1、第4 章 基因组的变异与DNA损失修复,1,2,4.1 基因组的变异与稳定性维持（基因突变）4.2 DNA损伤4.3 DNA损伤修复的机制,3,4.1. 基因组的变异与稳定性维持,4,突变：是遗传物质发生了可遗传的改变，而这种改变可发生在染色体水平和基因水平上。,4.1.1 基因突变的种类,染色体结构和数目变异(染色体畸变)(广义突变),DNA水平的突变，基因突变（点突变）（狭义突变）,突变类型：分为点突变和插入与缺失突变。,5, 按突变对密码子的改变类型,4.1.1 基因突变的种类,错义突变：无义突变：同义突变：,DNA突变引起mRNA密码子变为另一个氨基酸密码。,DNA突变引起mRNA密码
2、子变为一种终止密码。,DNA突变虽引起mRNA密码子变为另一种密码，但由于密码子的简并性，未使编码的氨基酸发生改变。,6, 插入或缺失不等于3的倍数的核苷酸，引起 读码框架的改变。叫移码突变。,=3d Nt aa, 3d Nt 移码突变,7,4.1.2 单核苷酸多态性（SNP）,SNP 是由单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性。,8,在人类基因组中，存在0.1%的SNP位点，是形成个体差异的主要原因。90%的人类群体变异都是SNP。,一般SNP引起的突变是中性的。但是，人类镰刀形细胞贫血病，GAG（谷氨酸） GTG（缬氨酸）。,4.1.3 拷贝数变异,拷贝数变异 人类或其他哺乳类基因组中，不
3、同大小的DNA片段拷贝数突变，这些拷贝的删除、插入、复制和复合多位点的变异，统称拷贝数变异。其突变率高于SNP。,9,拷贝数变异可以遗传，引起基因活性变化。例如，吃粮食的人比吃肉的人Amy1基因拷贝数更多。-突触核蛋白基因拷贝数增加2-3倍，导致帕金森综合症。淀粉样前体蛋白基因拷贝数增加，导致老年性痴呆症。,4.1.4 定点突变,定点突变 为了获得所需的蛋白质，按照预先设计对基因的编码区和控制区进行缺失、插入或碱基替换。,10,Kunkel 定点突变法,突变引物,4.1.5 基因动态突变,基因动态突变 也叫基因组不稳定性，是以DNA重组序列拷贝数在传递不稳定为特征的一类突变，能引起基因长度改变
4、。,11,三核苷酸重复拷贝数在正常情况下有一定的变异范围，而扩展时就表现为疾病，这种突变不稳定，其拷贝数与病情正相关。例如 ，亨廷顿舞蹈症 HD为（CAG）n 扩增；而Sca10基因内第9内含子的（ATTCT）n 扩增超过4000次时发病（正常人n仅10到20）。,4.2 突 变 发 生 的 机 理 (自发突变，诱发突变),12,2014年诺贝尔生理学或医学奖,约翰奥基夫,梅布里特,爱德华莫泽,“发现大脑定位系统细胞”,一、 基因的自发突变,自发突变：特指在DNA复制过程中，由于细胞内碱基异构体替代正常结构的碱基掺入到DNA分子中，引起的复制的错误，或由于重复序列间的不对称交换形成的突变。,1
5、4,1. 碱基异构式引起DNA复制过程的错误,a) 碱基异构式,C4 (a) C (i),G (k) G (e 和 i),15,(amino),(imino),(keto),(enol),16,T嘧啶环,G嘌呤环,A嘌呤环,1,2,3,4,5,6,1,2,3,4,5,6,1,2,3,4,5,6,17,b) 碱基异构式引起DNA复制的错配,18,19,A(i)反式=A（a）顺式,G(e,i)反式=G（k）顺式,A(i)反式=G（k）顺式,G(e,i)反式=A（a）顺式,碱基异构式引起DNA复制的错配,20,C(i),C (a, 反式),c) 碱基异构式引起DNA的错配突变,C(i),C(a),G
6、 (k, 顺式),G (k, 顺式),G (k, 反式),G(k),A/T G/C,A/T G/C,d) 增变基因,“被冤枉的基因”,增变基因类别,修复过程是基因突变的重要来源,诱变类型 物理诱变 化学诱变,二、基因的诱发突变,24,1. 物理诱变,a) 电离辐射诱变,Co60 ()( ) 射线 Cs137() () 射线 H3 () 射线 P32，S35() 射线,() ( ) 射线穿透性 （外照射处理） () () 射线非穿透性 （内标记处理）,dNt电荷及碱基结构改变,25,微重力高辐射强射线,26,b) 非电离辐射紫外线 (U.V),共价键,27,光解作用,氨式胞嘧啶,亚氨式胞嘧啶,脱
7、嘌呤,28,C/G,A/T,2. 化学诱变,a) 抑制碱基合成的化学诱变剂,29,酮式,烯醇式,30,A/T,G/C,BrU(e) G,BrU(k) T,31,(k),HNO2 (亚硝酸 NA),修饰碱基结构的诱变剂,A次黄嘌呤=C,CU=A,G黄嘌呤,32,修饰碱基结构的诱变剂,NH2OH（羟胺）,羟胺胞嘧啶,33,G/C A/T,烷化剂:烷基转移到碱基上，发生烷基化，导致碱基配对方式改变，产生脱嘌呤作用或使DNA分子交联。,34,d) 插入诱变剂,-ATTTTTCG -TAAAAAGC-,-AT EB TTTTCG-TA,分子插入,X,AAAAGC-,移码突变,35,4.3. 生物体保证稳
8、定遗传的机制,36,DNA水平的修复和校正机制主要有复制过程中的错配修复、DNA损伤修复、基因的回复突变等。,一、 复制过程中的错配修复机制 (错误率= 10-11),DNApol (错误率= 10-8)经第二次校正为 10-11,错配修复系统（MRS）,38,1. 错配修复系统（ mismatch repair system, MRS）,39,40,MCE 扫描,核酸内切酶,聚合酶连接酶,A,C,41,2. ung 系统 (尿嘧啶-N-糖苷酶系统),-TAGC-ATCG-,-TAGC-A CG-,U,G,C,U,A,-TAGC-A CG-,-TAGC-A,TCG-,U是T的类似物,42,二、
9、 DNA的损伤修复,1. 光修复,-TT-AA-,43,2. 切补修复,切 补 修 复,44,3. 重组修复,45,Rec-A基因以某种方式参与DNA损伤修复,46,47,Rupp.Howard-Flanders,48,49,4. SOS 修复 (U.V. 修复 或 W 修复),Jean Weigle, 80 10 100突变型 100% 50% 10%,A. E.coli 中噬菌体DNA损伤被修复了A和B. U.V.诱导 E. coli 进行SOS修复 SOS修复 (倾向差错) 产生高频率的突变,考察噬菌体基因修复（抢救）情况,50,300 X,机制,SOS受RecA和LexA调控,51,R
10、ecA,SOS,RecA 蛋白： 具有三种功能,52,当DNA复制受阻/ DNA 损伤时,能量大量消耗,53,当DNA复制度过难关后,54,突变的形成,DNA,未经修复,经过修复 / 校正,突变是在修复过程中形成的（非准确的修复）,55,三、 基因的回复突变 （back mutation）,1. 回复突变的概念,野生型,突变 (表型),2. 回复突变的分子机制,a) AGC (Ser) ACC (Thr) AGC (Ser) Nt,b) AGC (Ser) AGG (Arg) AGT (Ser) 简并,c) AGC (Ser) AGG (Arg) AAG (Lys) 功能替代 如果 Ser L
11、ys,56,d）基因内抑制的回复突变 (第二位点突变引起的基因内校正),基因内抑制导致的回复突变实际上是基因内第二位点突变后，使突变的蛋白酶的构型和活性又回复到野生型状态，从而使表型发生回复，也即在同一基因内，第二位点的突变抑制了第一位点的突变效应。,57,e.g. trp.A,回复突变,(Cys) （Gly）,-UGG 174-GGA210-,-UGG174-GGA210-,-UGC174-GAA210-,C,A,(Lys) (Glu),58,e）基因间抑制的回复突变,基因间抑制的回复突变是指某一突变体回复到野生型是第二基因发生突变后的抑制效应，后者被称为抑制基因。分类：（直接抑制和间接抑制
12、） （1）tDNA反密码子序列无义突变或错义突变 （2）代谢途径的补偿抑制 （3）异源多聚体蛋白酶的构型吻合,59,无义突变抑制,（1）野生型编码色氨酸的密码子（UGG）突变为UAG，表现突变体。,（2）诱变色氨酸的tRNA在反密码子处突变为AUC，不仅可以负载色氨酸，而且识别UAG，从而使突变型回复到野生型。,60,错义突变抑制,（1）野生型密码子GGA与反密码子CCU配对，编码甘氨酸。,（2）当GGA突变为AGA时，与携带精氨酸的tRNA反密码子UCU配对，编码精氨酸。,（3）当携带甘氨酸的tRNA反密码子CCU突变为UCU时，仍可携带甘氨酸与AGA配对，使一部分个体表现回复到野生型。,6
13、1,+ 天冬氨酸,(鸟氨酸转甲酰磷酸酶),62,Why ? & How ?,63,e.g. 脉孢菌,+天冬氨酸,(鸟氨酸转甲酰磷酸酶),64,氨甲酰磷酸,氨甲酰磷酸,代谢途径的补偿,多聚体酶类构型的吻合,回复突变,65,抑制基因,4.4. 基因重组交换的 分子机制,66,4.4.1. 自然界的DNA分子均是重组体,67,可遗传的变异：,分子克隆和转基因技术 （体外）,普遍发生自然界DNA分子 均是重组体,68,4.4.2. 遗传重组的类型,a) 同源重组,大片段的交换,重组交换具有热点,重组交换需要酶参与 (RecA，B，C),69,倒位和缺失,缺失,倒位,70,断裂与错接,b) 转座重组 (
14、复制重组),71,72,73,同源重组,1. 前期的两种假说,a) 断裂-重接假说 (1930 Darlington),74,b) 模板选择假说 (1931 Belling),75,DNA分子的交换是断裂错接的过程,C13 N15 C12 N14,E.coli,76,E.coli 生长在C12和N14的培养基，用两种噬菌体 （ABC & abc）感染,2. 同源重组的分子模式,异常分离现象 基因转换,77,杂合体,Why ?,78,基因转换,一条染色体上特定的遗传基因被同源染色体上等位基因所替代的非相互重组的现象。,79,果蝇 (ry，黄嘌呤脱氢酶),少数野生型,没有野生型,80,b) 同源重
15、组的基本特征,c) 同源重组的分子模式,1964 Holliday . R Holliday 中间体,Whitehouse 极性杂合DNA模式,81,同源重组交换发生的相关事件,1）DNA配对,2）Rec BCD酶：在两个同源单链DNA之间形成缺口,3）Rec A酶：与缺口单链结合，导致链的转移,82,Holliday 中间体模式,83,形成缺口(交换热点),交叉移动,异构体,Holliday 中间体模式,84,两种拆分结果,85,异源杂合双链内等位基因异常分离现象,86,87,交换不是简单发生在 1 bp 之间的断裂错接事件,交换涉及两条双链DNA之间的holliday中间体、 链转移、异构
16、化、拆分等一系列复杂的过程,交换发生后，交换位点的两端的会出现 亲本：重组= 1:1 的正常分离比例,结 论,88,当交换发生在某对等位基因内，其突变位点可能因 交叉移动，而被包括在杂合双链区域之内，从而引起 基因转换,基因转换发生的机率，随突变位点离DNA 交叉位点 的距离增大，表现逐渐变小的极性梯度的效应,89,交换位点?,90,d) 相关酶类及交换热点,RecA酶：,40kd 单体 2000 / 细胞,RecA酶与单链DNA结合 具有ATP酶活性,(单链DNA依赖性 ATP酶活性),91,RecA酶的结合形式,92,93,RecBCD酶:,RecBCD 复合体 300kd,重组酶BCD具
17、有产生单链尾巴的功能。产生的单链尾巴被RecA 酶包裹，同时重组酶BCD帮助将RecA酶装载到3-DNA尾上。,94,RecBCD 酶特异识别GCTGGTGGT 序列 并在其下游4-6bp处切断单链DNA,chi位点 交换热点,95,RecBCD pathway,96,97,98,RFLP 限制性片段长度的多型性,99,RFLP 限制性片段长度的多型性,Probe/a,probe/b,100,RFLP 限制性片段长度的多型性,101,基于聚合酶链式反应的多型性 (PCR-based polymorphsm),RAPDAFLPSSRDD-PCRISSRSSCP,94 ,37 ,72 ,102,R
18、APD （随机扩增的DNA多型性） (Random Amplified Polymorphism DNA),10mer 序列随机商业购买种类无限,103,AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism ),MseI : 4 bp cutter EcoRI: 6 bp cutter,104,105,AFLP （扩增片段长度的多型性）(Amplified Fragment Length Polymorphism ),106,SSR ( Simple Sequence Repeats ),107,SSR （简单序列的重复） ( Simple Sequence
19、 Repeats ),25份种质的SSR分析,随着基因组测序的发展 密度增加，定位准确 检测快速，重复性好 SSR标记将成为基因定位和MAS 的重要技术之一,108,SSCP (单链构象的多型性) (Single Strand Conformation Polymorphism),AT,GC,变性 复性,109,SSCP (单链构象的多型性) (Single Strand Conformation Polymorphism),家 猪 氟 烷 基 因 SSCP 图 谱,110,单核苷酸多型性SNP (single nucleotide polymorphism),111,突变oligo-dNt引
20、物介导的PCR诱变,每管加入2个特定引物一个与基因内某一区段互补（2，4）一个含突变碱基并与欲突变位点互补（1，3）,PCR产物混合变性、复性 转化E.coli,112,5-BrU(k),G(k),5-BrU(e),C(a),mispairing,mispairing,T(k),A(a),5-BrU(k),5-BrU(e),Replication error,Incorporation error,5-BrU(k),5-BrU(e),113,114,Apurination (de-pu),115,What is gibberellin (GA),Eiichi Kurosawa (1926): Rice foolish seedling (bakanae) disease caused by the fungus Gibberella fujikuroi,116,
