1、研究报告炭疽毒素受体 ATR cDNA 的合成和克隆及 ATR-Fc 融合蛋白的真核表达载体的构建*中国生物工程杂志 China Biotechnology, 2005, 25(12):18胡显文 1*高丽华 1 陈薇 2*徐俊杰 2 赵剑 2 陈惠鹏 1*(1 军事医学科学院生物工程研究所北京 100071)(2 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京 100071)摘要可溶性炭疽毒素受体（sATR）可以特异性结合炭疽毒素保护抗原（PA） ，为获得用于中和炭疽毒素以防治炭疽感染的候选抗毒素药物，构建了表达 ATRFc 抗体样分子融合蛋白的真核表达载体。将全长为
2、681bp 的编码炭疽毒素受体 N 端 1227 氨基酸的基因分成长约5060 碱基的 18 个寡核苷酸片段，相邻片段重叠部分为 2022 个碱基，利用重叠延伸 PCR和引物 PCR 法，将合成的片段组装与扩增，得到了含有 ATR1227 的全部编码区和 Hind III、BamH I 位点在内的 DNA 片段。回收的基因片段经 BamH I/Hind III 双酶切连接到pUC19 质粒中，挑选阳性克隆进行酶切鉴定和双向序列测定，获得了全序列正确的克隆。将 ATR 基因与 Fc 基因连接后插入 pcDNA3.1 载体多克隆位点 Hind III 和 Not I 之间，得到表达 ATRFc 融
3、合蛋白的真核表达载体 pcDNA3.1/ATRFc ，为利用 CHO 哺乳动物细胞表达ATRFc 并研究其生物学性质奠定了基础。关键词炭疽毒素受体 Fc 融合蛋白基因合成抗毒素收稿日期：20050408 修回日期：20050614*国家自然科学基金资助项目（30300016）* 通讯作者，电子信箱：， CW， ChenHP 炭疽热是严重威胁人类健康的传染性疾病，美国疾病控制与预防中心（CDC）将炭疽、鼠疫、天花等列为等级最高的传染性疾病1 ，这类传染性疾病具有传播速度快、死亡率高、易引发公众恐慌和社会混乱等特点，需要特别对待和严密监测。炭疽杆菌有以下特点：（1）繁殖速度快，炭疽孢子存活时间长，
4、在自然条件下可以存活 36年；（2）传染性强，室外施放含炭疽菌的气溶胶，即便在室内也有感染炭疽热的可能；（3）吸入性炭疽热死亡率极高，至今仍没有有效的治疗方法；（4）作为生物武器具有很强的杀伤能力。1993 年美国国会技术评估部门（OTA）估计，在美国首都华盛顿的上风口施放 100kg 的气溶胶化的炭疽孢子，将会造成 13 万人300 万人死亡，其致死性杀伤效果相当于甚至超过 1 颗氢弹的威力2 。由于炭疽杆菌的这些特点，80 年前有的国家就开始了以该菌作为生物武器的研究， “911”事件后美国又出现炭疽菌袭击，研究抵御生物恐怖袭击的新方法已成为美国政府优先资助的项目，也引起了其他各国政府的高
5、度重视。人体感染炭疽杆菌后，此菌能在体内增殖并产生致命的毒素。大多数的炭疽热致死病例是由炭疽毒素不可逆的毒性作用导致的。炭疽毒素包括：（1）保护抗原（protective antigen, PA） ，它可与哺乳动物细胞膜上的炭疽毒素受体（ anthrax toxin receptor, ATR）结合，并介导致死毒素(LeTx，PA+LF)和水肿毒素(EdTx，PA+EF)进入宿主细胞内；（2）水肿因子(EF)，它是一种腺苷酸环化酶，通过提高感染部位细胞内的环腺苷酸(cAMP)浓度而引起水肿，并可抑制噬菌作用；（3）致死因子(LF)，它是一种高度特异性的锌依赖性蛋白酶，可改变巨噬细胞产生的细胞因
6、子并诱导巨噬细胞裂解。保护抗原是炭疽毒素的核心成分，它能在细胞水平上促进炭疽感染进展。在没有保护抗原的情况下，炭疽杆菌产生的水肿因子和致死因子对人体是无害的，只有保护抗原与细胞表面的炭疽毒素受体结合形成保护抗原 受体（PAATR ）复合物，炭疽致死毒素和水肿因子在 PAATR 复合物的介导下才能进入细胞质内并产生毒性35 。因此，保护抗原在炭疽感染中起着举足轻重的作用，保护抗原自然而然成为研制预防和治疗炭疽热新药的有效靶标。2005, 25(12)胡显文 等： 炭疽毒素受体 ATR cDNA 的合成和克隆及 ATRFc 融合蛋白的真核表达载体的构建中国生物工程杂志 China Biotechn
7、ology Vol.25 No.12 2005抗体类药物的研究、开发和生产已成为生物制药行业中最重要和最为活跃的领域6,7 ，抗炭疽毒素抗体是预防和治疗炭疽感染最直接和最有效的手段之一8,9 。有许多抗保护抗原抗体（antiPA antibodies）在细胞保护实验和动物实验中都表现出明显的保护作用，并且在临床中有明显疗效。由于具有 Fc 段，抗体不仅能结合炭疽毒素 PA，并且可以由抗体 Fc 介导的生物学效应如抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应（ADCC） 、补体依赖性细胞毒效应（CDC）或免疫调理作用而杀死炭疽孢子，起到治疗的作用1014 。但是，不是所有的 antiPA 抗体都有细胞保护作用
8、，相反，如果 antiPA 抗体不是封闭 PA 与其受体 ATR结合部位，不仅不能保护细胞，反而能强化致死毒素对巨噬细胞的杀伤作用15 。PA 的可溶性受体 ATR 能够结合 PA 并阻止致死毒素对细胞产生杀伤作用16 ，但是，由于可溶性受体半衰期短，而且没有抗体分子的 Fc 段介导的对病原体产生杀伤作用的功能，因此，我们借鉴治疗类风湿关节炎的生物技术药物 Enbrel 的研究开发经验，首先设计了 ATRFc融合蛋白用于中和 PA。此融合蛋白是炭疽毒素 PA 的受体（ATR）与 Fc 的二聚体融合蛋白，理论上既具有与 PA 特异性结合的高亲和力，又含有 Fc 段，具有抗体的效应功能，还具有较长
9、的半衰期，并且由于两段基因来自人，该融合蛋白应具有较低的免疫原性。由于该融合蛋白分子量大，约 130kDa，空间结构复杂，具有多对二硫键，并且需要由两条单链通过链间二硫键形成二聚体，此外还有 6 个糖基化位点，因此，用大肠杆菌等原核表达系统无法正确表达该蛋白。本文克隆了炭疽毒素受体 ATR 基因，并且构建了表达 ATRFc 融合蛋白的真核表达载体，为在 CHO 哺乳动物细胞表达 ATRFc 奠定了基础。1 材料与方法 1.1 材料大肠杆菌 DH5（道普公司） 、pUC19 质粒（本室保存） 、pcDNA3.1 真核表达载体（Invitrogen 公司） 、源自基因组（含有内含子）的编码人免疫球
10、蛋白 IgG1 Fc 段（铰链区、CH2 区和 CH3 区）的基因（R 2： DNA Marker2.3ATR 基因的克隆与测序PCR 扩增全基因后，将回收的基因和 pUC19 质粒分别用 Hind III 和 BamH I 双酶切，连接并转化大肠杆菌 DH5，挑选菌落培养，提取质粒送博亚公司进行双向测序，结果 4 个克隆中，有 1 个序列与设计的基因序列完全一致，而另外 3 个克隆都有 1 个位点碱基缺失或突变。测序结果如图 3 所示。图 3ATR 基因测序结果Fig. 3Sequencing of ATR gene in pUC19/ATR2.4ATRFc 融合蛋白真核表达载体的构建分别用
11、 Hind III/BamH I 双酶切 pUC19/ATR 载体（含 ATR1227 基因）和pcDNA3.1/CD40Fc 载体（含 Fc 基因） ，回收目的基因连接成表达 ATRFc 融合蛋白的真核表达载体转化大肠杆菌（图 4） 。提取质粒分别用 Hind III+BamH I 和 Hind III+Not I酶切鉴定，结果表明（图 5） ，用 Hind III 和 BamH I 双酶切时，可见大小为 700bp 和6.9kb 的片段，分别与 ATR 基因和载体+Fc 基因大小一致，而用 Hind III+Not I 双酶切，可见大小为 2.2kb 和 5.4kb 的条带，分别与 ATR
12、Fc 基因和 pcDNA3.1 载体的大小一致，表明目的基因 ATRFc 正确插入了 pcDNA3.1 真核表达载体中。2.5ATRFc 基因的全序列测定将构建好的 pcDNA3.1/ATRFc 表达载体进行 ATRFc 基因的全序列测定。由于 ATRFc 基因长 2.2kb，而一般一次基因测序准确的测定长度为 400500bp，因此我们设计了 5 段测序引物测定整个基因。测定结果表明，插入 pcDNA3.1 载体 Hind III 和 Not I 位点之间的ATRFc 基因与预期的完全一致（图 6） 。在图 6 中，第图 4ATRFc 融合蛋白真核表达载体 pcDNA3.1/ATRFcFig
13、.4The eukaryotic expression vector pcDNA3.1/ATRFc for ATRFc fusion protein 图 5 重组质粒 pcDNA3.1/ATRFc 酶切鉴定Fig. 5Identification of recombinant plasmid pcDNA3.1/ATRFc by restriction digestion1: Digested by Hind III/Not I; 2: DNA marker;3: Digested by Hind III/BamH I 图 6 将编码 ATRFc 融合蛋白的基因用 Hind III 和 Not
14、I 双酶切插入 pcDNA3.1 真核表达载体中全基因测序结果Fig. 6The sequencing of the whole gene which encodes ATRFc fusion protein andwas inserted into the Hind III aa228459: Fc region; Asn*: Potential Nlinked glycosylation sites图 8ATRFc 融合蛋白的 SDSPAGE 分析Fig. 8SDSPAGE analysis of ATRFc fusion proteinLane 1: Nonreducing condit
15、ion; Lane 2: Protein marker;Lane 3: Reducing condition3 讨论我们采用人工合成的方法，成功地得到了与设计相符的编码炭疽毒素受体 ATR 胞外区 1227aa 的基因。cDNA 人工合成具有许多优点1820 ，如基因的来源不受材料限制；可以从基因水平上进行优化以提高表达水平；可以对几个基因进行剪裁或组合等。但是，在利用重叠延伸 PCR 法组装基因过程中，由于寡核苷酸片段的反复退火与连接，可能引入错误。因此，尽量减少 PCR 的次数，或者合成的基因长度较短如 400bp 以下，会有利于寡核苷酸片段的正确组装。本文合成的含酶切位点和剪切供体序列的
16、 ATR 基因长度大于700bp，如果从第一个寡核苷酸片段依次顺序组装到第 18 个片段，PCR 次数过多，容易出现错误。我们采取的策略是先组装成两个长度在 300400bp 的大片段，再通过两个大片段的互补碱基的重叠延伸，得到全长基因，减少了 PCR 次数，以减少碱基错配或缺失的几率。合成的寡核苷酸片段的长度对全基因的正确组装也有很大影响。一方面，长度太短，会增加寡核苷酸片段的数目和 PCR 的次数，导致发生错误的几率增加；另一方面，长度太长又会使合成中出现错误的几率增加，合成成本和难度极大增加。因此，合成的寡核苷酸片段的长度要综合考虑合成和组装过程中的各种因素，国外报道 5070 个核苷酸
17、长度比较适宜18 ，合成时我们选择了 5060 个寡核苷酸的长度，即可保证组装基因的质量，又大大降低了寡核苷酸合成的成本。此外，采用高保真的 Taq 酶，可以极大限度地减少 PCR 重叠延伸过程中的错误，是获得正确的全基因的关键。我们在 PCR 过程中，采用了宝生物工程有限公司的最新产品 PyrobestTM DNA Polymerase，该酶与 TaKaRa TaqTM 相比，保真性能提高了 10 倍。研究既能够与 PA 高亲和力结合，又能特异性封闭 PA 与其细胞受体结合区域的抗体类药物，是成功研制预防和治疗炭疽感染的生物技术药物的两个关键因素。而 ATRFc 融合蛋白正具备这两个特征。但
18、是由于 ATRFc 融合蛋白分子量大，约 130kDa，空间结构复杂，有 6对链内二硫键，3 对链间二硫键，并且需要将 2 条单链正确组装成同源二聚体抗体样分子，此外，抗体分子的糖基对充分发挥抗体类药物的生物学功能至关重要，ATRFc 分子具有6 个糖基化位点，这么复杂的糖蛋白，用大肠杆菌等表达系统是无法正确表达的，而必须采用 CHO 细胞等哺乳动物细胞表达系统表达。本文构建了表达 ATRFc 融合蛋白的真核表达载体，为进一步表达 ATRFc 融合蛋白和研究其生物学活性奠定了基础，并且我们首次表达了 ATRFc 融合蛋白21 ，该融合蛋白与 PA 具有很高的亲和力，在细胞保护实验中也表现出很强
19、的保护作用，培养基中 ATRFc 的浓度为 0.2mol/ml 时，受致死剂量炭疽致死毒素攻击的小鼠巨噬细胞 J774A.1 可以全部存活，值得进一步研究和开发成预防和治疗炭疽感染的生物技术药物。参考文献1 Lane H C, Montagne J L, Fauci A S. Bioterrorism: a clear and present danger. Nature Medicine， 2001, 7(12): 127112732 Inglesby T V, OToole T, Henderson D A, et al. Anthrax as a biological weapon, 2
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30、iotechnol, 2005, 21(4): 147152Chemical Synthesis and Cloning of cDNA of Anthrax Toxin Receptor (ATR)and Construction of Eukaryotic Expression Vector for ATRFc Fusion ProteinHU Xianwen1GAO Lihua1CHEN Wei2XU Junjie2ZHAO Jian2CHEN Huipeng1(1 Beijing Institute of BiotechnologyBeijing100071, China)(2 Sta
31、te Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Beijing Institute of Microbiology and EpidemiologyBeijing100071, China)AbstractSoluble anthrax toxin receptor (sATR) can bind specially and directly to protective antigen (PA), a component of anthrax toxins which plays a central role in the toxinmediate
32、d pathogenesis of anthrax infection. In order to find a candidate for the antitoxin that can neutralize and block PA, a eukaryotic vector for expression of ATRFc ，an antibodylike fusion protein, was constructed. The cDNA, encoding Nterminal amino acids 1227 of anthrax toxin receptor (ATR) and consis
33、ting of 681basepairs, was divided into 18 oligonucleotide fragments with about 5060 bases length and 2022 bases crossover. The synthetic 18 fragments were assembled and amplified by overlap extended PCR and primer PCR, and the PCR product was cloned into the BamH I and Hind III sites of pUC19 to gen
34、erate pUC19/ATR. Positive clones were selected, and the whole synthetic gene of ATR was correct, which was confirmed by DNA sequencing. The DNA fragment encoding ATRFc was inserted into the Hind III and Not I sites of pcDNA3.1(+) to generate the eukaryotic vector pcDNA3.1/ATRFc, and was the foundation for expression of ATRFc fusion protein and further investigation of the biological characterization of ATRFc.Key wordsAnthrax toxin receptorFc fusion proteinGene chemical synthesisAntitoxin
