，切割 DNA 分子， 产生链的断裂。两个 单链断裂部位在 DNA 分子上的分布，通常不是彼此直接相 对的因此，断裂的结果形成的 DNA 片断，也往往具有互补的单链延伸末端。（二）DNA 连接酶 能够将 DNA 链上彼此相邻的 3-羟基（OH）和 5-磷酸基 团（-P），在 NAD+或 ATP 供能的作用下，形成磷酸二酯键。 只能连接切口（nick），不能连接缺口（gap）。而且被连接的 DNA 链必需是双螺旋

11、 DNA分子的一部分。（三）DNA 聚合酶1、E.coli Pol I 的特点（1）具两种外切酶活性和 DNA 聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具 53外切酶活性，大片段具 35外切酶活性和聚合酶活性（大片段亦称为 Klenow 片段）。（2）聚合酶活性53, 要求 3-OH 引物和模板 DNA，其延续性受反应条件的影响2、Klenow 片段由大肠杆菌 DNA 聚合酶经枯草杆菌蛋白酶的处理之后，产生出来的大片段分子。仍具有53的聚合酶活性和 35 的外切酶活性，失去了全酶的 53外切酶活性。 3、T4DNA 聚合酶7从 T4 噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化

12、出的一种特殊的 DNA 聚合酶，具有 53的聚合酶活性和 35外切酶活性。53聚合酶活性， 1500 nt/min, 为 Pol I 的两倍35外切酶活性，可作用于 ss DNA 和 ds DNA，其切除速度分别为 40 和 4000nt/min4、反转录酶 许多 RNA 肿瘤病毒中分离到这种酶，最常用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒的反转录酶（AMV ） AMV 具有 链和 链； 链具有聚合酶活性和 RNase H 活性； 链具有以 RNA-DNA杂交分子为底物的 53脱氧核酸外切酶活性5、T7DNA 聚合酶 1978 年，S. Tabor 从感染了 T7 噬菌体的大肠杆菌寄主 细胞中纯化出来

13、的一种聚合酶。 加工形式的 T7 DNA 聚合酶系：T7 噬菌体编码的基因 5 蛋白质，另一种是大肠杆菌编码的硫氧还蛋白。 基因 5 蛋白质：具有聚合 酶活性和 35外切酶活性；硫氧还蛋白：增强基因 5 蛋白质与模板引物的结合力 具有 53的聚合酶活性和很高的单链及双链的 3 5核酸外切酶活性。（四）DNA 和 RNA 修饰酶1、末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase），从小牛胸腺中 纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质，在二甲 胂酸缓冲液中，能催化脱氧核苷三磷酸进行 53方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷

14、酸分子加到线性 DNA 分子的 3-OH 末端。2、T4 多核苷酸激酶 由 T4 噬菌体的 pseT 基因 编码的一种蛋白质，最初从 T4 噬菌体感染的 E. coli 中分离出来。作用：催化 -磷酸从 ATP 分子转移给 DNA 或者 RNA 的末端，不受底物分子链的长短限制。3、来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase BAP）或小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase CIP）， 用于脱去 DNA（RNA）5末端的磷酸基 团，使 5-P 成为 5-OH，该过程称核酸分子的脱磷8酸作用。当需要 5端同位素标记 或为

15、了避免 DNA 片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。（五）核酸外切酶第四章 原核生物基因工程的载体 重点：大肠杆菌质粒载体，包括 pBR322 和 pUC18/19 载体构建原理和应用领域， 蓝/白筛选，质粒 DNA 的制备和纯化； 噬菌体 载体，包括 gt10/11 和 EMBL3/4 载体构建原理和应用领域， 重组噬菌体的 筛选；M13 噬菌体载体， M13mp18/19 构建原理和应用领域，单链 DNA 的制备；粘粒载体 pJB8 构建原理和 应用领域。难点： 重组 DNA 的转移和筛选（一）质粒质粒是细菌细胞内携带的染色体外的 DNA 分子，是共价 闭合的环状 DNA 分子（co

16、valent closed circular，DNA cccDNA)，大小在 1200kb，能独立进行复制。1、氯化铯密度梯度离心 质粒 DNA 占总 DNA 的 1%2%； 在细胞裂解及 DNA 分离过程中，大分子量的 细菌染色体易断裂成线性片断，而质粒DNA 分子量小， 结构紧密仍保持完整的状 态； 染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到 DNA 链的碱基中，导致链的解旋；而且形成的 EB-DNA 复合物中，EB 含量越高，密度会越低。2、碱变性法 根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。 在 pH 值 12.012.5 范围内时，线性的 DNA

17、 会被变性而共价闭合环状质粒 DNA 却不会sDNA ds DNA大 肠 杆 菌 外 切 酶 （ exo ） 大 肠 杆 菌 外 切 酶 （ exo ）大 肠 杆 菌 外 切 酶 （ exo ） 噬 菌 体 核 酸 外 切 酶 （ exo）T7噬 菌 体 基 因 6核 酸 外 切 酶9被变性。 通过冷却或恢复中性 pH 值使之复性， 线性染色体形成网状 结构，而 cccDNA 可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体， 获得含有 cccDNA 的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒 DNA3、质粒载体必须具备的基本条件 具有复制起点自我增殖的基本条件，一般具一个复制子。协助维持细胞内含有 1020

18、 个左右的质粒拷贝 具有抗菌素抗性 理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。以便为寄主 细胞提供易于检测的表型性状做为选择信号，而且在有关的限制 酶位点上插入外源 DNA 后形成的质粒有一个选择标记。 具有若干限制酶切单一位点（MCS）； 具有较小的分子量和较高的拷贝数。低分子量的 质粒易于操作，克隆外源片断后（不超过 15kb）仍能有效的转化给受体细胞同时低分子量的质粒 对限制酶具有多重识别位点的几率也较低；较高的拷贝数可获得大量的克隆基因（二）噬菌体载体1、 噬菌体的基因组结构（1）cos 位点 线性双链 DNA 分子两端各有一条 12nt 组成的彼此完全互补的 5突出单链 注入宿主后，粘性

19、末端互 补形成双链区，成 为 cos 位点。2、插入式载体 噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段 较大，所以一般用于 cDNA 文库或基因组文库的构建。3、 替换型载体（取代型载体）外源 DNA 取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必要的片段 ( 20 kb)高感染效率 (109 转化株/ug 载体 DNA，比 质粒高 100 倍)替换型噬菌体 是使用最广泛的载体。4、体外包装 重组体 DNA 分子的转染作用10 由于 噬菌体包装时，当 DNA 的长度短于野生型的 75%或超过 105%时，噬菌体的活性就急剧下降。因此只包装它的野生型 DNA（48KB）的 75%105%左右的，要求

20、载体 DNA 和外源 DNA 长度上限是 51kb，必需基因 为 28kb，外源极限在 23kb。（三）噬菌粒 由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。 具有质粒的复制起点、选择 性标记、多克隆位点等，方便 DNA 的操作，可在 细胞内稳定存在； 具有单链噬菌体的复制起点，在 辅助噬菌体帮助下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。（四）柯斯质粒载体（ Cosmid vector ） cosmid 载体 带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记 噬菌体用于包装的 cos 末端 载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组 DNA 导入受体

21、细胞。但它不会 产生子代噬菌体，而是以质粒 DNA 的形式存在于细胞内。（五）单链 DNA 噬菌体载体 M13、f1、fd M13 是一种含单链（+ ）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为 6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链片段， 这种单链片段在遗传学研究中主要用来测定序列（sanger 双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链 DNA 的分析等。 M13 噬菌体载体的寄主菌：由于 M13 噬菌体通过 F 因子 编码的菌毛进入宿主细胞，故只能用雄性细菌来增殖病毒。注意比较载体的特点：质 粒 噬 菌 体 柯 斯 质 粒 单 链 噬 菌 体克 隆 DNA大 片 段 *

22、+ + -构 建 基 因 组 文 库 - + + -构 建 DNA文 库 + - - -常 规 的 亚 克 隆 化 + - - -构 建 新 型 的 DNA结 构 + - - -序 列 分 析 + - - +单 链 探 针 +* - - +外 源 基 因 在 大 肠 杆 菌 中 的 表 达 + - - -11（六）人工染色体随着脉冲电泳技术的发展以及基因组研究的日益深入， 对 可插入大片段 DNA 的克隆载体人工染色体的研究取得了迅速的发展所谓人工染色体 是一类能在生物 细胞中独立“ 稳定存在和遗传的人工重组 DNA 分子” 酵母人工染色体载体（yeast artificial chromos

23、ome, YAC，1000kb）酵母染色体 DNA 自主复制顺序（ARS）酵母染色体的着丝粒顺序（CEN）酵母染色体的端粒顺序（TEL） 细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC，300kb ） 哺乳类人工染色体（MAC） P1 衍生人工染色体第五章 基因的分离、重 组和鉴定基因的克隆，实质上包含着待研究的目的基因的分离与 鉴 定两个主要内容，克隆步 骤包括四个步骤 用于基因克隆的 DNA 材料的选择，及 DNA 分子的片段化 外源 DNA 片段与载体分子的体外连接反应 将人工重组的 DNA 分子导入他们能够进行正常复制的寄主细胞的程序 对重组体

24、分子的转化子克隆进行筛选一、基因组 DNA 的片段化1、利用限制酶片段化基因组 DNA（1）鸟枪法（shotgun approch）（2）随机片段法构建基因文库时，最好采用随机片段化的 办法制备克隆片段机械切割法、限制酶局部消化法二、外源 DNA 片段同 载体分子的重 组 主要依赖于核酸内切酶与连接酶的作用， 选择外源 DNA 同载体三、重组子分子导入受体细胞的途径12 原核生物的转化与转染：常用大肠杆菌 K12 突变体菌株（丧失限制体系）四 重组子分子的选择与鉴定1、遗传检测法2、物理检测法3、菌落或噬菌斑杂交筛选法4、免疫化学检测法5、蛋白质筛选法6、转译筛选法第六章 基因克隆的策略从生物

25、有机体中克隆某一特定 DNA 片段（或基因）的实验程序1、cDNA 基因克隆（ cDNA 文库）2、基因组 DNA 克隆（DNA 文库 ）3、基因定位克隆（一）cDNA libraries 的构建（二）基因组 DNA 克隆 基因文库（gene library）：用重组 DNA 技术将某种生物细胞的总 DNA 或染色体 DNA的所有片段随机地连接在载体上，然后 转移到适当的宿主 细胞中通过细胞增殖而构成各个片段的克隆。当制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就称 为某种生物的基因文库 。mRNA isolation, purificationCheck t

26、he RNA integrityFractionate and enrich mRNASynthesis of cDNA Treatment of cDNA endsLigation to vectoreukaryotes纯 化 基 因 组 DNA基 因 组 DNA的 片 段 化（ 物 理 切 割 和 限 制 性 内 切 酶 ）prokaryotes与 载 体 连 接13（三） 克隆基因的分离1、应用核酸探针 可以将基因文库或者 cDNA 文库转移至硝酸纤维素膜后，用特异性的探针同噬菌斑或者菌落进行杂交，可以筛选 出阳性克隆2、应用差别杂交或扣除杂交法 差别杂交（differential hy

27、bridization），又称差 别筛选 (differential screening )适用于分离经特殊处理而被诱发表达的 mRNA 的 cDNA。 扣除杂交（subtractive hybridization），又叫扣除 cDNA 克隆（ subtractive cDNA cloning），通过构建扣除文库得以实现。 抑制性扣除杂交：以抑制 PCR 为基础的 DNA 扣除杂交方法3、应用 mRNA 差别显示技术（DDRT-PCR） 一般用 20 种随机引物和 12 种 3-端锚定引物组成的全部 240 组引物对 PCR 扩增后，所产生的大约 20 000 条条带，基本涵盖了在一定的 发育

28、阶段某种类型细胞中所表达的全部的 mRNA。4、cDNA 差式分析法（ RDA）5、表达序列标签法（ESTs） ESTs（Expressed Sequence tags ）是从已建好的 cDNA 库中随机取出一个克隆，从 5末端或 3末端对插入的 cDNA 片段进行一轮单向自动测序，所获得的约 60-500bp 的一段 cDNA 序列。6、基因表达系列分析法（SAGE） 分离每个转录本的特定位置的较短的单一的序列标签（约 9-14 个碱基对， Sequence Tag，ST），含有确定一个独特转录物的足够信息量。7、应用表达文库 当没有可用的核苷酸序列供作筛选基因文库的探针时，将 cDNA 克

29、隆在表达载体上，14再导入大肠杆菌寄主细胞然后通过对蛋白质产物的鉴定，分离克隆的真核目的基因。8、酵母双杂交体系 有效的分离能与已知的靶蛋白质相互作用的蛋白质的编码基因。第七章 克隆化基因在 E.coli 中表达和重组表达子的筛选重点：大肠杆菌表达载体的构建原理，pTrcHisA/B/C， pGEM-3Z/ pGEM-11Zf，pET-34/38，pBV220；外源基因在 E.coli 中的表达部位，表达蛋白质的策略，克隆化基因在宿主细胞表达的因素影响。难点：包涵体的形成机制和融合表达（一）克隆化基因表达的基本条件为了实现克隆化的真核基因在大肠杆菌中高效表达，必须满足其表达的基本要求，包括：1

30、 将克隆的真核基因插入到大肠杆菌启动子附近。最好是强启动子，这样可使克隆基因得到最大限度的转录。目前常用的强启动子有以下几种：（1）大肠杆菌 lac 操纵子的 lac 启动子；（2）大肠杆菌 trp 操纵子的 trp 启动子；（3） 噬菌体的 PL 启动子；（4）T7 噬菌体启动子。 2 克隆基因具有较强的核糖体结合位点(SD 序列)。3 克隆基因具有正确的插入取向。因 为任何基因的 DNA 分子只有一条具有编码蛋白质的功能(编码链) 。4 考虑到外源蛋白质在大肠杆菌中存在的不稳定性(易被大肠杆菌产生15的蛋白酶所降解)，最好将克隆( 小) 基因置于能形成融合蛋白的基因片段之后。（二）适用于原核细胞表达的载体（三）如何提高克隆化基因的表达水平克隆化基因在宿主细胞的表达量受多种因素的影响，主要有（1）启动子的强度， （2）DNA 转录起始序列， （3）密码子的使用习惯， （4）mRNA 分子的二级结构， （5）转录的终止， （6）表达 质粒的拷 贝 数及其稳定性， （7）宿主 细胞的生理状态等。（四）表达子的筛选鉴定第八章 基因工程技术应用实例 介绍教学团队的科研成果，帮助同学系统归纳基因工程技术，培养同学的科研思路。