1、基因编辑技术,1、诞生背景2、定义与原理3、发展历程4、研究方向5、应用前景与价值,1,1. 诞生背景,全基因组测序技术的不断发展和完善+大型基因组注释项目的实现,基因革命（转化医学、精准医疗）,2,将大量数据转化为功能和临床相关知识,需要有高效、可靠的方法确定基因型如何影响表型,同源重组优点：定向失活，准确。缺点：插入目标位点的效率低 筛选过程费时费力 有可能产生不利的突变效应,RNAi基因靶向抑制技术优点：快捷、廉价、高通量缺点：效果不够彻底，影响因素众多 不可预知的脱靶效应,基因编辑技术（近十年出现）:对各种细胞和各种生物体内的几乎任意基因进行人工操作,2.1 基因编辑定义,基因编辑，是
2、指对DNA核苷酸序列进行定点修饰（删除和插入等操作）的一项技术，该技术可精确剪断靶DNA片段并插入新的基因片段，既可模拟基因的自然突变，又能修改、编辑原有基因组，真正实现“编辑基因”。,3,2.2基因编辑原理,（一）DNA修复系统主要通过两种途径修复DNA双链断裂,即非同源末端连接（Nonhomologous end joining, NHEJ）和同源重组（homologous recombination, HR）。 通过这两种修复途径，基因组编辑技术可以实现三种基因组改造的目的，即基因敲除，特异突变的引入和定点转基因。,4,5,1）基因敲除：如果想使某个基因的功能丧失，可以在这个基因上产生D
3、SB，NHEJ修复的过程中往往会产生DNA的插入或删除（indel），造成移码突变，从而实现基因敲除。2）特异突变引入：如果想把某个特异的突变引入到基因组上，需要通过同源重组来实现，这时候要提供一个含有特异突变同源模版。正常情况下同源重组效率非常低，而在这个位点产生DSB会极大的提高重组效率，从而实现特异突变的引入。3）定点转基因：与特异突变引入的原理一样，在同源模版中间加入一个转基因，这个转基因在DSB修复过程中会被拷贝到基因组中，从而实现定点转基因。,2.2基因编辑原理,6,（二）人工构建或寻找一个内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生
4、突变，从而达到定点改造基因组的目的，如锌指蛋白（ZNF）、类转录激活因子（TALEN）、Cas蛋白等。所有基因编辑系统关键组成部分：1、DNA识别域2、核酸内切酶,3、发展历程,7,第一代：锌指核酸内切酶（zinc finger endonuclease, ZFN )，可将锌指蛋白与核酸内切酶Fok I融合形成的核酸内切酶，利用它可以在各种复杂基因组的特定位置制造DNA的双链切口。,DNA识别域：由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般34个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。核酸内切酶： 非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA
5、。,TALEN,第二代：类转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease, TALEN)， TALEN可以和ZFN一样可对复杂的基因组进行精细的修饰，同时其构建较为简单，特异性更高，因此受到了科研工作者的青睐。,8,DNA结合结构域：TALE蛋白是由一连串3335个氨基酸组成的重复结构域组成的，其中每一个结构域都能够识别一对碱基该区域主要由两个高度可变的氨基酸决定，被称作重复可变双氨基酸残基位点（repeat-variabledi-residues,RVD）。与锌指结构域一样，这种TALE重复模块也能够串联起来，识别一长串
6、的DNA序列。核酸内切酶： 非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA,全长为34aa的Tal 蛋白的第12、13位氨基残基可以特异性识别核苷酸碱基。 NG可以识别T HD可以识别C NI可以识别A NN可以识别G或A通过这种特异性识别，将多个Tal蛋白组装在一起，再加上Fok I核酸内切酶，就可以构成可以识别目的片段的Tale蛋白。,TALEN原理,9,TALEN的特异性打靶的原理：一对可以特异性识别靶基因的TALE，定位到需要编辑的基因组区域；然后非特异性核酸内切酶FokI切断双链DNA从而造成DNA双链断裂（double-strand break，DSB）；再通过DNA的自我
7、修复，引起碱基的缺失或突变，从而引起基因突变。FokI只有在形成二聚体的时候才有内切酶活性。,TALEN原理,10,TALEN介导的基因编辑,TALEN质粒对共转入细胞后，表达两个融合蛋白，分别与靶位点特异结合，由于两个TALEN融合蛋白中的Fok I临近，形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA。 形成DSB时，同源重组可将需要敲入的序列组合入基因组。,11,CRISPR-Cas9,12,第三代：规律间隔成簇短回文重复序列-Cas蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/C
8、RISPR-associated(Cas)9)，是在细菌和古细菌中发现的，基于细菌获得性免疫系统改造而成，CRISPR序列能特异性识别外源核酸序列；Cas蛋白的非特异性核酸内切酶功能将外源核酸切断。,George Church,13,DNA识别域：向导RNA，由两部分组成：CRISPR RNA (crRNA)和反式作用CRISPR RNA(transacting CRISPR RNA, tracrRNA) ，crRNA一端与双链核苷酸互补结合，另一端与tracrRNA互补结合，形成向导RNA。核酸内切酶： Cas9核酸内切酶,14,Cas9蛋白与向导RNA结合、组装的动作是这套位点特异性的基因
9、组修饰过程里的限速步骤。CRISPR-Cas系统靶向要求为PAM序列（5-NGG-3），即靶序列后面必须为NGG才能被向导RNA识别，在人类基因组中平均每8个碱基就可以出现一个NGG。,研究方向,15,不足：ZNF和TALEN成本高昂、效率不高 CRISPR-Cas系统脱靶效应、安全性改进： a. 优化sgRNA结构可提高基因编辑效率、解决脱 靶问题 b. 新系统开发：一种靶向作用于RNA而不是DNA的新型CRISPR系统、可实现多重编辑。 c. 拓宽应用邻域：动植物学 d. 升级换代：NgAgo（第四代？）、SGN,利用TALEN技术将TCR基因和CD52敲除后杀伤癌细胞，挽救淋巴癌晚期小女孩的生命（2015）,基因编辑的应用与价值,16,利用基因编辑技术，从多靶点高效剔除了一种人源化小鼠多个器官组织中的艾滋病病毒（2017）。,用基因编辑后克隆培育出世界首批对器官移植而言“无毒”的小猪（2017）,基因编辑“热”,17,2017年基因编辑市场专题调研分析报告：,https:/
